1.11 Signaltransduktion

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1 1.11 Signaltransduktion KURSRAUM 23-F-26 Inhaltsverzeichnis 1. ALLGEMEINE LERNZIELE EINLEITUNG ALLGEMEINES PRINZIPIEN DER KONTRAKTION/RELAXATION DES GLATTEN MUSKELS ANHANG: FEINREGULATION EX-VIVO EXPERIMENT MIT DARMMUSKELPRÄPARAT VERSUCH MIT TAENIA COLI PRÄPARAT SIMULATIONSEXPERIMENT MIT GEFÄSSMUSKELPRÄPARAT BAYLISS-EFFEKT (MYOGENE AUTOREGULATION) EFFEKT VON ADRENALIN (10-7 M) AUF GLATTE MUSKEL DER AORTA KONZENTRATIONSABHÄNGIGKEIT DES Β 2 -EFFEKTS KONZENTRATIONSABHÄNGIGKEIT DES Α 1 -EFFEKTS GLOSSAR

2 1. Allgemeine Lernziele Durchführung eines ex-vivo Experimentes (in-vitro Versuchsbedingungen) und von in-silico Experimenten mit einem Simulationsprogramm zur Beschreibung der zellulären Vorgänge (Signaltransduktionsmechanismen) bei pharmakologischer Beeinflussung glatter Muskeln. 2. Einleitung 2.1 Allgemeines In diesem Versuch werden die Signaltransduktionsmechanismen von G-Protein gekoppelten Rezeptoren am Beispiel der Beeinflussung der Kontraktion der glatten Muskulatur erarbeitet und diskutiert. Die glatte Muskulatur unterstützt verschiedene Körperfunktionen, wie z.b. Kreislauf, Verdauungs- und Ausscheidungsprozesse, Geburt. Fehlleistungen der glatten Muskulatur führen deshalb zu einer Vielfalt von Krankheiten. Glatte Muskelzellen sind spindelförmig; ca. 2 bis 5 m dick und ca. 50 bis 200 m lang. Im Gegensatz zur quergestreiften Muskulatur, sind die Aktin-, resp. Myosinfilamente nicht regelmässig angeordnet, daher ist keine Querstreifung zu erkennen. Über sog. dense-bodies sind die Aktinfilamente mit der Zellmembran verbunden. Entsprechend der vielfältigen, organ-spezifischen Anforderungen an die glatte Muskulatur, findet man eine grosse strukturelle sowie funktionelle Vielfalt. Dennoch lassen sich allgemeine Prinzipien formulieren. Glatte Muskeln können gemäss ihrem Bewegungs-Phänotyp eingeteilt werden: a) Phasisch-rhythmisch: Dieses Bewegungsmuster (basaler Rhythmus) ist im Magen-Darm-Trakt besonders ausgebildet. Die Erregung kommt autonom innerhalb eines Verbandes von Muskelzellen zustande. Besonders im gastrointestinalen Bereich befinden sich die sog. interstitiellen Zellen nach Cajal (ICC-Zellen), welche als Schrittmacher wirken und für die myogene Aktivität verantwortlich sind. Die von den ICC-Zellen generierten elektrischen Signale 2

3 werden als slow-waves bezeichnet. ICC-Zellen erregen die glatten Muskelzellen sowie enterische Neurone über Gap-Junctions (Nexus). b) Haltend-tonisch: Dieser glatte Muskeltyp weist keine myogene Aktivität auf. Der Tonus ist weitgehend neurogen kontrolliert. Zu diesem Typ zählen z.b. die glatten Muskeln der Blutgefässe. Die glatte Muskulatur kann auf unterschiedliche Arten angeregt werden: a) Erregung durch Nervenfasern des vegetativen Nervensystems: Solche Nervenfasern enden zellnahe, ohne Ausbildung von Synapsen (diffuse Innervation mit Varikositäten, Boutons). Die Erregungsweiterleitung von Zelle zu Zelle geschieht über die Gap-Junctions (Connexine). b) Endokrine Erregung durch z.b. Oxytocin, Adrenalin, Vasopressin, Motilin etc. c) Kontraktion durch mechanische Reize (Dehnung, siehe Bayliss-Effekt). 2.2 Prinzipien der Kontraktion/Relaxation des glatten Muskels Eine Kontraktion des glatten Muskels kommt durch die Interaktion von Aktinund Myosinfilamenten zustande. Dies ist nur bei einer Aktivierung der Myosin- Leichtkette (MLK) möglich. Diese Aktivierung geschieht durch eine Phosphorylierung des Myosins durch die Myosin-Leichtketten-Kinase (MLKK) welche ihrerseits erst aktiviert werden muss, und zwar durch den Calcium-Calmodulin- Komplex. Dieser entsteht durch eine Zunahme der freien, intrazellulären Konzentration von Calcium-Ionen [Ca ++ ] i. Bei einem Abfall der Calcium- Konzentration zerfällt dieser Komplex, und als Folge wird die Aktivierung der MLKK rückgängig gemacht. Beachte, dass die Phosphorylierung der Myosinleichtkette durch eine Phosphatase rückgängig (Dephosphorylierung) gemacht wird (Figur 1). 3

4 Die Konzentration der freien intrazellulären Calcium-Ionen -[Ca ++ ] i - ist also für den Tonus des glatten Muskels von ausschlaggebender Bedeutung. Bei kompletter Relaxation beträgt [Ca ++ ] i ca. 100 nm (10-7 Mol/Liter). Eine Zunahme von [Ca ++ ] i wird durch den Ausstrom von Ca ++ -Ionen aus dem endoplasmatischen Retikulum (IP 3 -stimulierter Ca ++ -Kanal) sowie durch den Einstrom von extrazellulärem Ca ++ -Ionen (spannungsabhängiger Ca ++ -Kanal vom L-Typ) erreicht. Um eine Abnahme des [Ca ++ ] i zu erreichen, werden Ca ++ -Ionen einerseits aus der Zelle gepumpt (Ca ++ -ATPase, Na + /Ca ++ -Austauscher), andererseits werden Ca ++ -Ionen wieder in das endoplasmatische Retikulum zurücktransportiert (Ca ++ -ATPase). Die Calcium-Transportsysteme und deren Regulation, welche massgeblich die intrazelluläre Konzentration der Ca ++ -Ionen beeinflussen, sind in Figur 2 aufgeführt. Die intrazelluläre Calcium-Konzentration wird durch eine Vielzahl von Oberflächenrezeptoren kontrolliert. Dabei werden die Aktivitäten der Ca ++ - Transportsysteme durch die sog. second messenger (zyklisches AMP, zyklisches GMP, Inositol-drei-Phosphat/IP 3 ) moduliert: pharmako-mechanische Kopplung. Andererseits findet man in der glatten Muskulatur aber auch eine elektromechanische Kopplung; z.b. über Calcium Kanäle des L-Typs, deren Durchflussrate abhängig vom Membranpotential sind (Spannungs-gesteuerte Kalziumkanäle). 4

5 Die pharmako-mechanische Kopplung geschieht weitgehend über Rezeptoren, die der Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren angehören. Solche Rezeptoren lösen nach Stimulierung durch den spezifischen Liganden eine Aktivierung eines Effektorproteines (oft ein Enzym, kann aber auch ein Ionenkanal sein) aus. Die Signalübertragung vom Rezeptor zum Effektor erfolgt über ein G- Protein (GTP-, Guanin-Nukleotid bindendes Protein). Die Art des G-Proteines (G i, G s, G q etc) bestimmt, welches Effektorprotein (Adenyl-Zyklase, Phospholipase C, Kalium-Kanal, etc) aktiviert wird. In der glatten Muskulatur sind je nach Organ/Organabschnitt verschiedene Rezeptoren exprimiert. Einige sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Prinzipien der Kontraktion resp. Dilatation des glatten Muskels sind in Figur 2 dargestellt: Kontraktion: Die Zunahme des intrazellulären Calciums geschieht zweistufig. Erst wird durch IP 3 vermehrt Calcium aus dem ER freigesetzt. Im Allgemeinen genügt dies aber nicht, um eine vollständige Kontraktion auszulösen. Ausgelöst durch eine Zunahme von [Ca ++ ] i, wird das Membranpotential durch eine Aktivierung von Chlorid-Kanälen depolarisiert, wodurch Calcium-Kanäle des L-Typs geöffnet werden. Dadurch findet ein vermehrter Einstrom von Calcium-Ionen statt. Relaxation: Eine Relaxation der glatten Muskulatur findet statt wenn a) die Freisetzung von kontraktionsauslösenden Agonisten nachlässt oder b) wenn Rezeptoren stimuliert werden, durch welche vermehrt camp (oder cgmp) gebildet wird. Die Mechanismen der Relaxation, vor allem ausgelöst durch Zunahme des intrazellulären camp s und cgmp s, sind nicht alle bekannt. Bislang ist bekannt, dass die beiden second messenger camp und cgmp via der entsprechenden Protein-Kinasen (PK-A und PK-G) eine Aktivierung der Ca ++ - ATPasen sowie des Na + /Ca ++ -Austauschers bewirken. Zudem löst camp auch eine Hemmung der MLKK aus. Diese Inaktivierung entsteht durch Phosphorylierung der MLKK durch eine camp-aktivierte Protein Kinase A. 5

6 2.3 Anhang: Feinregulation Um eine zu starke Kontraktion zu verhindern, können konstriktorische Transmitter/Hormone in gegensätzlicher Art und Weise wirken. Solche Mechanismen sind sehr gewebespezifisch. Zum Beispiel kann die über adrenerge α 1 -Rezeptoren ausgelöste Zunahme der [Ca ++ ] i in der glatten Muskulatur vieler Arterien nicht nur eine Kontraktion bewirken, sondern auch derer Abschwächung. Diese partielle Relaxation wird von der [Ca ++ ] i Erhöhung ausgelöst indem die Phospholipase A2 stimuliert wird, was zu einer vermehrten Produktion von Prostaglandinen führt, die ihrerseits die Adenyl-Cyclase aktivieren, was schliesslich zu einer Erhöhung des camp und einer Relaxation führt. Eine solche (biphasische) Antwort ist besonders in Nierenarterien ausgeprägt. Im Falle der Stimulation der glatten Muskulatur von Arterien durch Adrenalin werden nicht nur α 1 -Rezeptoren aktiviert, sondern auch β 2 -Rezeptoren, die auch eine Zunahme von camp und eine entsprechende Relaxation fördern. Dieser relaxierende Effekt wird bereits bei niedrigeren Adrenalin Konzentrationen teilweise ausgelöst. Klinisches Beispiel: Oft wird zur Behandlung von Entzündungen ein Prostaglandinsynthese-Hemmer eingesetzt (z.b. Indomethacin, Acetylsalicylsäure, Acetaminophen, Ibuprofen). Durch die dabei ausgelöste Hemmung der dilatierenden Wirkung der Prostaglandine kann es bei einer solchen Behandlung zu einer Abnahme des renalen Blutflusses kommen. Im Extremfall ist ein akutes Nierenversagen die Folge. 6

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8 3. Ex-vivo Experiment mit Darmmuskelpräparat Präparat: Taenia coli des Schweineblinddarms (aus dem Schlachthof) Figur 3 Der Versuch wird in einem Organbad (siehe Figur 3) durchgeführt. Die darin enthaltene Ringerlösung wird durch eine Glasfritte mit einem Gemisch aus 95 % O 2 und 5 % CO 2 begast. Mit Hilfe eines Wasserbades wird die Temperatur im Organbad bei 37 o C konstant gehalten. Die zu testenden Pharmaka (siehe Glossar) werden direkt in das Organbad gegeben (je ca. 0.2 ml). Ein Abflussstutzen am Boden des Organbades erlaubt das Auswechseln der Lösung. Die Muskelpräparate sind an einem Ende am Versuchsgefäss befestigt und sind am andern Ende mit einem mechano-elektrischen Wandler verbunden. Dieser registriert die Kontraktion/Dilatation und gibt eine, der Längenänderung proportionale Spannung aus, die mit Hilfe eines analog-digital-wandlers und einer Computersoftware aufgezeichnet wird. 8

9 3.1 Versuch mit Taenia coli Präparat Das vorbereitete Muskelpräparat wird gemäss der untenstehenden Anweisung behandelt. 0.2 ml Acetylcholin (ACh) Wechsel der Badelösung 0.2 ml ACh Wechsel der Badelösung 0.2 ml Verapamillösung nach ca. 5 min Zugabe von 0.2 ml ACh Wechsel der Badelösung Nach ca. 10 min nochmals waschen 0.2 ml ACh Wechsel der Badelösung 0.2 ml ACh und nach max. Stimulierung Zugabe von 0.2 ml Atropin Nach jedem Wechsel der Organbadlösung wird mit neuer, vorgewärmter Ringerlösung aufgefüllt (Becherglas im Wasserbad). Die Flüssigkeit vorsichtig einfüllen, ohne dabei den Strahl auf das Gewebe zu richten! 9

10 4. Simulationsexperiment mit Gefässmuskelpräparat Präparat: Aortenwand der Ratte (SimVessel II) Einstellungen für Experimente: Messgerät ON (grün) (1) Aorta einspannen (2) Resolution: 5 mv/div (3) Speed: 0.5 cm/min (4) Zeitablauf: 5x (schneller als Realität) (5) Zero adjust (6) 4.1 Bayliss-Effekt (myogene Autoregulation) Nach jeder 'Manipulation' jeweils auf Stabilisation der Präparatlänge warten Nulllinie des Schreibers bei ~1/3 setzen (zb 6 Häuschen von unten) (7) Schreiber ON (grün) (8) (9) Zero adjust (6) 10

11 1. Gewicht (0.5) auf Hängetablett (10) 2. Gewicht (0.5) auf Hängetablett Gewichte zurück auf Tisch legen Schreiber OFF (rot) (8) Beobachtung: Wie reagiert die glatte Muskulatur der Aortenwand auf eine erhöhte Spannung? 4.2 Effekt von Adrenalin (10-7 M) auf glatte Muskel der Aorta Unterscheidung des kontrahierenden Effekts von Adrenalin, welcher über adrenerge alpha-rezeptoren (α 1 ) vermittelt wird, vom relaxierenden Effekt von Adrenalin, welcher über adrenerge beta-rezeptoren (β 2 ) vermittelt wird, durch Benutzung der spezifischen Inhibitoren Phentolamin (blockiert adrenerge α- Rezeptoren) und Propranolol (blockiert adrenerge β-rezeptoren). Nulllinie des Schreibers 2 Häuschen von unten setzen (7) Schreiber ON (8) (9) Zero adjust (6) 10-7 M Adrenalin (11) 30 μl (12) der 10-4 M Lösung (11) in 30 ml Bad geben (1x auf roten Pfeil drücken) 10-5 M Phentolamin (13) 300 μl (12) der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad geben 10-5 M Propranolol (13) 300 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad geben 10-5 M Propranolol 300 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad geben 10-7 M Adrenalin 30 μl der 10-4 M Lösung in 30 ml Bad geben 10-5 M Phentolamin 300 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad geben 10-5 M Phentolamin 300 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad geben 10-7 M Adrenalin 30 μl der 10-4 M Lösung in 30 ml Bad geben 10-5 M Propranolol 300 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad geben 11

12 Schreiber OFF Frühere Anteile der Aufnahme können auf dem 'Schreiber' besichtigt werden indem auf Analysis (14) umgeschaltet wird. Bemerkungen: Die kontrahierende Wirkung von Adrenalin ist biphasisch: transienter Peak gefolgt von einem Plateau Die Transmitter werden in diesem simulierten in vitro System nicht quantitativ abgebaut, sie bleiben also bis zum nächsten Wechsel der Badelösung aktiv (in vivo hat Adrenalin jedoch eine kurze Halbwertszeit). Je nach Gefässmuskulatur kann der β 2 -Effekt (Relaxation) im Verhältnis zum α 1 -Effekt unterschiedlich gross sein. 4.3 Konzentrationsabhängigkeit des β 2 -Effekts Alpha-Effekt wird durch Zugabe von Phentolamin inhibiert Nulllinie des Schreibers in die Mitte setzen (7) Schreiber ON Zero adjust ~10-4 M Phentolamin 3x999 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad 10-9 M Adrenalin 3 μl der 10-5 M Lösung in 30 ml Bad 10-8 M Adrenalin +27 μl der 10-5 M Lösung in 30 ml Bad 10-7 M Adrenalin +27 μl der 10-4 M Lösung in 30 ml Bad 10-6 M Adrenalin +27 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad 10-5 M Adrenalin +270 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad 10-5 M Propranolol 300 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad geben Schreiber OFF Bad wechseln (wash) Schreiber OFF Bemerkung: die Messung wird durch den nicht ganz blockierten α 1 -Effekt bei hohen Adrenalinkonzentrationen gestört. Phentolamine ist nämlich ein kompetitiver Inhibitor und seine Konzentration von 10-4 M reicht nicht aus um den Effekt 12

13 hoher Adrenalin Konzentrationen völlig zu blockieren. Deshalb ist hier die Messung bei 10-5 M Adrenalin nicht brauchbar. Beobachtung: Bei welcher Adrenalinkonzentration wird ungefähr eine halbmaximale Relaxation erreicht? 4.4 Konzentrationsabhängigkeit des α 1 -Effekts Beta-Effekt wird durch Zugabe von Propranolol blockiert Resolution: 5 mv/div (3) Nulllinie des Schreibers 2 Häuschen von unten setzen (7) Schreiber ON Zero adjust 10-5 M Propranolol 300 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad geben 10-9 M Adrenalin 3 μl der 10-5 M Lösung in 30 ml Bad geben 10-8 M Adrenalin +27 μl der 10-5 M Lösung in 30 ml Bad geben 10-7 M Adrenalin +27 μl der 10-4 M Lösung in 30 ml Bad geben 10-6 M Adrenalin +27 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad geben 10-5 M Adrenalin +270 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad 10-4 M Adrenalin +10x270 μl (schnell klicken) der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad geben ~10-4 M Phentolamin 10x300 μl der 10-3 M Lösung in 30 ml Bad geben Schreiber OFF Beobachtung: Bei welcher Adrenalinkonzentration wird ungefähr eine halbmaximale Kontraktion erreicht? Wie verhält sich die Konzentrationsabhängigkeit von Adrenalin für den α 1 -Rezeptor (Kontraktion) im Vergleich mit dem β 2 - Rezeptor (Relaxation)? 13

14 1. Glossar Atropin Ein natürliches Alkaloid (z.b. aus der Tollkirsche; Atropa belladonna), ist ein kompetitiver Antagonist für muskarinische M1-, M2- und M3-Rezeptoren und wirkt daher parasympatholytisch. Phentolamin (Regitin R ) Ein Imidazolin-Derivat mit hoher Affinität zu 1 -Rezeptoren (antagonistische Wirkung). Die Wirkung ist kompetitiv und reversibel. Ringer-Lösung Folgende Ringer-Lösung wird verwendet (Zusammensetzung in mmol / Liter): 143 Na Cl K HPO Ca SO Mg HCO 3 Die Lösung enthält zusätzlich 10 mm D-Glucose. Verapamil Hemmt den spannungsabhängigen L-Typ Calciumkanal. Verwendete Pharmaka Für Darmmuskelpräparat: Acetylcholin (5.5 mm) Atropin (0.36 mm) Verapamil (10 mm in Aethanol) Für Arterienmuskelpräparat (in SimVessel): Adrenalin (10 μm (10-5 M), 100 μm (10-4 M), 1 mm (10-3 M) Propranolol (1 mm (10-3 M) Phentolamin (1 mm (10-3 M) 14

15 Tabelle l: Adrenerge- und Acetylcholin-Rezeptoren der glatten Muskulatur (eine Auswahl, siehe Lehrbücher für die Orte derer Expression) Name Effektor (G-Protein) Signal Transduktion via Agonist/ Antagonist adrenerge Rezeptoren: α 1A G q/11 IP 3 /DAG NA>Adrenalin/ Phentolamin u.a. β 1 G s camp Isoproterenol; NA Adrenalin/ Propranolol β 2 G s camp Isoproterenol; Adrenalin>NA/ Propranolol muskarinische Acetylcholin Rezeptoren: M 1 G q/11 IP 3 /DAG Ach/ Atropin M 2 G i/o camp, K + Ach/ Atropin 15