Genetik und Molekularbiologiekurs Phage Display. wen interessiert das?

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1 Genetik und Molekularbiologiekurs 2007 Phage Display wen interessiert das?

2 CDR Repair, a New Approach to Antibody Humanization Dr. Mark Dennis, Senior Scientist, Genentech Inc. Engineering Specificity Changes in Protein-Protein Interactions using Phage Display Dr. Timothy G. Palzkill, Professor of Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine Beyond Antibody-Based Therapeutics: AdNectins, a Novel Class of Protein Products Dr. Alan Harris, Senior Director, Process Development & Product Candidate Management, Compound Therapeutics HuCAL - Derived Antibodies for Targeting GPCR Dr. Markus Enzelberger, Senior Director R&D, MorphoSys AG Engineering Kunitz Domains Using Phage Display Dr. Andrew Nixon, Senior Director, Biochemistry, Dyax Corp. Generation of High Affinity Peptides against Receptor Tyrosine Kinases and their Potential Applications Dr. Ajay Shrivastava, Research Investigator, Bracco Research We describe a distinct strategy to generate high affinity peptide (HAPs) binders against receptor tyrosine kinases (RTKs)

3 PHAGE DISPLAY OF PROTEINS & PEPTIDES November 7-20, 2006 Application Deadline: July 15, 2006 Instructors: Carlos Barbas, Scripps Research Institute Gregg Silverman, University of California, San Diego Don Siegel, University of Pennsylvania Medical Center Recent advances in the generation and selection of antibodies from combinatorial libraries allow for the rapid production of antibodies from immune and non-immune sources. This intensive laboratory/lecture course will focus on the construction of combinatorial antibody libraries expressed on the surface of phage and selection of desired antibodies from the library. Students will learn the theoretical and practical aspects of constructing combinatorial libraries from immune and non-immune sources as well as the construction of synthetic antibody libraries. Antibodies will be selected from the library by panning. Production, purification and characterization of Fab fragments expressed in E.coli will also be covered. Epitopes will be selected from peptide libraries and characterized. Cost (including board and lodging): $2,800 Courses organised by: Molecular and Medical Microbiology Research Group University of Westminster, UK Phage display Technology: Isolate your own antibodies 5 day laboratory/ Lecture 25th July 29th July ( 720 for IBMS Members) Production of monoclonal antibodies by hybridoma technology is a very labour intensive, tedious and expensive process that does not guarantee success after all the lengthy procedures. Phage display technology, offers a powerful alternative to obtain target specific, genetically stable human antibodies from combinatorial libraries. This 5 day intensive practical/ theory course will cover the essential processes in the production of monoclonal antibodies by phage display. The participant will have the opportunity to screen a library for their antibodies of choice to take away! The course structure is as follows: Theoretical aspects Why phage display? : Phage display technology, Origin, Biology of filamentous phage Genome of m13 series of helper phage, Bacterial hosts and their roles and expression of antibodies in E.coli. Antibodies structure and function. Construction of combinatorial library from human and other animal sources: Principle of selection of ScFV, production of ScFv by Biopanning, Characterisation of ScFv, ELISA, DOT BLOT, Immunoblot and PCR Practicals using your antigen of choice Propagation of helper phage and phagemid Panning of library Elution of antibodies Infection of E.coli and growth Harvesting phage Additional practicals Production of soluble antibody ELISA, Dot blot and immunoblot PCR.

4 Wie findet man Peptide, die ein bestimmtes Zielprotein binden? Im Kurs soll ein Peptid gefunden werden, das Streptavidin bindet. Gründe für eine Peptidbibliothek Der natürliche Ligand ist kein Peptid und diesen auch nicht ähnlich Computerprogramme erlauben keine genaue Vorhersage Selektion eines Peptids aus einer Peptidbibliothek

5 Streptavidin mit Biotin Herstellung einer Peptidbibliothek 7 Aminosäuren sind gewünscht und alle Aminosäuren sollen enthalten sein = 1,28x10 9 Möglichkeiten tatsächliche theoretische Größe der Genbibliothek nnk-schema 4 7 x 4 7 x 2 7 = 3,4 x10 10 n n k A A G C C T G G T T Die verwendete Phagenbibliothek umfasst ca 2,8 x 10 9 individuelle Klone chemische Synthese: bis ca 10 3 Moleküle, technisch aufwendig, teuer

6 Der Lebenszyklus eines filamentösen Phagen Der schematische Aufbau eines Phagen peptide protein giii N1 N2 CT fd phage peptide library gene-iii

7 Phage im Elektronenmikroskop Ph.D.-7 Phage Display Peptide Library Kit Rapid Screening of Peptide Ligands with a Rapid Screening of Peptide Ligands with a Phage Display Peptide

8 Phagenselektion Eine Phagenbibliothek wird zu einer mit einem Zielmolekül belegten Platte oder Röhrchen gegeben Nicht gebundene Phagen werden durch Waschen entfernt Spezifisch gebundene Phagen werden mit einem Überschuß an Ligand oder durch eine ph Erniedrigung eluiert Die eluierten Phagen werden amplifiziert und die Anreicherung wiederholt Nach 3-4 Runden werden einzelne Klone analysiert Phage-Display Übersicht Phagenselektion Immunoröhrchen Phagen Phagen Phagen Zellen belegen binden waschen eluieren infizieren Phagenproduktion Titerbestimmung Zellen in Flüssigkultur PEG/NaCl-Fällung Plaques / infizierte Zellen auf Agar-Platte

9 Wozu ein Steptavidin bindendes Peptid? The random peptide library-assisted engineering of a C-terminal affinity peptide, useful for the detection and purification of a functional Ig Fv fragment. Protein Eng Jan;6(1): Protein-Tag zur Proteinreinigung The Strep-tag protein purification cycle binding elution regeneration regeneration regeneration GFP Strep-tag protein binds to Strep-Tactin with desthiobiotin desthiobiotin completely removed with color control beginning of desthiobiotin removal fast regeneration with equilibration buffer Säulenmaterial gravity flow Strep-Tactin Sepharose gravity flow,low pressure or FPLC Strep-Tactin Superflow gravity flow,low pressure or FPLC Strep-Tactin Macroprep FPLC or HPLC Strep-Tactin POROS 20/50

10 Protein-Tag zur Proteindetektion Proteindetektion Strep-Tactin HRP Strep-Tactin AP Monoclonal antibody Dot blot + (> 7 ng/dot) + (> 1 ng/dot) + (> 5 ng/dot) Western blot + (> 7 ng/band) + (> 2 ng/band) + (> 5 ng/band) ELISA Electron microscopy Fluorescence microscopy Protein-Tag zur Analyse Ready-to-use Strep-Tactin coated 8- well strips provide the power of our Strep-tag system in a solid-phase, multi-well format for convenient assays and high throughput screenings of biomolecules tagged with Strep-tag II. The new Strep-tag Protein Ladder simplifies the comparison of Coomassie stained gels with corresponding Western blots. Thus, Strep-tag fusion proteins can be located accurately in complex band patterns on Coomassie gels.

11 Reinigung von Proteinkomplexen Das NNK Schema

12 Möglichkeiten der verzufallten Synthese T C A G T C A G UUU F 21.7 UCU S 9.1 UAU Y 16.2 UGU C 5.1 UUC F 16.7 UCC S 8.9 UAC Y 12.4 UGC C 6.4 UUA L 13.4 UCA S 7.6 UAA * 2 UGA * 0.9 UUG L 13.2 UCG S 8.7 UAG * 0.3 UGG W 14.4 CUU L 11.1 CCU P 7 CAU H 12.6 CGU R 21.1 CUC L 10.7 CCC P 5.3 CAC H 9.8 CGC R 21.5 CUA L 3.9 CCA P 8.4 CAA Q 14.7 CGA R 3.6 CUG L 51.9 CCG P 22.8 CAG Q 29 CGG R 5.5 AUU I 29.8 ACU T 9.4 AAU N 18 AGU S 8.8 AUC I 25.1 ACC T 23.1 AAC N 21.8 AGC S 15.7 AUA I 4.9 ACA T 7.5 AAA K 34.4 AGA R 2.5 AUG M 27.4 ACG T 14 AAG K 11.2 AGG R 1.5 GUU V 19 GCU A 16.1 GAU D 32.1 GGU G 25.3 GUC V 14.9 GCC A 25.2 GAC D 19.5 GGC G 29.2 GUA V 11.2 GCA A 20.4 GAA E 39.9 GGA G 8.3 GUG V 25.8 GCG A 32.8 GAG E 18.4 GGG G 11.0 R= A/G Y= C/T M= A/C K= G/T S= C/G W= A/T H= A/C/T B= C/G/T V= A/C/G D= A/G/T N= A/C/G/T T C A G nnk total 32 van total 12 vnn total 48 vdn toal 36 rnn total 32 vwn total 24 dyn total 24 A = Ala C = Cys D = Asp E = Glu F = Phe G = Gly H = His I = Ile K = Lys L = Leu M = Met N = Asn P = Pro Q = Gln R = Arg S = Ser T = Thr V = Val W = Trp Y= Tyr TAG stop Klonierung einer DNA-Bibliothek M13KE is a derivative of M13mp19 designed for expression of peptides as N-terminal piii fusions in phage display applications. Relative to the parent M13mp19, Acc65 I/Kpn I and Eag I sites have been introduced flanking the piii leader peptidase cleavage site, and the Acc65 I/Kpn I site in the multiple cloning site (MCS) was deleted. Phage displayed random peptide libraries are constructed by annealing an extension primer to a synthetic oligonucleotide encoding the random peptide library and a portion of the piii leader sequence, extending with DNA polymerase, and digesting with Acc65 I and Eag I. The resulting cleaved duplex is inserted into M13KE which has been digested with the same enzymes.

13 Software zum Klonieren EMBOSS ( GENtle ( pdraw32 ( Vector NTI ( GCG / DSGene ( Rechenaufgabe für die Schnellen: Verdünnungsreihen Eine Phagenlösung enthält vermutlich 10 Billionen Phagen pro ml. Aus dem letzten Schritt einer Verdünnungsreihe werden 10 μl entnommen, mit 500 μl Medium + Zellen gemischt und plattiert. Man möchte 100 Plaques erhalten. Wie groß muß die Verdünnung sein?

14 Informationen aus Molecular Cloning 3 rd Ed.

15 Gene und Proteine des Phagen (Russel et al. Phage Display, A Practical Approach, 2004, Oxford University Press)

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17 Gentechnischer Arbeitsbereich S1 Es dürfen nur qualifizierte und vom Projektleiter eingewiesene Mitarbeiter beschäftigt werden. Über die Durchführung gentechnischer Arbeiten müssen Aufzeichnungen geführt werden. Türen während der Arbeiten geschlossen halten Persönliche Schutzausrüstung benutzen! (immer Laborkittel, bei Bedarf Einmalhandschuhe, bei möglicher Gefährdung der Augen grundsätzlich Schutzbrille tragen) Essen, Trinken, Rauchen, Schnupfen, Schminken und das Aufbewahren von Nahrungs- und Genußmitteln sind verboten. Kein Mundpipettieren! Pipettierhilfen benutzen. Aerosolbildung vermeiden. Spritzen und Kanülen nur wenn unbedingt nötig benutzen. Nach Beendigung der Arbeiten Hände waschen. Labor aufgeräumt und sauber halten; auf den Arbeitsplätzen nur die tatsächlich benötigten Geräte und Materialien abstellen. Verbote: Gebote:

18 Vorsicht beim Umgang mit Chemikalien und biologischem Material Warnungen Gefahrensymbole Verhalten im Notfall Nach Verschütten: biologisches Material aufsaugen, Oberflächen desinfizieren. Nach Hautkontakt: mit Händedesinfektionsmittel desinfizieren. Nach Augen- oder Schleimhautkontakt: Mit reichlich Wasser ausspülen. Nach Verletzungen: Wunde ausbluten lassen, anschließend ggf. desinfizieren, Wundverband anlegen. Ggf. Arzt aufsuchen. Jede Verletzung dem Projektleiter melden. Bei Eingangstür und Tafel Waschbecken hinten u. vorne Augendusche verweden Im Flur bei Lastaufzug Neben Aufzug Tel Fenster oder Hauptausgang

19 Farbkodierung der Armaturen Trinkwasser, kalt - (WTK) Vollentsalztes (VE) Wasser, kalt - (WEK) Propan/Butan (Fl.-Gas) - (LPG) Druckluft - (LD)