Genetik und Molekularbiologiekurs 2005 January 17 20, Vancouver, British Columbia, Canada. Phage Display. wen interessiert das?

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1 Kongresse zum Phage Display Genetik und Molekularbiologiekurs 2005 January 17 20, Vancouver, British Columbia, Canada Phage Display wen interessiert das? PRICING INFORMATION Commercial Academic, Government, Hospital Affiliated 5 Day Pricing (April 2630, 2004) Phage Display, Recombinant Antibodies and Monoclonal Antibodies Advance Registration Discount until March 26, 2004 $2025 $1130 Registrations after March 26, 2004, and onsite $2275 $1200 Kongress Inhalt Cold Spring Harbor Kursangebot DISCOVERY OF PROTEIN THERAPEUTICS Rapid Identification of Compounds Binding GPCRs Dr. Xavier Leroy, Axovan Ltd Small Functional Peptides Dr. Michael Famulok, Universität Bonn Selfassembly of Proteins and Their Nucleic Acids Dr. Mikhail Soloviev, University of London Discovery of Selective Kinase Inhibitors Dr. John Prescott, Sunesis Pharmaceuticals, Inc. TARGETING CANCER MECHANISMS High Affinity Tumor Targeting Dr. K. Dane Wittrup, M.I.T. Potent Antagonist of VEGFR2 Dr. Aaron Sato, Dyax Corp. Engineering Ribonucleases as Novel Chemotherapeutics Dr. Ron Raines, University of Wisconsin Targeting the EphA2 Receptor Dr. Mitchell Koolpe, The Burnham Institute ANTIBODIES FOR TARGETING DISEASE Fluorobodies Andrew Bradbury, Los Alamos National Laboratory Identification of Potent Antagonist Antibodies Dr. Zoey Fredericks, Antibody Therapy, Amgen Discovery of an AntiTissue Factor Surrogate Dr. Karyn O'Neil, Centocor, Inc. A Blocking AntiVEGF Antibody Ms. Germaine Fuh, Protein Engineering, Genentech, Inc. Optimising Defined Properties of Protein Drugs Dr. Lutz Jermutus, Cambridge Antibody Technology PHAGE DISPLAY OF PROTEINS & PEPTIDES November 8 21, 2005 Application Deadline: July 15, 2005 Instructors: Carlos Barbas, Scripps Research Institute Gregg Silverman, University of California, San Diego Don Siegel, University of Pennsylvania Medical Center Recent advances in the generation and selection of antibodies from combinatorial libraries allow for the rapid production of antibodies from immune and nonimmune sources. This intensive laboratory/lecture course will focus on the construction of combinatorial antibody libraries expressed on the surface of phage and selection of desired antibodies from the library. Cost (including board and lodging): $2,665

2 Wie findet man Peptide, die ein bestimmtes Zielprotein binden? Gründe für eine Peptidbibliothek Im Kurs soll ein Peptid gefunden werden, das Streptavidin bindet. Der natürliche Ligand ist kein Peptid und diesen auch nicht ähnlich Computerprogramme erlauben keine genaue Vorhersage Selektion eines Peptids aus einer Peptidbibliothek Streptavidin mit Biotin Herstellung einer Peptidbibliothek 7 Aminosäuren sind gewünscht und alle Aminosäuren sollen enthalten sein = 1,28x10 9 Möglichkeiten tatsächliche theoretische Größe der Genbibliothek nnkschema 4 7 x 4 7 x 2 7 = 3,4 x10 10 n n k A A G C C T G G T T Die verwendete Phagenbibliothek umfasst ca 2,8 x 10 9 individuelle Klone chemische Synthese: bis ca 10 3 Moleküle, technisch aufwendig, teuer

3 peptide protein giii N1 N2 CT fd phage peptide library geneiii Ph.D.7 Phage Display Peptide Library Kit Rapid Screening of Peptide Ligands with a Phage Display Peptide

4 PhageDisplay Übersicht Phagenselektion Eine Phagenbibliothek wird zu einer mit einem Zielmolekül belegten Platte oder Röhrchen gegeben Nicht gebundene Phagen werden durch Waschen entfernt Immunoröhrchen belegen Phagen binden Phagen waschen Phagen eluieren Zellen infizieren Spezifisch gebundene Phagen werden mit einem Überschuß an Ligand oder durch eine ph Erniedrigung eluiert Phagenproduktion Titerbestimmung Die eluierten Phagen werden amplifiziert und die Anreicherung wiederholt Nach 34 Runden werden einzelne Klone analysiert Zellen in Flüssigkultur PEG/NaClFällung Plaques / infizierte Zellen auf AgarPlatte Wozu ein Steptavidin bindendes Peptid? ProteinTag zur Proteinreinigung The Streptag protein purification cycle binding GFP Streptag protein binds to StrepTactin elution with desthiobiotin with color control beginning of desthiobiotin removal desthiobiotin completely removed fast with equilibration buffer Säulenmaterial gravity flow gravity flow,low pressure or FPLC gravity flow,low pressure or FPLC FPLC or HPLC StrepTactin Sepharose StrepTactin Superflow StrepTactin Macroprep StrepTactin POROS 20/50

5 ProteinTag zur Proteindetektion ProteinTag zur Analyse Proteindetektion Dot blot Western blot ELISA Electron microscopy Fluorescence microscopy StrepTactin HRP (> 7 ng/dot) (> 7 ng/band) StrepTactin AP (> 1 ng/dot) (> 2 ng/band) Monoclonal antibody (> 5 ng/dot) (> 5 ng/band) Readytouse StrepTactin coated 8 well strips provide the power of our Streptag system in a solidphase, multiwell format for convenient assays and high throughput screenings of biomolecules tagged with Streptag II. The new Streptag Protein Ladder simplifies the comparison of Coomassie stained gels with corresponding Western blots. Thus, Streptag fusion proteins can be located accurately in complex band patterns on Coomassie gels. Gentechnischer Arbeitsbereich S1 Es dürfen nur qualifizierte und vom Projektleiter eingewiesene Mitarbeiter beschäftigt werden. Über die Durchführung gentechnischer Arbeiten müssen Aufzeichnungen geführt werden. Türen während der Arbeiten geschlossen halten Persönliche Schutzausrüstung benutzen! (immer Laborkittel, bei Bedarf Einmalhandschuhe, bei möglicher Gefährdung der Augen grundsätzlich Schutzbrille tragen) Essen, Trinken, Rauchen, Schnupfen, Schminken und das Aufbewahren von Nahrungs und Genußmitteln sind verboten. Kein Mundpipettieren! Pipettierhilfen benutzen. Aerosolbildung vermeiden. Spritzen und Kanülen nur wenn unbedingt nötig benutzen. Nach Beendigung der Arbeiten Hände waschen. Labor aufgeräumt und sauber halten; auf den Arbeitsplätzen nur die tatsächlich benötigten Geräte und Materialien abstellen. Verbote: Gebote:

6 Warnungen Vorsicht beim Umgang mit Chemikalien und biologischem Material Verhalten im Notfall Nach Verschütten: biologisches Material aufsaugen, Oberflächen desinfizieren. Nach Hautkontakt: mit Händedesinfektionsmittel desinfizieren. Nach Augen oder Schleimhautkontakt: Mit reichlich Wasser ausspülen. Nach Verletzungen: Wunde ausbluten lassen, anschließend ggf. desinfizieren, Wundverband anlegen. Ggf. Arzt aufsuchen. Jede Verletzung dem Projektleiter melden. Gefahrensymbole Bei Eingangstür und Tafel Waschbecken hinten u. vorne Augendusche verweden Im Flur bei Lastaufzug Neben Aufzug Tel Fenster oder Hauptausgang Farbkodierung der Armaturen Das NNK Schema Trinkwasser, kalt (WTK) Vollentsalztes (VE) Wasser, kalt (WEK) Propan/Butan (Fl.Gas) (LPG) Druckluft (LD)

7 Möglichkeiten der verzufallten Synthese T UUU F 21.7 UCU S 9.1 UAU Y 16.2 UGU C 5.1 UUC F 16.7 UCC S 8.9 UAC Y 12.4 UGC C 6.4 UUA L 13.4 UCA S 7.6 UAA * 2 UGA * 0.9 UUG L 13.2 UCG S 8.7 UAG * 0.3 UGG W 14.4 CUU L 11.1 CCU P 7 CAU H 12.6 CGU R 21.1 CUC L 10.7 CCC P 5.3 CAC H 9.8 CGC R 21.5 CUA L 3.9 CCA P 8.4 CAA Q 14.7 CGA R 3.6 CUG L 51.9 CCG P 22.8 CAG Q 29 CGG R 5.5 C A G T C A G AUU I 29.8 ACU T 9.4 AAU N 18 AGU S 8.8 AUC I 25.1 ACC T 23.1 AAC N 21.8 AGC S 15.7 AUA I 4.9 ACA T 7.5 AAA K 34.4 AGA R 2.5 AUG M 27.4 ACG T 14 AAG K 11.2 AGG R 1.5 GUU V 19 GCU A 16.1 GAU D 32.1 GGU G 25.3 GUC V 14.9 GCC A 25.2 GAC D 19.5 GGC G 29.2 GUA V 11.2 GCA A 20.4 GAA E 39.9 GGA G 8.3 GUG V 25.8 GCG A 32.8 GAG E 18.4 GGG G 11.0 R= A/G Y= C/T M= A/C K= G/T S= C/G W= A/T H= A/C/T B= C/G/T V= A/C/G D= A/G/T N= A/C/G/T T C A G nnk total 32 van total 12 vnn total 48 vdn toal 36 rnn total 32 vwn total 24 dyn total 24 A = Ala C = Cys D = Asp E = Glu F = Phe G = Gly H = His I = Ile K = Lys L = Leu M = Met N = Asn P = Pro Q = Gln R = Arg S = Ser T = Thr V = Val W = Trp Y= Tyr TAG stop Eine Phagenlösung enthält vermutlich 10 Billionen Phagen pro ml. Aus dem letzten Schritt einer Verdünnungsreihe werden 10 µl entnommen, mit 500 µl Medium Zellen gemischt und plattiert. Man möchte 100 Plaques erhalten. Wie groß muß die Verdünnung sein? Klonierung einer DNABibliothek Software zum Klonieren M13KE is a derivative of M13mp19 designed for expression of peptides as Nterminal piii fusions in phage display applications. Relative to the parent M13mp19, Acc65 I/Kpn I and Eag I sites have been introduced flanking the piii leader peptidase cleavage site, and the Acc65 I/Kpn I site in the multiple cloning site (MCS) was deleted. EMBOSS ( pdraw32 ( GCG / DSGene ( Vector NTI ( Phage displayed random peptide libraries are constructed by annealing an extension primer to a synthetic oligonucleotide encoding the random peptide library and a portion of the piii leader sequence, extending with DNA polymerase, and digesting with Acc65 I and Eag I. The resulting cleaved duplex is inserted into M13KE which has been digested with the same enzymes.