Biochemisches Effekt-Monitoring in der Umweltmedizin. - Hämoglobin-Addukte von Acrylamid, Glycidamid und

Transkript

1 Biochemisches Effekt-Monitoring in der Umweltmedizin - Hämoglobin-Addukte von Acrylamid, Glycidamid und Acrylnitril im Blut der Allgemeinbevölkerung - Den Naturwissenschaftlichen akultäten der riedrich-alexander-universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Thomas Schettgen aus Saarlouis

2 Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen akultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder Erstberichterstatter: Prof. Dr. M. Pischetsrieder Zweitberichterstatter: Prof. Dr. H. Drexler

3 Die vorliegende Arbeit entstand am Institut für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin der Universität Erlangen-Nürnberg unter der Leitung von Prof. Dr. J. Angerer in der Zeit von ebruar 1999 bis ebruar Herrn Prof. Dr. J. Angerer danke ich für die wissenschaftliche Betreuung der Arbeit, das entgegengebrachte Vertrauen und seine kontinuierliche Unterstützung meiner Tätigkeit am Institut. rau Prof. Dr. M. Pischetsrieder gilt mein Dank für die Betreuung der Dissertation seitens der Naturwissenschaftlichen akultäten und dem Interesse am interdisziplinären Arbeiten. Herrn Dr. Rossbach sowie Herrn Prof. Dr. Letzel vom Institut für Arbeits- und Umweltmedizin der Universität Mainz danke ich für die Möglichkeit zur Messung der aufgearbeiteten Proben. Mein Dank gilt ferner allen Mitarbeitern des Instituts, insbesondere in der Universitätsstrasse, die durch die gute und freundschaftliche Zusammenarbeit zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben und die für einen regen wissenschaftlichen Austausch in gemeinsamen Diskussionen gesorgt haben. Besonderer Dank gilt Herrn Johannes Müller für seine engagierte und kompetente Unterstützung in allen ragen der instrumentellen Analytik sowie rau Claudia erstl für die Hilfe bei der Erarbeitung der Analytik sowie der Aufarbeitung der Proben. Ein spezielles Dankeschön geht auch an meine Lebensgefährtin Vanessa Kiesel für die zahlreichen Auf- und Ermunterungen beim Erstellen dieser Arbeit. Nicht zuletzt geht ein Dankeschön an meine Eltern, die mich auf meinem bisherigen Lebensweg und somit auch auf diesem Abschnitt tatkräftig unterstützt haben.

4 In direktem Zusammenhang mit dieser Dissertation sind folgende Veröffentlichungen erschienen: T. Schettgen, H.C. Broding, J. Angerer, H. Drexler: Haemoglobin adducts of ethylene oxide, propylene oxide, acrylonitrile and acrylamide biomarkers in occupational and environmental medicine. Toxicol Letters 134 (1-2), (2002). T. Schettgen, H. Drexler, J. Angerer: Acrylamid in der deutschen Allgemeinbevölkerung eine Abschätzung der täglichen Aufnahme. Umweltmed orsch Prax 7 (6), (2002). T. Schettgen, T. Weiss, H. Drexler, J. Angerer: A first approach to estimate the internal exposure to acrylamide in smoking and non-smoking adults in Germany. Int J Hyg Environ Health 206 (1), 9 14 (2003). J. Angerer und T. Schettgen: Acrylamid eine Abschätzung von Aufnahme und Gesundheitsgefährdung. Internistische Praxis 43 (4), (2003). T. Schettgen, B. Kütting, M. Hornig, M.W. Beckmann, T. Weiss, H. Drexler, J. Angerer: Transplacental exposure of neonates to acrylamide a pilot study. Int Arch ccup Environ Health 77, (2004). T. Schettgen, B. Rossbach, B. Kütting, S. Letzel, H. Drexler, J. Angerer: Determination of haemoglobin adducts of acrylamide and glycidamide in smoking and non-smoking persons of the general population. Int J Hyg Environ Health 207 (6), (2004). Teile der Dissertation haben massgeblichen Anteil an dem bei der DG beantragten und bewilligten Projekt xidativer und reduktiver Stoffwechsel von Acrylamid und Acrylnitril beim Menschen Merkaptursäuren und Hb-Addukte als Parameter der Dosis und des biochemischen Effektes (AN 107/17-1 und 17-2).

5 Erst zweifeln, dann untersuchen, dann entdecken! Henry Thomas Buckle, brit. Historiker ( )

6 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungen 1. Einleitung Möglichkeiten der Expositionskontrolle Ambient Monitoring Biological Monitoring Hämoglobinaddukte als biochemische Effektmarker Humanes Hämoglobin Addukte von Alkylierenden Substanzen an Hämoglobin Der modifizierte Edman-Abbau Addukte alkylierender Substanzen in der Allgemeinbevölkerung Zielsetzung der Arbeit Stoffübersicht Acrylamid Technische Darstellung und Verwendung Eintrag in die Umwelt und Persistenz Expositionsquellen für die Allgemeinbevölkerung Entstehung von Acrylamid in der Maillard-Reaktion Metabolismus und Toxikokinetik Toxische Eigenschaften Acrylnitril Technische Darstellung und Verwendung Eintrag in die Umwelt und Persistenz Expositionsquellen für die Allgemeinbevölkerung Metabolismus und Toxikokinetik Toxische Effekte Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils am N- terminalen Valin Grundlage des Verfahrens Geräte, Chemikalien und Lösungen Geräte Chemikalien Lösungen Vergleichsstandards Probennahme und Probenaufbereitung Gewinnung des Erythrocytenhämolysats Isolierung des Globins Herstellung von Kalibrierstandards Derivatisierung des Globins Gaschromatographisch-massenspektrometrische Arbeitsbedingungen Analytische Bestimmung Kalibrierung Berechnung des Analysenergebnisses... 51

7 Inhaltsverzeichnis 6.8. Qualitätssicherung Beurteilung des Verfahrens Präzision Richtigkeit und Robustheit der Methode Nachweisgrenze Störeinflüsse Diskussion der Methode Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung Hintergrund Kollektivbeschreibung Ergebnisse des biochemischen Effektmonitorings Berechnung der in vivo-dosis und Abschätzung der täglichen Aufnahme an Acrylamid Risikoabschätzungen Diskussion Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Glycidamids am N-terminalen Valin Grundlage des Verfahrens Geräte, Chemikalien und Lösungen Geräte Chemikalien Lösungen Vergleichsstandards Probennahme und Probenaufbereitung Gewinnung des Erythrocytenhämolysats Isolierung des Globins Herstellung von Kalibrierstandards Durchführung des modifizierten Edman-Abbaus Acetonisierung des GAV-Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivates Derivatisierungsalternative: Acetylierung des GAV- Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivates Gaschromatographisch-massenspektrometrische Arbeitsbedingungen Analytische Bestimmung Kalibrierung Berechnung des Analysenergebnisses Qualitätssicherung Beurteilung des Verfahrens Präzision Richtigkeit und Robustheit der Methode Nachweisgrenze Störeinflüsse Herstellen von D 3 -CEV und D 3 -AAV als interne Standards Diskussion der Methode Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter sowie der Allgemeinbevölkerung Hintergrund...102

8 Inhaltsverzeichnis 9.2. Kollektivbeschreibung Ergebnisse der Hb-Addukt-Untersuchungen Diskussion Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS Hintergrund Geräte, Chemikalien und Lösungen Geräte Chemikalien Lösungen Vergleichsstandards Probennahme und Probenaufbereitung Gewinnung des Erythrocytenhämolysats Isolierung des Globins Herstellung von Kalibrierstandards Durchführung des modifizierten Edman-Abbaus Acetonisierung des GAV-Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivates Gaschromatographisch-massenspektrometrische Arbeitsbedingungen Analytische Bestimmung Kalibrierung Berechnung des Analysenergebnisses Nachweisgrenze Störeinflüsse Diskussion der Methode Zusammenfassung Summary Anhang Massenspektren und Zerfallsschemata der Analyten Einzelergebnisse der Untersuchungen Einzelergebnisse der Untersuchungen Biochemisches Effekt-Monitoring in der Allgemeinbevölkerung Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter sowie der Allgemeinbevölkerung Literatur...151

9 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis AA Acrylamid AAV N-2-Carbamoylethylvalin Abb. Abbildung ACN Acrylnitril ABS Acrylnitril-Butadien-Styrol AGS Ausschuss für Gefahrstoffe AL Arbeitslösung BAT Biologischer Arbeitsstoff-Toleranz-Wert BfR Bundesinstitut für Risikobewertung BLW Biologischer Leit-Wert C Grad Celsius CAS Chemical Abstract Service CEV N-2-Cyanoethylvalin d Tag (engl.: day) DG Deutsche orschungsgemeinschaft DNA Desoxyribonucleinsäure (engl.: acid) EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (engl.: acid) EKA Expositionsäquivalent für krebserzeugende Arbeitsstoffe EI Elektronenstoss-Ionisation EPA Environmental Protection Agency EU Europäische Union ev Elektronenvolt g Erdbeschleunigung GA Glycidamid GAV N-(R,S)-2-hydroxy-2-carbamoylethylvalin GC Gaschromatographie Gew.% Gewichtsprozent GSH Glutathion h Stunde (engl.: hour) Hb Hämoglobin IARC International Agency for Research on Cancer IPASUM Institut und Poliklinik für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin

10 Abkürzungsverzeichnis IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry ISTD Interner Standard kpa Kilopascal kda Kilo-Dalton LC/MS/MS Hochdruckflüssigkeitschromatographie, gekoppelt mit Tandem- Massenspektrometrie MAK Maximale Arbeitsplatzkonzentration mg Milligramm MS Massenspektrometrie ms Millisekunden MW Mittelwert m/z Verhältnis Masse zu Ladung NCI Negative Chemische Ionisierung NMR Nuklear-Magnetische Resonanz NR Nichtraucher NWG Nachweisgrenze PCB Polychlorierte Biphenyle PPITC Pentafluorphenylisothiocyanat PPTH Pentafluorphenylthiohydantoin pmol Picomol P W psi Q R RT s SAM SCE sd SIM t 1/2 TRK µg Mikrogramm V Volt Verteilungskoeffizient ktanol/wasser Pfund pro Quadratinch (engl.: pounds per square inch) Qualitätskontrolle Raucher Raumtemperatur Sekunde S-Adenosylmethionin Schwesterchromatidaustausch (engl.: sister chromatid exchange) Standardabweichung (engl.: standard deviation) Selected Ion Monitoring Halbwertszeit Technische Richt-Konzentration

11 Abkürzungsverzeichnis v/v WH ZV volumenbezogen (engl.: volume to volume) Weltgesundheitsorganisation (engl.: world health organisation) Zwischenverdünnung

12 Einleitung 1 1. Einleitung Der Mensch nimmt krebserzeugende chemische Substanzen am Arbeitsplatz oder aus der Umwelt auf. Wegen der fatalen Wirkung solcher Substanzen auf die menschliche Gesundheit kommt der arbeits- und umweltmedizinischen Prävention eine große Bedeutung zu. Bedingt durch die industrielle Entwicklung gelangt eine Vielzahl von Chemikalien in die Ökosphäre, die zu einer unvermeidbaren umweltbedingten Belastung des Menschen mit toxischen Verbindungen beitragen. Darüber hinaus spielen individuelle Lebensgewohnheiten wie z. B. der Konsum von Tabakerzeugnissen eine erhebliche Rolle für die Aufnahme gesundheitsschädlicher Stoffe in den rganismus. Hier sind vor allem alkylierende Substanzen zu nennen, die im Verbrennungsprozess entstehen und über den Zigarettenrauch inhalativ aufgenommen werden. Daneben werden krebserzeugende Substanzen immer wieder auch in Lebensmitteln nachgewiesen. Als Beispiele seien hier die heterozyklischen aromatischen Amine oder das erst kürzlich in Lebensmitteln entdeckte Acrylamid genannt. All diese Substanzen können somit beträchtlich zur Belastung der Allgemeinbevölkerung durch kanzerogene Stoffe beitragen. Erst vor wenigen Jahren hat sich neben der klassischen Arbeitsmedizin das ach Umweltmedizin etabliert, dessen Arbeitsschwerpunkt unter anderem die Ermittlung umweltbedingter Expositionen sowie die Abschätzung der daraus resultierenden Gesundheitsrisiken für die Allgemeinbevölkerung ist. Von zentraler Bedeutung für die Erfassung dieser Expositionen sind dabei zuverlässige, moderne chemische Analysenmethoden, die es erlauben, auch geringste Schadstoffkonzentrationen in biologischem Material nachzuweisen. ür krebserzeugende Substanzen kommt hier speziell dem Nachweis von Addukten dieser Schadstoffe mit körpereigenen Molekülen wie dem roten Blutfarbstoff Hämoglobin eine große Bedeutung zu, da somit die effektive innere Dosis auf individueller Basis bestimmt werden kann. Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Entwicklung, Validierung und Anwendung von Analysenverfahren zur Bestimmung der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid, dessen oxidativen Metaboliten Glycidamid sowie Acrylnitril im Blut der Allgemeinbevölkerung. Vor dem Hintergrund des krebserzeugenden Potentials dieser Stoffe und der Exposition über die Nahrung und/oder Tabakrauch ist dieser Nachweis aus umweltmedizinischer Sicht von großem Interesse.

13 Möglichkeiten der Expositionskontrolle 2 2. Möglichkeiten der Expositionskontrolle Das primäre Ziel der Arbeits- und Umweltmedizin ist die Prävention des Menschen vor Gesundheitsgefahren am Arbeitsplatz bzw. aus der Umwelt. Um den Schutz vor gesundheitsgefährdenden Stoffen zu gewährleisten, werden dabei verschiedene Strategien eingesetzt, die sich im Idealfall ergänzen sollten, um zu einer umfassenden Bewertung und gegebenenfalls einer Verminderung der individuellen Exposition zu kommen. Als Instrument zur Expositionskontrolle stützt sich die Arbeits- und Umweltmedizin im Wesentlichen auf 2 Säulen: das Ambient- und das Biological Monitoring. Beim Biological Monitoring unterscheidet man weiter zwischen dem Dosismonitoring, dem biochemischen Effektmonitoring und dem biologischen Effektmonitoring. Dabei steigt die prädiktive Bedeutung im Hinblick auf die gesundheitlichen Auswirkungen vom Dosismonitoring zum biologischen Effektmonitoring an. Abbildung 2-1 gibt einen Überblick über die Mess- und Kontrollstrategien in der Arbeits- und Umweltmedizin. Ambient monitoring äußere Belastung Biological monitoring Innere Biochemische Biologische Belastung Effekte Effekte Vorsorgeuntersuchungen Gesundheitliche Effekte Schadstoffe z.b. in: - Luft - Wasser - Boden - Nahrungsmittel - Hausstaub Schadstoffe Metaboliten Addukte -DNA -Proteine SCE Mikrokerne Bedeutung für die Risikoabschätzung Abbildung 2-1: Monitoring von Schadstoffen in der Arbeits- und Umweltmedizin (nach Angerer 1 ) 2.1. Ambient Monitoring Unter dem Begriff Ambient Monitoring versteht man ganz allgemein die Bestimmung der Schadstoffkonzentration in der Luft, in Staub, in Boden, in Wasser oder auch in Lebensmitteln. Die Erfassung der äußeren Belastung stellt dabei den ersten Schritt in

14 Möglichkeiten der Expositionskontrolle 3 der Strategie zur Prävention der Gesundheitsschäden durch chemische Substanzen dar. Am Arbeitsplatz wird dabei in der Regel die Konzentration des Schadstoffes in der Luft bestimmt, bei partikelgebundenen Schadstoffen kann auch der Gehalt im Staub gemessen werden. Zur Begrenzung des Schadstoffgehalts in der Luft wurden von der Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der Deutschen orschungsgemeinschaft (DG) mit der Maximalen Arbeitsplatzkonzentration (MAK-Wert) und der Technischen Richtkonzentration (TRK-Wert) zwei Grenzwerttypen festgelegt. Die maximal zulässige Arbeitsplatzkonzentration (MAK-Wert) ist dabei definiert als die höchstzulässige Konzentration eines Arbeitsstoffes als Gas, Dampf oder Schwebstoff in der Luft am Arbeitsplatz, die nach dem gegenwärtigen Stand der Kenntnis auch bei wiederholter und langfristiger, in der Regel täglich 8-stündiger Exposition, jedoch bei Einhaltung einer durchschnittlichen Wochenarbeitszeit von 40 Stunden im allgemeinen die Gesundheit der Beschäftigten nicht beeinträchtigt und diese nicht unangemessen belästigt. ür Substanzen, die beim Menschen oder im Tierversuch erwiesenermaßen zur Krebserzeugung führen, können keine MAK-Werte aufgestellt werden, da hier nicht von einer aus toxikologischer Sicht unbedenklichen Schwellenkonzentration ausgegangen werden kann. ür kanzerogene und mutagene Arbeitsstoffe werden daher vom Ausschuss für Gefahrstoffe (AGS) beim Bundesministerium für Arbeit und Sozialordnung so genannte Technische Richtkonzentrationen (TRK-Werte) aufgestellt. Der TRK-Wert stellt die geringstmögliche Luftkonzentration eines Stoffes am Arbeitsplatz dar, die nach dem jeweils aktuellen Stand der Technik erreicht werden kann 2. Auch für andere Bereiche des Ambient Monitorings gibt es in der Regel rechtlich bindende Grenzwerte: so sind für die Höchstmenge eines Schadstoffes in Trinkwasser oder Lebensmitteln beispielsweise Höchstwerte im Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz festgelegt. Dahingegen können für die Beurteilung von Hausstaubanalysen oder Luftanalysen im häuslichen Bereich lediglich sogenannte rientierungswerte des Umweltbundesamtes als Beurteilungsgrundlage dienen, die im Umweltsurvey gesammelt werden. Zusammenfassend stellt das Ambient Monitoring eine unerlässliche Methode der Primärprävention dar, da durch die Bestimmung der Schadstoffkonzentration in den

15 Möglichkeiten der Expositionskontrolle 4 uns umgebenden Medien wie Luft, Boden, Wasser oder Lebensmitteln Expositionsquellen identifiziert und Expositionen gezielt reduziert werden können. Als nachteilig erweist sich jedoch, dass es nicht möglich ist, aus den Messwerten des Ambient Monitorings Rückschlüsse auf das Gesundheitsrisiko des Einzelnen zu ziehen. So können z. B. durch Luftanalysen keine oral oder perkutan aufgenommenen Schadstoffmengen erfasst werden, so dass die tatsächlich vom Menschen aufgenommene Dosis weiter unbekannt bleibt Biological Monitoring Im Gegensatz zum Ambient Monitoring wird daher im Biological Monitoring die innere Belastung des Menschen bestimmt, um so zu einer Abschätzung des individuellen Gesundheitsrisikos zu gelangen. Unter Biomonitoring versteht man die systematische Sammlung biologischer Proben für die Analyse von Schadstoffen, Metaboliten oder spezifischen biologischen Effektparametern mit dem Ziel, die Exposition und das Gesundheitsrisiko exponierter Personen zu objektivieren. Dafür müssen die Messergebnisse mit Referenz- bzw. Grenzwerten verglichen werden Dosismonitoring Im Dosismonitoring wird dabei der Schadstoff selbst oder entsprechende Metaboliten in menschlichen Körperflüssigkeiten wie Blut oder Urin nachgewiesen. Ähnlich des MAK-Wertes, der die maximale äußere Belastung an Arbeitsplätzen regelt, werden von der DG auch für das biologische Material so genannte Biologische Arbeitsstoff-Toleranzwerte (BAT-Werte) aufgestellt. Diese entsprechen definitionsgemäß der beim Menschen höchstzulässigen Quantität eines Arbeitsstoffes oder seiner Stoffwechselprodukte oder die dadurch ausgelöste Abweichung eines biologischen Indikators von seiner Norm, die nach dem gegenwärtigen Kenntnisstand im Allgemeinen die Gesundheit auch bei regelmäßiger Exposition nicht beeinträchtigt 2. Derzeit sind von der DG für 45 Stoffe und Stoffgruppen BAT-Werte veröffentlicht 2,3. Als geeignete Untersuchungsmaterialien werden dabei in erster Linie Urin, Vollblut, Serum oder Plasma angesehen. Da für krebserzeugende Arbeitsstoffe keine toxikologisch unbedenkliche Schwellendosis festgelegt werden kann, können diese Stoffe auch nicht mit einem BAT-Wert belegt werden. Bei Vorliegen einer ausreichenden Datenlage ist es

16 Möglichkeiten der Expositionskontrolle 5 möglich, aus der Korrelation von Luftanalysen (äußere Belastung) und begleitenden Biomonitoring-Daten (innere Belastung) für diese Substanzen Expositionsäquivalente für krebserzeugende Arbeitsstoffe (EKA) abzuleiten. Aus Ihnen geht hervor, welche innere Belastung sich bei ausschließlich inhalativer Aufnahme eines Schadstoffes ergeben würde. Als EKA-Wert wird dabei der Wert festgelegt, der dem TRK-Wert entspricht. Bislang konnten solche EKA-Korrelationen für 17 krebserzeugende Arbeitsstoffe aufgestellt werden 2. Bei ehlen einer entsprechenden Datenlage kann für krebserzeugende Arbeitsstoffe ein Biologischer Leitwert (BLW-Wert) abgeleitet werden. Biologische Leitwerte werden nur für solche gefährlichen Stoffe benannt, für die aufgrund ihrer kanzerogenen Eigenschaften keine arbeitsmedizinisch-toxikologisch begründeten BAT-Werte aufgestellt werden können und keine ausreichende Datenlage für eine EKA-Korrelation vorliegt. Der BLW orientiert sich dabei an den arbeitsmedizinischen und arbeitshygienischen Erfahrungen im Umgang mit dem gefährlichen Stoff unter Heranziehung toxikologischer Erkenntnisse. Sowohl durch Einhaltung des biologischen Leitwertes als auch der EKA-Werte kann dabei allerdings das Risiko einer Beeinträchtigung der Gesundheit nicht ausgeschlossen werden, es wird jedoch auf das geringste technisch realisierbare Maß minimiert. Als Vergleichsgrundlage für arbeits- oder umweltmedizinische Belastungen dienen immer auch entsprechende Referenzwerte. Der Refenzwert für einen chemischen Stoff in einem Körpermedium (z. B. Blut, Urin) ist ein Wert, der aus der Untersuchung einer möglichst repräsentativen Stichprobe der Allgemeinbevölkerung abgeleitet werden kann. Dabei wird als Referenzwert in der Regel das 95. Perzentil der Messwerte einer Stoffkonzentration in dem entsprechenden Körpermedium der Referenzpopulation festgelegt. Dieser Referenzwert ist demnach kein toxikologisch begründeter Schwellenwert. Der Referenzwert beschreibt die unvermeidbare Hintergrundbelastung der Allgemeinbevölkerung durch diese Substanz. Sie kann zusätzlich durch Alter, Geschlecht oder individuelle Lebensgewohnheiten wie z. B. das Rauchen beeinflusst werden. Demnach kann auf der Basis dieses Wertes abgeschätzt werden, ob im Einzelfall eine zusätzliche Belastung gegenüber einem Schadstoff (am Arbeitsplatz oder aus der Umwelt) vorliegt.

17 Möglichkeiten der Expositionskontrolle Biochemisches Effektmonitoring Besonders bei krebserzeugenden Substanzen ist es vorteilhaft, nicht nur die aufgenommene Schadstoffdosis, sondern auch eine auf molekularer Ebene auftretende Wirkung im Körper zu erfassen. Genotoxische Substanzen können in der Regel mit nukleophilen Zentren der DNA regieren und so ein promutagenes Addukt bilden. Die so entstandenen Addukte können als initialer Schritt der Krebsentstehung angesehen werden und stehen damit dem effektiven Wirkprinzip der kanzerogenen Stoffe näher als die Bestimmung der inneren Dosis. Als biochemisches Effektmonitoring wird demnach die Quantifizierung von Reaktionsprodukten mutagener Substanzen mit der Erbsubstanz bezeichnet 1. Die Isolierung ausreichender Mengen an DNA und die vergleichsweise geringen Adduktkonzentrationen stellen in diesem Zusammenhang jedoch erhebliche Schwierigkeiten dar und verhindern die routinemässige Anwendung derartiger Analysen auf breite Teile der Bevölkerung. Nachteilig wirkt sich darüber hinaus auch die kontinuierliche Reparatur der modifizierten DNA-Basen durch entsprechende körpereigene Reparaturenzyme aus, die zu einer relativ schnellen Abnahme der nachweisbaren Adduktspiegel führt. Eine retrospektive Abschätzung der aufgenommenen Schadstoffmenge und des damit verbundenen Risikos ist demnach oftmals nicht möglich. Auf der Grundlage der Bindung von Ethylenoxid an Hämoglobin in Mäusen wurde bereits 1974 von Ehrenberg et al. das Konzept der Tissue Dose, also der effektiven inneren Dosis entwickelt 4. Mit Hilfe von Tierversuchen konnte in einer Vielzahl von Untersuchungen in der olge gezeigt werden, dass die kovalente Bindung kanzerogener Substanzen an Proteine (wie beispielsweise Hämoglobin) proportional zur Bindung an die DNA erfolgt, speziell im Niedrigdosis-Bereich 5,6,7,8,9. Diese Beobachtung konnte später auch durch arbeitsmedizinische Untersuchungen am Menschen bestätigt werden 10. Im Allgemeinen werden daher insbesondere Hämoglobin-Addukte als geeignetes Surrogat für DNA-Addukte betrachtet 1,11. Aus diesen Gründen wird in der Praxis ein Biochemisches Effektmonitoring überwiegend mit Hämoglobin-Addukten durchgeführt. Hämoglobin ist dabei in ausreichenden Mengen verfügbar und lässt sich leicht aus Vollblutproben isolieren. Da für Hämoglobin-Addukte keine Reparaturmechanismen im Körper vorhanden sind, können diese Addukte die kumulative Exposition des Menschen über einen

18 Möglichkeiten der Expositionskontrolle 7 längeren Zeitraum reflektieren. Die Lebensdauer humaner Erythrocyten beträgt beim Erwachsenen ca. 120 Tage, so dass durch die sich daraus ergebende Anreicherung der Addukte eine Überwachung chronischer Niedrigexpositionen möglich ist. Andererseits können dabei in arbeitsmedizinischen Untersuchungen auch länger zurückliegende Expositionen noch aufgedeckt werden Biologisches Effektmonitoring Als biologisches Effektmonitoring wird die Messung erster Reaktionen des Körpers auf die Schadstoffbelastung bezeichnet. Diese Reaktionen reichen von Veränderungen in Enzymaktivitäten (wie z. B. der δ-aminoläuvulinat-dehydratase infolge einer Bleibelastung) bis hin zu genetischen Parametern wie Chromosomenaberrationen, Mikrokernen, Schwesterchromatidaustauschraten (SCE) oder DNA-Strangbrüchen. Der größte Nachteil dieser Nachweisverfahren ist die geringe Substanzspezifität, da die nachgewiesenen Effekte in der Regel nicht eindeutig auf die Exposition gegenüber einer spezifischen Substanz zurückzuführen sind. Zudem erschweren große interindividuelle Schwankungen hier die Aussagekraft dieser Untersuchungen. Demnach sind zuverlässige Aussagen für das biologische Effektmonitoring nur in größeren Studien auf kollektiver Basis und in Verbindung mit einem substanzspezifischen Dosismonitoring möglich.

19 Hämoglobinaddukte als biochemische Effektparameter 8 3. Hämoglobinaddukte als biochemische Effektmarker 3.1. Humanes Hämoglobin Humanes Hämoglobin ist ein erythrocytäres Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 64 kda, das aus vier Polypeptidketten besteht, von denen jeweils 2 Ketten identisch sind. Die unktion des Hämoglobins besteht dabei in der Bindung und dem Transport von Sauerstoff bzw. Kohlendioxid im Blut. Jede der vier Ketten besitzt eine Häm-Gruppe und eine Sauerstoffbindungsstelle. Hämoglobin A, der beim Erwachsenen vorherrschende Hämoglobintyp, besteht dabei aus zwei α-ketten, die aus je 141 Aminosäuren gebildet werden und zwei β-ketten aus 146 Aminosäuren 12. Alle Ketten tragen am N-terminalen Ende die Aminosäure Valin, deren freie Aminofunktion ein nukleophiles Zentrum darstellt, welches mit elektrophilen Substanzen reagieren kann. Die Quartärstruktur von humanem Hämoglobin A ist in Abbildung 3-1 dargestellt. Abbildung 3-1: Quartärstruktur von humanem Hämoglobin A 13.

20 Hämoglobinaddukte als biochemische Effektparameter 9 eten haben besondere Hämoglobine. Den Hauptanteil des Hämoglobins in den letzten zwei Dritteln der fetalen Phase stellt das Hämoglobin dar, das die Untereinheitenstruktur α 2 γ 2 besitzt. Diese besondere Struktur erhöht die Sauerstoffaffinität des fetalen Hämoglobins gegenüber dem mütterlichen Hämoglobin. Auf diese Weise wird die Übertragung von Sauerstoff und damit die Atmung des ötus erst möglich 12. Da die menschlichen Erythrocyten keinen Zellkern besitzen und demnach nicht teilungsfähig sind, ist Ihre Lebensdauer im Blutkreislauf begrenzt: beim Erwachsenen beträgt die durchschittliche Lebensdauer des Erythrocyten ca. 120 Tage, bevor der Abbau in der Milz erfolgt 14. Beim ötus ist die Lebensdauer des Erythrocyten erheblich kürzer: Untersuchungen zeigten, dass hier der Abbau bereits nach Tagen erfolgt Addukte von Alkylierenden Substanzen an Hämoglobin Die Enstehung von kovalent gebundenen Addukten an die Proteinkette des Hämoglobins setzt ganz allgemein die Verfügbarkeit von reaktiven elektrophilen Verbindungen im Erythrocyten voraus, d. h. die Substanz muss in der Lage sein, die Barriere der Zellmembran zu durchdringen. Dies stellt auch Anforderungen an die Stabilität der Substanz unter physiologischen Bedingungen. Die Nukleophilie der Aminosäuren-Seitenketten, die mit der Elektrophilen Substanz reagieren können, ist dabei verknüpft mit der unprotonierten orm der Seitenkette und hängt damit vom entsprechenden pk a -Wert ab. Die pk a -Werte der stark basischen Aminogruppen in der Seitenkette von Lysin oder Arginin liegen zum Beispiel im Bereich von pk a =9,5 12,5, so dass diese Seitenketten unter physiologischen Bedingungen (ph=7,4) fast vollständig in protonierter orm vorliegen und damit als nukleophile Zentren ausscheiden. ür drei Aminosäuren im Hämoglobin liegt der pk a -Wert der Seitenkette im Bereich des Blut-pH-Wertes, so dass die Bildung eines Adduktes möglich wird: dies sind die N-terminale Aminosäure Valin, das ringgebundene Stickstoff-Atom des Histidins sowie die Thiol-Gruppe des Cysteins. Aufgrund eines niedrigeren pk a -Wertes (pk a =6,8 gegen pk a =7,8) erweist sich das N-terminale Valin der β-kette dabei als etwas reaktiver gegenüber elektrophilen Substanzen als das N-terminale Valin der α- Kette 16.

21 Hämoglobinaddukte als biochemische Effektparameter 10 Prinzipiell können die Addukte von Alkylantien an diesen 3 Aminosäuren des Hämoglobin-Moleküls als Biochemische Effektmarker eingesetzt werden. In der Praxis erfolgt die Analyse jedoch in der Regel am N-terminalen Valin, da der Nachweis durch den modifizierten Edman-Abbau erheblich erleichtert wird und Standards zur Quantifizierung leichter zugänglich sind. Hinsichtlich der ähigkeit zur Anbindung an körpereigene Makromoleküle unterscheidet man die direkten Alkylantien, die per se mit Makromolekülen regieren können von den indirekten Alkylantien, die erst im Laufe ihres Stoffwechsels zu elektrophilen Substanzen metabolisiert werden (wie etwa Nitrosamine). Tabelle 3-1 gibt eine kleine Übersicht über Alkylierende Stoffe und den Reaktionsmechanismus der Addukt-Bildung. Alkylierende Strukturformel Mechanismus Substanz Alkylhalogenide R X Epoxide R 2 R 2 R 1 R 1 Alkylnitrosamide; Alkylnitrosamine R R 1 N N NH 2 N N R 2 R N + N Dialkylsulfate; Alkylalkansulfonate S S R 1 R 2 R1 α,β-ungesättigte A Carbonylverbindungen R mit A= elektronenziehende Gruppe (N 2, S 2 R, CNH2 ) Tabelle 3-1: Alkylierende Substanzen 16 oder R + R N + N oder R + R 2 Nukleophile Substitution 1,4-Addition (Michael-Addition)

22 Hämoglobinaddukte als biochemische Effektparameter 11 α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen reagieren dabei mit der freien Aminofunktion im Sinne einer Additionsreaktion (sog. Michael-Addition). Der Mechanismus dieser Addukt-Bildung ist in Abbildung 3-2 beispielhaft für Acrylamid dargestellt. ür Acrylamid bildet sich demnach N-2-Carbamoylethylvalin (abgekürzt AAV für Acrylamid-Valin), das strukturell eng verwandte Acrylnitril bildet N-2-Cyanoethylvalin (abgekürzt CEV). Mesomere Grenzformel - H 2 C Acrylamid + H 2 C NH 2 NH 2 Globin NH 2 H 3 C CH 3 N-terminales Valin der Globin-Kette H 2 Globin NH NH 2 H 3 C CH 3 N-2-Carbamoylethylvalin (AAV) Abbildung 3-2: Mechanismus der Addukt-Bildung von Acrylamid am N-terminalen Valin des Hämoglobins. Einer der größten Vorteile in der Bestimmung von Addukten am N-terminalen Valin liegt darin, dass diese Addukte chemisch stabil sind. Im Gegensatz zu den meisten anderen Blutproteinen wie z. B. Serumalbumin baut sich Hämoglobin im Blutkreislauf nach einer Kinetik nullter rdnung ab. Diese Kinetik nullter rdnung lässt sich durch die Stabilität des Hämoglobins im Erythrocyten erklären, die durch die Addukt- Bildung nicht beeinflusst wird, wie unter anderem in Untersuchungen an

23 Hämoglobinaddukte als biochemische Effektparameter 12 aromatischen Aminen gezeigt werden konnte. 17,18,19. Da das Hämoglobin im Erythrocyten stabil ist, ist sein Abbau konsequenterweise lediglich durch die Lebensdauer des Erythrocyten bestimmt. Dies bedeutet, dass durch die Messung der Konzentration der Hämoglobin-Addukte die Expositionsdosis der alkylierenden Substanz über die mittlere Lebensdauer des Erythrocyten (ca. 120 Tage) bestimmt werden kann 17. In Verbindung mit dem ehlen von Reparaturmechanismen für Hämoglobin-Addukte eignet sich diese Bestimmung somit in idealer Weise zur Erfassung von umweltbedingten Niedrigexpositionen gegenüber alkylierenden Substanzen wie Acrylamid aus der Nahrung Der modifizierte Edman-Abbau Die selektive Abspaltung von N-terminalen Aminosäuren wurde ursprünglich von Per Edman zur Sequenzierungsanalyse von Proteinen entwickelt und ist in ihrer automatisierten orm auch heute noch die Standard-Analysenmethode für Proteine. Der große Nutzen des Nachweises von Hämoglobin-Addukten als Mass für die innere Dosis wurde von Ehrenberg et al. bereits 1974 erkannt 4. Die damit verbundene, äußerst aufwendige Analytik verhinderte jedoch zunächst die breitere Anwendung dieser Methode. Mit der Entwicklung des modifizierten Edman-Abbaus durch Törnqvist et al. gelang 1986 ein großer Durchbruch, der die zuverlässige Bestimmung von Hämoglobin- Addukten am N-terminalen Valin mit Hilfe einer GC/MS-Methode praktikabel machte 20. Dabei wurde das ursprünglich als Sequenzierungsreagenz eingesetzte Phenylisothiocyanat durch Pentafluorphenylisothiocyanat (PPITC) ersetzt. Durch die Verwendung eines Massenspektrometers mit negativer chemischer Ionisation (NCI) konnte die Nachweisempfindlichkeit dadurch um mehrere Zehnerpotenzen gesteigert werden. Der modifizierte Edman-Abbau unterscheidet sich dabei vor allem in der Reaktionsführung. Während beim klassischen Edman-Abbau die elektrophile Addition des Phenylisothiocyanats im wässrig-alkalischen Milieu bei ph-werten von 9 10 durchgeführt wird, arbeitet der modifizierte Edman-Abbau im nicht-wässrigen Medium bei einem annähernd neutralen ph-wert. Die Bildung des Thiocarbamoylderivats (siehe Abbildung 3-3) bleibt dabei von der Änderung des ph-werts unbeeinflusst, da sowohl das unsubstituierte Valin (pk s =6,8

24 Hämoglobinaddukte als biochemische Effektparameter 13 7,8) als auch addukt-tragendes, endständiges Valin in diesem ph-bereich deprotoniert vorliegen. N C S + R H 3 C CH 3 NH NH Globin NH S R CH 3 N CH 3 NH Globin PPITC Addukt-tragendes Valin Thiocarbamoylderivat Abbildung 3-3: Reaktion des addukt-tragenden N-terminalen Valins mit Pentafluorphenylisothiocyanat zu einem Thiocarbamoylderivat. Die anschließende Zyklisierungsreaktion (siehe Abbildung 3-4) erfolgt jedoch bevorzugt bei addukt-tragenden Valinen, da alkylierte Aminofunktionen aufgrund des elektronenliefernden Substituenten die negative Ladung am Schwefelatom stabilisieren können, wodurch der Ringschluß begünstigt wird. In Verbindung mit dem Verzicht auf die beim klassischen Edman-Abbau übliche Säurezugabe (ph 1 2) erreicht man so eine selektivere Abspaltung von addukt-tragenden Valinen. Da der Gehalt an addukt-tragenden Valinen mehrere Größenordnungen unter der Konzentration an unsubstituiertem, N-terminalen Valin in Hämoglobin liegt, erlaubt diese Vorgehensweise bereits eine deutliche Verminderung des analytischen Störuntergrunds. Das entstandene Thiazolinon-Kation verliert seine Ladung durch Deprotonierung.

25 Hämoglobinaddukte als biochemische Effektparameter 14 R CH 3 R CH 3 NH N CH 3 NH N + CH 3 S NH S - NH Globin Globin Thiocarbamoylderivat R H 3 C R H 3 C N + CH 3 N CH 3 Globin NH S -H + + H + N S Thiazolinonderivat Abbildung 3-4: Zyklisierungsreaktion des Thiocarbamoylderivates zu einem Thiazolinonderivat unter Abspaltung der Globinkette. Unter Temperaturerhöhung lagert sich das Thiazolinonderivat dann in ein stabileres Pentafluorphenylthiohydantoin um, welches letztlich zur massenspektrometrischen Identifizierung der Addukte eingesetzt wird (Abbildung 3-5). Mit dem Rest R enthält dieser Analyt somit die Information, welche alkylierende Substanz am N-terminalen Valin des Hämoglobins gebunden war. N R N S H 3 C CH 3 + H 2 -H 2 NH R N S H 3 C CH 3 H + H 2 -H 2 S R CH 3 N CH 3 N Thiazolinon-Derivat Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivat (Analyt) Abbildung 3-5: Umlagerung des Pentafluorphenyliminothiazolinonderivates in ein Pentafluorphenylthiohydantoinderivat (Analyt).

26 Hämoglobinaddukte als biochemische Effektparameter Addukte alkylierender Substanzen in der Allgemeinbevölkerung Die Durchführung des modifizierten Edman-Abbaus setzt eine vergleichsweise aufwendige Probenvorbereitung voraus. Um Hämoglobinaddukte alkylierender Substanzen in der Allgemeinbevölkerung erfassen zu können, werden darüber hinaus Nachweisgrenzen im ng/l-bereich benötigt. Dementsprechend selten wurden derartige Studien bisher an unbelasteten Personengruppen durchgeführt. Unter Anwendung des modifizierten Edman-Abbaus konnten jedoch in der Vergangenheit vor allem unter Verwendung eines GC-Triple-Quadrupol-Systems im negativen chemischen Ionisierungs-Modus in einigen Arbeiten Hintergrundbelastungen der Allgemeinbevölkerung gegenüber verschiedensten Alkylantien aufgedeckt werden. Tabelle 3-2 gibt einen kleinen Überblick über die bisher in unbelasteten Personen nachgewiesenen Addukt-Gehalte. Methylierende Agentien Ethylenoxid / Ethen Addukt Gruppe Median-Gehalte Ref. N-Methyl-Valin NR (n=37) 1162 pmol/g Globin 21 R (n=32) 1425 pmol/g Globin NR (n=10) 229 pmol/g Globin 22 R (n=10) 272 pmol/g Globin N-Hydroxyethyl- NR (n=37) 47 pmol/g Globin 21 Valin R (n=32) 144 pmol/g Globin NR (n=24) 50 pmol/g Globin 23 R (n=26) 120 pmol/g Globin NR (n=10) 14 pmol/g Globin R (n=10) 128 pmol/g Globin NR (n=14) 12,9 pmol/g Globin 24 R (1 Pack/Tag) (n=18) 242 pmol/g Globin R (2 Pack/Tag) (n=14) 382 pmol/g Globin Acrylnitril N-Cyanoethyl- NR (n=14) 4,9 pmol/g Globin 24 Valin R (1 Pack/Tag) (n=18) 252 pmol/g Globin R (2 Pack/Tag) (n=14) 364 pmol/g Globin NR (n=8) < 2 pmol/g Globin 25 R (n=10) 106 pmol/g Globin Acrylnitril N-Cyanoethyl- NR (n=18) 0,76 pmol/g Globin 26 Valin Passivraucher (n=3) 1,1 pmol/g Globin Partyraucher (n=3) 8,6 pmol/g Globin Acrylamid N-Carbamoylethyl-Valin NR (n=8) 31 pmol/g Globin 25 R (n=10) 116 pmol/g Globin Tabelle 3-2: Beispiele für die Verwendung von Hämoglobin-Addukten als Biomarker in der Allgemeinbevölkerung (NR = Nichtraucher, R = Raucher). 22

27 Hämoglobinaddukte als biochemische Effektparameter 16 Dabei konnten Hämoglobin-Addukte von Methylierenden Agentien, Ethylenoxid oder Acrylamid auch in nichtrauchenden Gruppen der Allgemeinbevölkerung nachgewiesen werden. Im alle des Methyl- und Hydroxyethylvalins werden diese Hintergrundbelastungen auf endogene biochemische Prozesse zurückgeführt. So können endogene Methylantien des C1-Stoffwechsels wie S-Adenosylmethionin (SAM) für die Hintergrundbelastung durch N-Methylvalin verantwortlich sein. ür die Hintergrundbelastung durch N-Hydroxyethylvalin wurde eine mögliche Entstehung von Ethen (bzw. Ethylenoxid nach metabolischer Aktivierung) in der Lipidperoxidation bzw. durch reduzierende Darmbakterien diskutiert 27. Da Ethylenoxid auch in Tabakrauch enthalten ist 28, werden die Adduktgehalte stark durch das Rauchverhalten beeinflusst. Addukte des Acrylnitrils konnten dagegen bisher hauptsächlich bei Rauchern nachgewiesen werden, die Werte für Nichtraucher lagen in der Regel im Bereich der Nachweisgrenze der angewandten Methoden. Die Erfassung dieses Addukts kann demnach als hochspezifischer und empfindlicher Parameter für die Abschätzung der individuellen Rauchgewohnheiten in der Umweltmedizin genutzt werden. Zum Nachweis von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids in unbelasteten, nichtrauchenden Personen der Allgemeinbevölkerung lag zu Beginn dieser Arbeit nur eine Publikation vor 25. Diese Veröffentlichung gab seinerzeit den Anlass, nach möglichen Expositionsquellen für Acrylamid zu suchen und führte in der olge zur Entdeckung, dass Acrylamid im Rahmen der Maillard-Reaktion bei der Erhitzung wasserarmer, stärkereicher Lebensmittel entstehen kann 29,30 (siehe Kap ). Die Anwendung der Methode auf größere Bevölkerungsgruppen sowie weiterführende Daten zur Hintergrundbelastung der Allgemeinbevölkerung in Deutschland fehlten zu Beginn dieser Arbeit.

28 Zielsetzung der Arbeit Zielsetzung der Arbeit Im April 2002 wurde von einer schwedischen Arbeitsgruppe der Nachweis geführt, dass die kanzerogene Substanz Acrylamid beim Erhitzen verschiedenster stärkehaltiger Lebensmittel entstehen kann 30. Die in der olge in handelsüblichen Lebensmitteln nachgewiesenen Mengen führten zu einer heftigen Debatte über die vom Menschen tatsächlich aufgenommenen Dosen und die damit verbundenen Gesundheitsgefahren. Im Rahmen der Expositionskontrolle bei Gefahrstoffbelastungen nimmt das biochemische Effektmonitoring eine besondere Stellung ein. Hämoglobin-Addukte als Parameter des biochemischen Effektmonitorings liefern in dem Prozess von der äußeren Exposition zum Gesundheitsschaden aufgrund ihrer Spezifität und Empfindlichkeit unter allen derzeit verfügbaren Messgrößen das beste Mass, um die durch einen Gefahrstoff bedingte Gesundheitsgefährdung zu bewerten. Mit Hilfe dieser Parameter ist es möglich, den Beitrag bestimmter Expositionen zur Gesamtbeanspruchung und damit zur Erhöhung des Risikos abzuschätzen. Dabei kann das Risiko des Einzelnen relativ zu dem durchschnittlichen Risiko der Allgemeinbevölkerung eingeschätzt werden 31. Vor diesem Hintergrund war es die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, Mit Hilfe des N-Alkyl-Edman-Verfahrens eine Methode zu etablieren, mit der die Hintergrundbelastung der Allgemeinbevölkerung gegenüber den umweltmedizinisch relevanten krebserzeugenden Substanzen Acrylamid und Acrylnitril erfasst werden kann Ein Verfahren zu entwickeln, um auch die Hämoglobin-Addukte des oxidativen Metaboliten von Acrylamid (Glycidamid) erfassen zu können, um so einen Beitrag zur Aufklärung des Metabolismus von Acrylamid beim Menschen leisten zu können Aus dem Verhältnis der Hämoglobin-Addukte von Glycidamid und Acrylamid beim Menschen und den Ergebnissen von Tierversuchen mögliche Rückschlüsse in Bezug auf das Krebsrisiko durch die tägliche Aufnahme von Acrylamid zu ziehen

29 Zielsetzung der Arbeit 18 In einem abschließenden Schritt sollten die entwickelten Methoden auf geeignete Kollektive angewandt werden mit dem Ziel, die umweltbedingte Belastung der deutschen Bevölkerung durch Acrylamid besser bewerten zu können.

30 Stoffübersicht Stoffübersicht 5.1. Acrylamid Acrylamid H 2 C NH 2 IUPAC Acrylamid CAS-Nummer Summenformel C 3 H 5 N Molekulargewicht [g/mol] 71,078 Eigenschaften Weisser, kristalliner eststoff bei RT Dichte 30 C 1,127 g/cm 3 Schmelzpunkt 84 84,5 o C Siedepunkt 125 o C bei 3,3 Pa Dampfdruck 0,9 Pa bei 25 C log P W - 0,67 bis -1,65 Wasserlöslichkeit 2,155 g/l bei 30 C TRK-Wert 0,06 mg/m 3 (krist. Acrylamid) 0,03 mg/m 3 (andere) Einstufungen MAK-Kommission Hautresorbierend H Krebserzeugend Kategorie 2 Keimzellmutagen Kategorie 2 Tabelle 5-1: Datenblatt Acrylamid Technische Darstellung und Verwendung Acrylamid wurde erstmals 1893 in Deutschland synthetisiert, die kommerzielle Produktion begann ab Grosstechnisch wird Acrylamid durch katalytische Hydrierung von Acrylnitril gewonnen. Bei diesem Prozess wird eine Acrylnitril/Wasser-Mischung unter Verwendung eines Kupfer-Katalysators in einem estbettreaktor auf C erhitzt. Nicht abreagiertes Acrylnitril wird abdestilliert und so dem Prozeß wieder zugeführt. Mit diesem Verfahren werden wässrige Lösungen mit einem Gehalt von % hergestellt. Alternativ kann Acrylamid auch durch schwefelsaure Hydrolyse von Acrylnitril hergestellt werden. Da hier jedoch unerwünschte Nebenreaktionen auftreten können

31 Stoffübersicht 20 und die Umsetzungsrate geringer ist, hat sich seit Anfang der 70er Jahre das katalytische Verfahren durchgesetzt 32. Ungefähr 99,9 % des innerhalb der EU hergestellten monomeren Acrylamids wird zur Herstellung von Polyacrylamiden eingesetzt. Polyacrylamide finden als Dispersionsund lockungsmittel unter anderem in der Trinkwasseraufbereitung Anwendung. Darüber hinaus können hochmolekulare Polyacrylamide chemisch durch Einführung nicht-ionischer, anionischer oder kationischer Gruppen für verschiedene Zwecke modifiziert werden und demnach als Ionentauscher, Verdickungsmittel oder Hilfsmittel in der Papierindustrie eingesetzt werden. Der Restgehalt an monomerem Acrylamid in den verwendeten Polyacrylamiden darf dabei 0,1 Gew.% nicht überschreiten, da sonst eine Einstufung als Klasse 2-Kanzerogen nach EU-Richtlinie 88/379/EEC erfolgen muss. Bei Polyacrylamiden, die für die Trinkwasseraufbereitung vorgesehen sind, darf der Restgehalt an monomerem Acrylamid nur 0,025 % betragen. Daneben kommt Acrylamid bei der Synthese von arben, als Co-Polymer für verschiedene Kunststoffe (unter anderem bei der Herstellung von Brandschutzglas) sowie als Abdichtmittel in der Bauindustrie zum Einsatz. In der orschung wird Acrylamid zur Herstellung von Polyacrylamidgelen für die Elektrophorese verwendet 33. Die Jahresproduktion an Acrylamid in der Europäischen Union wird auf Tonnen geschätzt. Im Jahre 1991 betrug die Produktion in Deutschland Tonnen, von denen Tonnen exportiert wurden Eintrag in die Umwelt und Persistenz Chemikalien können potentiell während jeder Phase ihres Lebenszyklus in die Umwelt emittiert werden. ür Acrylamid sind die wesentlichen Phasen die Produktion von Acrylamid selbst sowie die Produktion und Verwendung von Polyacrylamiden. Eine wichtige Eintragsquelle in die Umwelt stellt dabei auch die Verwendung von Acrylamid-basierten ugendichtungsmitteln in der Bauindustrie dar. Aufgrund der sehr guten Wasserlöslichkeit von Acrylamid steht dabei der Eintrag in wässrige Kompartimente im Vordergrund. Von der Europäischen Union wurde die europaweite Emission der produzierenden Industrie in Wasser auf 6,3 kg

32 Stoffübersicht 21 Acrylamid/Tag abgeschätzt. Demgegenüber wird nur wenig Acrylamid in die Luft emittiert: die Schätzungen liegen hier bei 0,38 kg/tag 32. Aus der Anwendung von Polyacrylamiden in der Trinkwasseraufbereitung wurde in einem worst case Szenario in Deutschland abgeschätzt, dass maximal 5 kg Acrylamid/Jahr in das Trinkwasser gelangen können 34. Nach Schätzungen der Europäischen Union kann die Acrylamid-Konzentration im Trinkwasser nach Aufbereitung durch Polyacrylamid maximal 0,125 µg/l betragen. Insgesamt wurde für die europaweite Gesamtemission von Acrylamid aus allen Bereichen, von der Produktion bis zur industriellen Verwendung von Polyacrylamiden ein Wert von 280 kg/tag in Wasser und 0,38 kg/tag in die Luft abgeschätzt 32. Die Verwendung von Acrylamid-basierten ugendichtungsmitteln in der Konstruktion von Tunneln in Schweden und Norwegen hat in der Vergangenheit unbeabsichtigt zu erheblichen Emissionen geführt. Durch massiven Einsatz dieser Dichtungsmittel (bis zu Tonnen) an einer schwedischen Baustelle kam es zu Einträgen von Acrylamid in nahegelegene lüsse, Weiher und Brunnen. Dabei konnten einige Wochen nach der Anwendung noch Konzentrationen im Wasser bis zu 92 mg/l gemessen werden. In der olge kam es auch zu Vergiftungserscheinungen an Rindern, die nahe der Tunnelbaustelle grasten 35. In Wasser wird Acrylamid generell nach einer Verzögerungsphase gut biologisch abgebaut. Es wurde von der Europäischen Union als gut biologisch abbaubar eingestuft. Die Geschwindigkeitskonstante für den Bioabbau von Acrylamid in der Kläranlage wurde mit 1 h -1 bestimmt, für den Abbau in berflächenwasser beträgt diese Konstante 4,7 x 10-2 d -1. Eine Akkumulation von Acrylamid im Wasser ist somit nicht zu befürchten 32. In verschiedenen berflächenwässern wurde der Abbau von 0,5 mg/l Acrylamid untersucht. Dabei zeigte sich nach einer Verzögerungsphase zwischen 2 und 5 Tagen in der olge ein kompletter Abbau des Acrylamids innerhalb von 5 10 Tagen. ür den raschen Abbau ist die mikrobielle Aktivität der berflächenwässer verantwortlich, vor allem die Bakterien der Arten Arthrobacter und Rhodococcus sind dabei in der Lage, Acrylamid als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle zu nutzen 32. In der Atmosphäre wird Acrylamid durch Reaktion mit Hydroxylradikalen schnell abgebaut. Die Halbwertszeit für die Reaktion mit Hydroxylradikalen bei Raumtemperatur wurde mit 8,3 Stunden berechnet. Aufgrund seiner hohen

33 Stoffübersicht 22 Wasserlöslichkeit erscheint es jedoch wahrscheinlich, dass Acrylamid in der Atmosphäre durch Regen ausgewaschen wird 32. Acrylamid wird auch im Erdreich leicht abgebaut, wobei die Abbaurate von der Art und dem ph-wert des Bodens sowie der Temperatur abhängt. ptimaler Abbau wurde in alkalischen Böden bei höheren Temperaturen beobachtet. Die Halbwertszeit für die Zersetzung von Acrylamid im Erdboden wird mit ca. 30 Tagen abgeschätzt 32. Aus dem niedrigen log K W -Wert geht bereits hervor, dass Acrylamid ein geringes Potential zur Bioakkumulation besitzt. In verschiedenen Studien wurde belegt, dass Acrylamid in ischen einen sehr niedrigen Biokonzentrationsfaktor besitzt. Allgemein erfolgt in den ischen eine sehr schnelle Aufnahme nach der Expositition bis ein steady state erreicht wird. Die Elimination erfolgt biphasisch, wobei Acrylamid unverändert ausgeschieden wird Expositionsquellen für die Allgemeinbevölkerung Im April 2002 wurde von einer schwedischen Arbeitsgruppe der Nachweis geführt, dass Acrylamid beim Erhitzen verschiedenster stärkehaltiger Lebensmittel mit geringem Wassergehalt entstehen kann 30. In der olge dieser Entdeckung wurde weltweit in handelsüblichen Lebensmitteln, vor allem Kartoffelchips, Pommes rites oder Knäckebrot Acrylamid in hohen Konzentrationen gefunden (bis in den mg/kg- Bereich). Aber auch in Getreideprodukten, Brot, Keksen bis hin zu Kaffeepulver wurden erhebliche Konzentrationen an Acrylamid entdeckt. Daraus lässt sich schließen, dass bei normaler Ernährungsweise eine Exposition gegenüber Acrylamid - selbst unter Vermeidung der besonders belasteten Lebensmittelgruppen wie Kartoffelchips und Pommes rites - kaum vermeidbar ist. Die Allgemeinbevölkerung ist demnach auf breiter Basis gegenüber Acrylamid über den Verzehr dieser Lebensmittel exponiert. Tabelle 5-2 gibt einen Überblick über die derzeitige Belastungssituation in deutschen Lebensmitteln 36.

34 Stoffübersicht 23 Acrylamid (µg/kg) Produkt Anzahl der Median (µg/kg) Bereich (µg/kg) unters. Proben Kartoffelchips Pommes rites, zubereitet Kartoffelsticks Bratkartoffeln, zubereitet n.n. 280 Knäckebrot n.n Brot 52 < 30 n.n Brötchen 12 < 30 n.n. 140 rühstückscerealien n.n. 640 Cornflakes Butterkekse Lebkuchen Salzstangen Kaffeepulver Tabelle 5-2: Acrylamid-Konzentrationen in verschiedenen Lebensmittelgruppen in Deutschland 36 Auf der Grundlage der bisher vorliegenden Daten über Acrylamid in Lebensmitteln hat das Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) anhand der durchschnittlichen Verzehrsgewohnheiten der Bevölkerung eine Abschätzung der täglichen Acrylamid- Aufnahme durchgeführt. Demnach geht das BfR von einer mittleren täglichen Belastung von 0,6 µg/kg Körpergewicht aus, wobei für einige Risikogruppen, wie

35 Stoffübersicht 24 Jugendliche mit hohem Verzehr acrylamidhaltiger Lebensmittel (Pommes, Chips, etc), eine tägliche Aufnahme von ca. 3,4 µg/kg Körpergewicht abgeschätzt wurde. Da die Entstehung von Acrylamid von Temperatur und Erhitzungsdauer abhängt und die Gehalte zudem auch im häuslichen Bereich - individuell stark schwanken können, kann die reale Acrylamidaufnahme im Einzelfall noch höher liegen 37. Die Weltgesundheitsorganisation WH geht in einer ersten Näherung von einer durchschnittlichen nahrungsmittelbedingten Aufnahme von Acrylamid von 0,3 0,8 µg/kg Körpergewicht aus 38. Eine weitere Expositionsquelle, die für die Allgemeinbevölkerung berücksichtigt werden muss, ist das Rauchen: Acrylamid entsteht im Pyrolyseprozess und wurde im Hauptstromrauch von Zigaretten nachgewiesen. Die in gefiltertem Hauptstromrauch ermittelten Massen liegen zwischen 1,1 bis 2,34 µg pro Zigarette. Als Vorstufen für Acrylamid in den Zigaretten wurden in diesen Untersuchungen Aminosäuren in der Gegenwart von Nitrat diskutiert 39. Da Polyacrylamide auch in der Herstellung von kosmetischen Produkten wie etwa Shampoo, Deodorant o. ä. eine Rolle spielen und Restgehalte an Acrylamid im verwendeten Polyacrylamid enthalten sein können, wäre auch dies prinzipiell eine Expositionsquelle für die Allgemeinbevölkerung. Es wird jedoch allgemein davon ausgegangen, dass die Restgehalte in den verwendeten Produkten zu niedrig sind, um substantiell zur Belastung der Allgemeinbevölkerung beizutragen. In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde anhand durchschnittlicher Restgehalte in Kosmetika und den durchschnittlichen Gebrauchsgewohnheiten der Bevölkerung in einer Monte-Carlo-Analyse der Beitrag zur Hintergrundbelastung aus Kosmetika ermittelt. Nach dieser Schätzung nehmen rauen im Median täglich 4,7 x 10-8 mg Acrylamid pro kg Körpergewicht und Männer im Median täglich 3,6 x 10-8 mg/kg KG über Kosmetika auf 40. Diese Werte liegen mehrere Größenordnungen unter den Schätzungen für die Aufnahme über die Nahrung und können somit als vernachlässigbar angesehen werden. Wie bereits in Kap dargelegt, kann der Gehalt an Acrylamid in Trinkwasser nach der Aufbereitung gemäß Schätzungen der Europäischen Union unter den ungünstigsten Umständen maximal 0,125 µg/l betragen 32. Selbst unter diesen Umständen ist der Beitrag zur Belastung der Allgemeinbevölkerung vernachlässigbar klein.

36 Stoffübersicht 25 Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass sowohl die Ernährungsgewohnheiten als auch das Rauchverhalten massgeblich für die individuelle Exposition der Normalbevölkerung gegenüber Acrylamid in Deutschland verantwortlich sind Entstehung von Acrylamid in der Maillard-Reaktion Bereits kurz nach der Entdeckung von Acrylamid als natürlicher (d. h. aus natürlichen Inhaltsstoffen entstehender) Kontaminant in erhitzten stärkehaltigen Lebensmitteln konnte gezeigt werden, dass reduzierende Zucker wie Glucose und die Aminosäure Asparagin oder glykosidisch gebundene Aminosäuren eine Schlüsselrolle in der Entstehung von Acrylamid spielen 41,42. Da die Aminosäure Asparagin in freier orm neben reduzierenden Zuckern - vor allem in Kartoffeln und Getreidearten vorkommt, liefert dies eine schlüssige Erklärung für die relativ selektive Belastung bestimmter Lebensmittelgruppen mit Acrylamid nach dem Erhitzen (siehe Tabelle 5-2). Die Reaktion läuft dabei zeit- und temperaturabhängig bevorzugt in wasserarmen Lebensmitteln ab, wobei die Bildung von Acrylamid ab Temperaturen von ca C sprunghaft ansteigt 30,41,42. In der olge gab das Bundesministerium für Verbraucherschutz, Ernährung und Landwirtschaft (BMVEL) Empfehlungen für die Herstellung von Kartoffelprodukten im häuslichen Bereich heraus, um die Bildung von Acrylamid in diesen Produkten zu minimieren 43. Demnach wurden Verbraucher und Hersteller aufgefordert, entsprechende Produkte nicht zu stark zu erhitzen ( vergolden statt verkohlen ) 43. Der genaue Mechanismus der Reaktion blieb längere Zeit ungeklärt und ist derzeit noch Gegenstand der aktuellen wissenschaftlichen Diskussion 41,42,44,45. Anhand detaillierter Untersuchungen in einem Modellsystem mit C 13 - bzw N 15 - markiertem Asparagin konnten in einer kürzlich veröffentlichten Studie die Zwischenstufen der Reaktion isoliert und nachgewiesen werden 45. In Abbildung 5-1 ist der so beschriebene Reaktionsmechanismus dargestellt. Demzufolge ist der erste Schritt in der Entstehung von Acrylamid die Bildung einer Schiff schen Base zwischen einer Carbonyl-Gruppe (z.b. aus Glucose) und der α- Aminogruppe des Asparagins. Unter Einwirkung von Hitze kann diese Schiff sche Base decarboxylieren. Dies wird erleichtert durch die Delokalisation der negativen

37 Stoffübersicht 26 Ladung (siehe Abb. 5-1). Die entstehende Zwischenstufe kann auf zwei Arten weiterreagieren. Abbildung 5-1: Vorgeschlagener Mechanismus der Acrylamid-Bildung in erhitzten Lebensmitteln (aus Zyzak et al. 45 ). Die in Klammern angegebenen Massen wurden bei Verwendung von 13 C 15 N-markiertem Asparagin nachgewiesen. Die decarboxylierte Schiff sche Base kann zu 3-Aminopropionamid hydrolysiert werden, welches über die Elimination von Ammoniak unter Hitzeeinwirkung zu

38 Stoffübersicht 27 Acrylamid abgebaut werden kann. Alternativ kann die decarboxylierte Schiff sche Base direkt unter Bildung eines Imins und Acrylamid zerfallen. In weitergehenden Studien konnte kürzlich gezeigt werden, dass das biogene Amin 3-Aminopropionamid als einer der potentesten Vorstufen in der Bildung von Acrylamid auch unter natürlichen Bedingungen nach enzymatischer Decarboxylierung von Asparagin entsteht. Die dabei in verschiedenen Kartoffelarten gemessenen Konzentrationen reichen von 136 µg/kg bis zu 1754 µg/kg rischgewicht. Die warme Lagerung von Kartoffeln hatte dabei einen massgeblichen Einfluß auf die Bildung dieses biogenen Amins Metabolismus und Toxikokinetik Daten zum Humanmetabolismus von Acrylamid liegen derzeit noch nicht vor, so dass auf tierexperimentelle Daten zurückgegriffen werden muss. Acrylamid wird sowohl oral, dermal als auch inhalativ rasch resorbiert und aufgrund seiner hohen Wasserlöslichkeit im gesamten Körper verteilt und umgehend metabolisiert, vorwiegend zum Glutathion-Konjugat. Die Ausscheidung von Acrylamid in Ratten nach oraler Gabe von 14 C-markiertem Acrylamid folgt einer zweiphasigen Kinetik mit einer initialen Phase mit einer Halbwertszeit von etwa 5 h und einer terminalen Phase mit einer Halbwertszeit von ca. 8 Tagen, die vermutlich auf den Abbau von verschiedenen Protein-Addukten zurückzuführen ist. Dabei werden innerhalb von 24 h 70 % der aufgenommenen Dosis im Urin ausgeschieden 47,48. Insgesamt werden 90 % der aufgenommenen Dosis innerhalb von 7 Tagen mit dem Urin, lediglich 6 % über die aeces ausgeschieden 48. Bei der Metabolisierung steht die Bildung von Glutathion-olgeprodukten, die über den Urin ausgeschieden werden, im Vordergrund. Die direkte Bindung von Glutathion an Acrylamid erfolgt über eine Michael-Addition und führt letztlich nach Abspaltung von Glutaminsäure und Glycin und abschließender Acetylierung zur Bildung von N-Acetyl-S-(2-carbamoylethyl)cystein. Diese Merkaptursäure stellt mit einem Anteil von etwa 60 % bei Ratten (Maus: ca. 21 %) den Hauptanteil der im Urin ausgeschiedenen Metaboliten dar 49. Demgegenüber werden nur ca. 2 % der aufgenommenen Menge als unverändertes AA im Urin ausgeschieden 47.

39 Stoffübersicht 28 Daneben kann Acrylamid in der Leber über Cytochrom P 450 2E1 zu einem Epoxid verstoffwechselt werden 50. Das gebildete Glycidamid kann ebenfalls über die Reaktion mit Glutathion als N-Acetyl-S-(2-hydroxy-2-carbamoylethyl)cystein im Urin ausgeschieden werden. Diese aus dem oxidativen Stoffwechsel gebildete Mercaptursäure stellt mit einem Anteil von ca. 23 % den zweitwichtigsten harngängigen Metaboliten bei der Ratte dar. Die zweite mögliche Merkaptursäure des oxidativen Stoffwechsels, N-Acetyl-S-(1-carbamoyl-2-hydroxyethyl)cystein (9 %) sowie das durch Hydrolyse gebildete 2,3-dihydroxypropionamid spielen bei der Ratte eher eine untergeordnete Rolle, treten bei Mäusen jedoch mehr in den Vordergrund 49. Allgemein zeigt sich bei Mäusen ein stärkerer oxidativer Metabolismus von Acrylamid, wodurch die Bedeutung speziesabhängiger Unterschiede nochmals unterstrichen wird. Abbildung 5-2 zeigt das Metabolismusschema von Acrylamid nach Sumner et al Die aufgeführten Metaboliten wurden im Urin von -344 Ratten nach Verabreichung von 13 C-markiertem AA mittels 13 C-NMR qualitativ und quantitativ bestimmt 49. Es kann davon ausgegangen werden, dass der Metabolismus von Acrylamid beim Menschen gleichartig abläuft, das Ausmaß der unterschiedlichen Stoffwechselwege ist jedoch bisher unklar. In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde die Toxikokinetik von Acrylamid und Glycidamid im Serum von Mäusen bestimmt: dabei ergaben sich im Serum Eliminationshalbwertszeiten für Acrylamid von t 1/2 = 0,73 h und für Glycidamid von t 1/2 = 1,9 h. Demnach wird Glycidamid deutlich langsamer aus der Blutbahn eliminiert und demnach auch mit einer längeren Halbwertszeit renal ausgeschieden. Die Bildungsrate von Glycidamid (aus Acrylamid) wurde in dieser Studie ebenfalls bestimmt: demzufolge wird Glycidamid mit einer Bildungsrate von t 1/2 = 0,77 h im Serum recht rasch gebildet 51. Beide Substanzen, sowohl Acrylamid als auch der oxidative Metabolit Glycidamid sind in der Lage, kovalent gebundene Addukte mit zirkulären Blutproteinen, wie z. B. Hämoglobin zu bilden (siehe Kapitel 3.2.). ür Glycidamid konnte darüber hinaus die Bindung an die DNA bereits bewiesen werden. Die Bildung verschiedenster Glycidamid-DNA-Addukte konnte in vivo bei Ratten und Mäusen nach Acrylamid-Gabe nachgewiesen werden 52,53. Demgegenüber konnte die Bildung von DNA-Addukten des Acrylamids selbst (über eine Michael-Addition) bisher nur in vitro bewiesen werden 54. Nach Schätzungen ist

40 Stoffübersicht 29 die Bildungsrate für DNA-Addukte des Glycidamids tausendfach höher als für die Ausgangssubstanz Acrylamid. Deshalb wird das gebildete Glycidamid quasi als ultimaler kanzerogener Metabolit des Acrylamids angesehen 48. Diese Annahme wurde in einer erst kürzlich veröffentlichten, sehr bemerkenswerten Arbeit nochmals bekräftigt. Dabei konnten DNA-Addukte von Glycidamid in der Leber von ischer 344-Ratten und B6C3 1 -Mäusen nach chronischer täglicher Gabe von 1 mg Acrylamid/kg Körpergewicht (verabreicht über das Trinkwasser) per LC/MS/MS quantifiziert werden 55. Es konnte lediglich das quantitativ bedeutsamste DNA-Addukt des Glycidamids, N 7-2-hydroxy-2-carbamoylethylguanin nachgewiesen werden. In Versuchen mit höheren Dosierungen wurde auch N 3-2-hydroxy-2- carbamoylethylguanin nachgewiesen. Es zeigte sich ein Anstieg der in der Leber nachgewiesenen DNA-Addukt- Konzentrationen über die Zeit, bis nach etwa 14 Tagen ein steady state erreicht wurde. Bemerkenswerterweise wurden dabei in der Leber von Mäusen ca. 4 5fach höhere Konzentrationen des Glycidamid-Guanin-Adduktes nachgewiesen als in der Leber der Ratten (~ 380 Addukte/10 8 Nukleotide in Mäusen; ~ Addukte/10 8 Nukleotide in Ratten). Diese Beobachtung deckt sich mit dem anhand anderer Biomarker für Acrylamid (Urinmetabolite, Hämoglobinaddukte) bereits festgestellten stärker ausgeprägten oxidativen Metabolismus von Mäusen im Vergleich zu Ratten 49,56,57.

41 Stoffübersicht 30 GS H S NH 2 H 3 C NH N-Acetyl-S-(2-carbamoyl-ethyl)cystein 59 % H 2 C NH 2 + GSH NH 2 Acrylamid Reduktiver Stoffwechselweg H NH 2 Hydrolyse Cytochrom P 450 2E1 xidativer Stoffwechselweg H 2,3-dihydroxypropionamid H + GSH NH 2 Glycidamid 10 % + GSH H GS GS NH 2 NH 2 H H S NH 2 H S H 3 C NH H H 3 C NH NH 2 N-Acetyl-S-(2-hydroxy-2-carbamoyl-ethyl)cystein 23 % N-Acetyl-S-(1-carbamoyl-2-hydroxy-ethyl)cystein 9 % Abbildung 5-2: Metabolismus von Acrylamid in -344 Ratten nach Sumner et al. 49. Die Prozentangaben beziehen sich auf den Anteil der im Urin nachgewiesenen Metabolite.

42 Stoffübersicht Toxische Eigenschaften Die Aufnahme von Acrylamid kann beim Menschen erhebliche Gesundheitsschäden hervorrufen. Bei hohen Konzentrationen stehen aus arbeitsmedizinischer Sicht zunächst die neurotoxischen Eigenschaften dieses Stoffes im Vordergrund. So wurden bei hoch exponierten Arbeitern in der Vergangenheit Empfindungsstörungen der Gliedmaßen, sogenannte periphere Polyneuropathien festgestellt, die im allgemeinen als reversibel beschrieben werden 58,59. Basierend auf einer schwedischen Studie konnte anhand des im Blut der Arbeiter quantifizierten Hämoglobin-Addukts von Acrylamid ein no-observed adverse effect level von etwa 14 µg Addukt pro Liter Blut (510 pmol/g Globin) für das Auftreten von Taubheitsgefühlen in den Extremitäten abgeschätzt werden 59. ür die chronische Aufnahme von Acrylamid, wie sie unter anderem aus der Aufnahme mit der Nahrung resultiert, rücken seine mutagenen und kanzerogenen Eigenschaften in den Vordergrund. Dabei zeigt Acrylamid selbst in der Mehrzahl der Mutagenitätstests in vitro keine bzw. in Säugerzellen nur schwach positive Resultate 60. In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde im direkten Vergleich die deutlich mutagenere Wirkung des oxidativen Metaboliten Glycidamid gegenüber Acrylamid sowohl in humanen als auch in Maus-Zelllinien belegt 61. Darüber hinaus konnten in zahlreichen Tierversuchen erbgutschädigende Wirkungen des Acrylamids nachgewiesen werden, die vor allem die männlichen Keimzellen betreffen 62,63. Die vorliegenden Daten lassen vermuten, dass Acrylamid dabei vor allem eine chromosomenschädigende Wirkung entfaltet. In mehreren Kanzerogenitätsstudien sowohl an Ratten als auch an Mäusen wurde dosisabhängig das Auftreten maligner Tumore beobachtet 48,64. ür die kanzerogene Wirkung des Acrylamids wird vor allem der genotoxische Metabolit Glycidamid verantwortlich gemacht. Mäuse zeigten dabei eine größere Sensibilität für die kanzerogenen Effekte des Acrylamids; eine Beobachtung, die durch den vermehrten oxidativen Metabolismus dieser Spezies erklärt wird. In humanepidemiologischen Studien konnte bisher allerdings kein Hinweis auf eine vermehrte Krebsinzidenz bei exponierten Arbeitern gezeigt werden 48,65. In weiteren Arbeiten konnte daneben in jüngster Zeit ebenfalls kein Zusammenhang zwischen der vermehrten Aufnahme potentiell acrylamid-haltiger Nahrungsmittel (retrospektiv

43 Stoffübersicht 32 ermittelt über ragebogen) und dem Auftreten verschiedener Krebsarten gefunden werden 66,67,68. Einer der grundlegenden Nachteile dieser Studien liegt allerdings in der mangelhaften statistischen Aussagekraft dieser Untersuchungen, da die zu erwartenden niedrigen zusätzlichen Krebsrisiken nicht mit genügender Sicherheit erfasst werden können. Darüber hinaus ist die retrospektive Erfassung der individuellen Exposition immer mit erheblichen Unsicherheiten verbunden. Vor dem Hintergrund des im Tierversuch eindeutig belegten kanzerogenen Potentials sowie der nachgewiesenen Bindung an die DNA wurde Acrylamid von der DG in Kategorie 2 der krebserzeugenden Arbeitsstoffe eingeordnet 2. Auch die International Agency for Research on Cancer (IARC) hat Acrylamid als wahrscheinlich krebserregend für den Menschen eingestuft (Gruppe 2A) 69.

44 Stoffübersicht Acrylnitril C N Acrylnitril H 2 C IUPAC 2-Propennitril CAS-Nummer Summenformel C 3 H 3 N Molekulargewicht [g/mol] 53,063 Eigenschaften arblose lüssigkeit Dichte 20 C 0,806 g/cm 3 Schmelzpunkt - 83,5 C Siedepunkt 77,3 C Dampfdruck 115 hpa bei 20 C log P W 0,25 Wasserlöslichkeit 73,5 g/l bei 20 C TRK-Wert 7 mg/m 3 EKA TRK Einstufungen MAK-Kommission Tabelle 5-3: Datenblatt Acrylnitril 2, µg N-Cyanoethylvalin/l Blut Hautresorbierend H Hautsensibilisierend S h Krebserzeugend Kategorie Technische Darstellung und Verwendung Die großtechnische Herstellung von Acrylnitril erfolgt in einem geschlossenen System durch katalytische xidation von Propen in Gegenwart von Ammoniak, dem sogenannten Sohio-Verfahren. Die Reaktion findet in Gegenwart von Metalloxidkatalysatoren bei C und bis zu 200 kpa Reaktionsdruck statt. Die Jahresproduktion an Acrylnitril in der Europäischen Union wird auf Tonnen geschätzt. Monomeres Acrylnitril wird dabei fast ausschließlich als Ausgangsstoff für die Herstellung von Polymeren benutzt, mit der Ausnahme der Erzeugung von Acrylamid und Adiponitril. ast 52 % der gesamten Acrylnitril-Produktion in der Europäischen Union wird zur Produktion von Polyacrylnitrilfasern für die Textilindustrie verwandt. Weitere 15 % werden für die Herstellung von Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS)-Plastikteilen sowie Styrol-Acrylnitril-Copolymeren für die Autoindustrie eingesetzt. Die Herstellung von Acrylamid und Adiponitril nimmt weitere 15 % des Gesamt-Herstellungsvolumens

45 Stoffübersicht 34 ein, während ca. 18 % in der Gummi-Industrie sowie zur Produktion anderer Polymere eingesetzt werden Eintrag in die Umwelt und Persistenz bwohl die Produktion und Verarbeitung von Acrylnitril weitestgehend in geschlossenen Systemen stattfindet, kann es dabei z.b. in der Anlauf- oder Beendigungsphase sowie bei Aufreinigungsschritten zu Emissionen in die Umwelt kommen. Auch Autoabgase können eine signifikante Quelle für Acrylnitril-Emissionen in die Atmosphäre sein. Modellrechnungen für die Verteilung von Acrylnitril in der Umwelt gehen aufgrund der vorhandenen Daten wie Dampfdruck, Wasserlöslichkeit, log P W und anderer physikalisch-chemischer Konstanten davon aus, dass der Eintrag in die Atmosphäre das vorherrschende Kompartiment für Acrylnitril- Emissionen ist, wobei ein kleinerer Anteil das wässrige Kompartiment erreicht und andere Kompartimente als vernachlässigbar angesehen werden können. Die Europäische Union geht davon aus, dass jährlich europaweit von allen Acrylnitrilproduzierenden und verarbeitenden Betrieben ca. 400 Tonnen in Wasser emittiert werden. Der Eintrag in die Atmosphäre wird hierbei auf ca. 900 Tonnen jährlich geschätzt. Indirekte Emissionen über Autoabgase können dabei zu einer weiteren Emission von jährlich etwa 2400 Tonnen führen, obwohl diese Daten als worst-case- Betrachtung angesehen werden müssen. Acrylnitril wird in der Atmosphäre und in Boden als gut biologisch abbaubar beschrieben. Die Geschwindigkeitskonstante für die Reaktion von Acrylnitril mit Hyroxylradikalen im Zuge des Abbaus in der Atmosphäre wurde mit 3,2 * cm/mol/s angegeben. Aus diesen Daten wurde eine Halbwertszeit für Acrylnitril in der Troposphäre von ca. 5 Tagen berechnet. In wässrigen Systemen reichte die Halbwertszeit von Acrylnitril von etwa 2 Tagen in einem belüfteten System bis zu 30 Tagen im Standard-Testsystem. Damit kann Acrylnitril im Gegensatz zu Acrylamid nicht als gut biologisch abbaubar in Wasser eingestuft werden. Aufgrund seiner relativ hohen Toxizität für ische und andere aquatische Lebewesen kann eine Emission in wässrige Systeme somit potentiell eine Gefahr für Wasserlebewesen in der Nähe von produzierenden oder verarbeitenden Betrieben darstellen.

46 Stoffübersicht 35 Infolge des relativ hohen Dampfdrucks ist ein Übergang von Acrylnitril aus Wasser in die Atmosphäre möglich, dies wird jedoch infolge der guten Wasserlöslichkeit durch das Auswaschen mit dem Regen ausgeglichen. ür Acrylnitril wurde aufgrund der hohen Wasserlöslichkeit und des niedrigen log P W ein Biokonzentrationsfaktor von ca. 1 berechnet, d. h. mit einer Bioakkumulation ist nicht zu rechnen Expositionsquellen für die Allgemeinbevölkerung Natürliche Quellen für Acrylnitril sind bisher nicht bekannt. Eine der Hauptexpositionsquellen für Acrylnitril in der Allgemeinbevölkerung ist der Konsum von Tabakerzeugnissen. Acrylnitril wurde - ebenso wie Acrylamid - als Bestandteil des Tabakrauchs identifiziert. Dabei lagen die ermittelten Massen im Rauch mit 3 15 µg pro Zigarette deutlich höher als für Acrylamid 28 (siehe ). Inwieweit die Exposition über Passivrauch hier für die Allgemeinbevölkerung eine Rolle spielt, ist derzeit noch nicht abschliessend geklärt. Eine weitere mögliche Expositionsquelle für die Allgemeinbevölkerung stellen Rückstände von monomerem Acrylnitril in entsprechenden Textilfasern oder Plastik- Produkten her, die zum Teil auch für die Verpackung von Lebensmitteln verwendet werden. Die dabei in Acrylfasern nachgewiesenen Rückstände waren generell deutlich kleiner als 1 mg/kg. Basierend auf diesen Daten lässt sich schließen, dass der Beitrag zur Acrylnitril-Exposition über Rückstände in Textilfasern für den Verbraucher vernachlässigbar klein ist. Das maximal tolerierbare Migrationslimit von Acrylnitril aus entsprechenden Plastikverpackungen in verpackte Lebensmittel (ABS-Plastik) beträgt nach der Bedarfsgegenständeverordnung 0,02 mg Acrylnitril pro kg Lebensmittel 71. Geht man davon aus, dass maximal 5 % der von Menschen verzehrten Lebensmittel in entsprechende Plastikteile verpackt ist, sowie einem durchschnittlichen täglichen Verzehr von 2 kg Lebensmittel, so ergibt sich in dieser worst-case-betrachtung eine maximale Aufnahme von 2 µg/tag oder ca. 0,03 µg/kg KG/Tag 70. In einer älteren Studie über die Luftbelastung in industriellen Gebieten Deutschlands wurden im Zeitraum von auch die Gehalte an Acrylnitril in der Luft gemessen. Dabei wurden in städtischen Gebieten Konzentrationen von 0,01 10,4 µg/m 3 gemessen, während die Luftkonzentration in ländlichen Gebieten generell

47 Stoffübersicht 36 unterhalb 0,002 µg/m 3 lag 70. Abgesehen von den gemessenen Extremwerten kann diese Expositionsquelle als vernachlässigbar für die Allgemeinbevölkerung angesehen werden. Zusammenfassend lässt sich demnach festhalten, dass für die individuelle innere Exposition der Normalbevölkerung gegenüber Acrylnitril in Deutschland massgeblich das Rauchverhalten verantwortlich ist Metabolismus und Toxikokinetik Der Metabolismus von Acrylnitril verläuft in weiten Teilen sehr ähnlich dem des Acrylamids. Auch Acrylnitril wird nach der Aufnahme rasch resorbiert, gleichmäßig im Körper verteilt und vorwiegend zum Glutathion-Konjugat metabolisiert. Aus Tierversuchen an Ratten geht hervor, dass % einer oral verabreichten Dosis Acrylnitril innerhalb von 24 h über den Urin ausgeschieden werden. 2 8 % der Dosis werden über die aeces ausgeschieden und 7 15 % über die Lunge als HCN, C 2 oder unverändertes Acrylnitril abgeatmet 72. Auch für Acrylnitril stellt die direkte Bindung an Glutathion (reduktiver Weg) und die daraus resultierende Merkaptursäure einen großen Teil der im Urin ausgeschiedenen Metaboliten dar. In Ratten beträgt der Anteil dieser Merkaptursäure an den harngängigen Metaboliten etwa 40 %, bei Mäusen etwa 25 % 49. Über Cytochrom P E1 wird Acrylnitril zum entsprechenden Epoxid Cyanoethylenepoxid umgesetzt 50. Insgesamt stellen die olgeprodukte dieses hochreaktiven Metaboliten mit einem Gesamtanteil von % aller im Urin ausgeschiedenen Metabolite den Hauptanteil dar. Cyanoethylenepoxid kann über Konjugation mit Glutathion an Position 2 zu N-Acetyl- S-(1-cyano-2-hydroxyethyl)cystein abgebaut werden. Diese Merkaptursäure stellt bei Ratten etwa 13 % der harngängigen Metaboliten dar (Maus: ca. 9 %) 49. Aus der Glutathion-Konjugation an Position 3 resultiert ein instabiles Cyanhydrin, das unter Abspaltung von Cyanid intermediär zu S-(2-oxoethyl)glutathion reagiert. Dieses kann nach Reduktion als N-Acetyl-S-(2-hydroxyethyl)cystein ausgeschieden werden. Diese unspezifische Merkaptursäure stellt mit einem Anteil von 30 % bei der Ratte (Maus: 16 %) den zweitwichtigsten Urin-Metaboliten dar. Das gebildete Cyanid wird über das Enzym Rhodanese zu Thiocyanat umgesetzt und als solches ebenfalls im

48 Stoffübersicht 37 Urin ausgeschieden 49. Diese Bildung von Cyanid im Metabolismus wird eng mit der akuten Toxizität von Acrylnitril in Zusammenhang gebracht 72,73. Eine grosse Rolle für das Ausmaß der Bildung von Cyanid spielt dabei die Aktivität der Glutathion-Transferasen, wie arbeitsmedizinische Untersuchungen an akzidentell exponierten Mitarbeitern gezeigt haben. Eine geringe Aktivität der Glutathion- Transferasen bedingt demnach eine Verschiebung hin zum oxidativen Metabolismus, in dessen Verlauf Cyanid gebildet wird 74. Abbildung 5-3 zeigt den Metabolismus von Acrylnitril in 344 Ratten nach Sumner et al Die Bestimmung der Metaboliten im Urin nach oraler Gabe von 13 C- markiertem ACN erfolgte mit Hilfe von 13 C-NMR Toxische Effekte Acrylnitril ist akut toxisch, wobei Symptome durchaus ähnlich einer Blausäurevergiftung wie Cyanose, Schwindel, Erbrechen und Kopfschmerzen auftreten können. Daneben stehen Reizeffekte an Haut und Schleimhäuten sowie Einwirkungen auf die Atemwege, den Gastrointestinaltrakt und das zentrale Nervensystem im Vordergrund. Schwere Vergiftungen können dabei zu Atemstillstand führen. Erste Symptome nach inhalativer Aufnahme können bereits ab Konzentrationen von 16 ppm auftreten. Die autretenden Symptome können sowohl auf die langsame Bildung von Cyanid im Metabolismus von Acrylnitril zurückgeführt werden als auch auf die mit einer Acrylnitril-Aufnahme verbundene Abnahme der Glutathion-Konzentration in den Geweben. In Langzeitstudien an exponierten Arbeitern konnten verringerte Glutathion-Gehalte in der Leber, leicht veränderte Leberwerte sowie vereinzelt reduzierte Testosteron-Level festgestellt werden 72. Acrylnitril hat sich in einer Vielzahl von Tierversuchen als kanzerogen erwiesen. Epidemiologische Studien an exponierten abrikarbeitern zeigen dabei allerdings widersprüchliche Ergebnisse: während in einer US-amerikanischen Studie ein signifikanter Anstieg der Prostata-Krebsfälle registriert werden konnte, gibt es aus der Mehrzahl der bisher veröffentlichten Studien keinerlei Hinweis auf eine kausale Beziehung zwischen der Acrylnitril-Exposition und einer erhöhten Krebsinzidenz 72,75. Aufgrund der im Tierversuch eindeutig belegten kanzerogenen Wirkung wurde Acrylnitril von der DG in Kategorie 2 der krebserzeugenden Arbeitsstoffe

49 Stoffübersicht 38 eingeordnet 2. Von der IARC wurde Acrylnitril in Kategorie 2 B eingestuft ( possibly carcinogenic to human ) 76. Anhand von Untersuchungen an exponierten Arbeitnehmern konnte von der DG für Acrylnitril eine EKA-Korrelation aufgestellt werden: demnach entspricht dem derzeit gültigen TRK-Wert von 7 mg/m 3 ein mittlerer Hämoglobin-Addukt-Level von 420 µg N-Cyanoethylvalin pro Liter Blut 2.

50 Stoffübersicht 39 H S C N GS C N H 3 C NH + GSH N-Acetyl-S-(2-cyanoethyl)cystein 40 % H 2 C C Acrylnitril N Reduktiver Stoffwechselweg S C N - Thiocyanat C - N + GSH Cytochrom P 450 2E1 N C Cyanoethylenepoxid + GSH H xidativer Stoffwechselweg GS C H GS H C N GS C N H H S H H S C N H 3 C NH H 3 C NH N-Acetyl-S-(2-hydroxyethyl)cystein 30 % N-Acetyl-S-(1-cyano-2-hydroxyethyl)cystein 13 % Abbildung 5-3: Metabolismus von Acrylnitril in -344 Ratten nach Sumner et al. 49. Die Prozentangaben beziehen sich auf den Anteil der im Urin nachgewiesenen Metabolite.

51 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils am N-terminalen Valin 6.1. Grundlage des Verfahrens Mit diesem Verfahren können die Hämoglobin-Addukte von Acrylnitril und Acrylamid im Blut von Personen erfasst werden, die beruflich oder umweltbedingt gegenüber diesen Substanzen exponiert sind. Zur Bestimmung der Addukte am N-terminalen Valin des Hämoglobins müssen zunächst die Erythrocyten aus Vollblut isoliert, von Plasmabestandteilen abgetrennt und schließlich durch Zugabe von Wasser lysiert werden. Aus dem erhaltenen Erythrocytenhämolysat wird die Proteinfraktion (das Globin) mit Hilfe von Ethylacetat ausgefällt, mit organischen Lösungsmitteln gewaschen und schließlich getrocknet. Dieses Globin wird in der olge dem modifizierten Edman-Abbau unterworfen. Dabei wird das alkylierte N-terminale Valin von der Proteinkette abgespalten und zum entsprechenden Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivat umgesetzt. Die entstandenen Derivate werden mit Hilfe einer lüssig/flüssig-extraktion mit Diethylether aus der Proteinmatrix extrahiert und durch anschließende Waschschritte von Störsubstanzen abgetrennt. Die entstandenen Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivate des Acrylamids (1-(2- Carbamoylethyl)-5-isopropyl-3-pentafluorphenyl-2-thiohydantoin) und des Acrylnitrils (1-(2-Cyanoethyl)-5-isopropyl-3-pentafluorphenyl-2-thiohydantoin) werden mit Hilfe der Kapillargaschromatographie von Störsubstanzen abgetrennt. Die Detektion und Quantifizierung erfolgt massenspektrometrisch im EI-Modus. Zur Quantifizierung wird dabei Poolglobin von Nichtrauchern eingesetzt, welches mit Lösungen von Dipeptid-Standards versetzt wird, die die addukt-tragenden letzten beiden N-terminalen Aminosäuren der Hämoglobin-Kette simulieren. Die so erhaltenen Kalibrationsstandards werden analog den zu untersuchenden Proben aufgearbeitet. Als interner Standard wird den Proben ein Dipeptid zugegeben, welches ein arbeits- und umweltmedizinisch nicht vorkommendes, N-terminales Valin-Addukt simuliert (N-2-Ethoxyethylvalin-Alanin-Anilid). Die hier vorgestellte Methode folgt im Wesentlichen den bisher publizierten Methoden des modifizierten Edman-Abbaus 25,77 und wurde für die betreffenden Addukte im umweltmedizinischen Konzentrationsbereich optimiert.

52 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Geräte, Chemikalien und Lösungen Geräte Gaschromatograph HP G 1800 A GCD System (Hewlett-Packard, Waldbronn) Massenspektrometer HP MSD 5971 (Hewlett-Packard, Waldbronn) Autosampler HP 7673 (Hewlett-Packard, Waldbronn) 10 µl-spritze für die GC (Hamilton, Bonaduz, Schweiz) Hängethermostat für Wasserbäder (Haake Messtechnik, Karlsruhe) Evaporatorstation ReactiVap III (Pierce, Laborcenter Nürnberg) Zentrifuge Multifuge 3 L-R (a. Heraeus, Laborcenter Nürnberg) Vortex-Mixer Genie 2 (a. Scientific Industries, Laborcenter Nürnberg) Wippschüttler RM 5 (a. CAT, Laborcenter Nürnberg) Magnetrührer IKAMAG RH (a. IKA Labortechnik, Laborcenter Nürnberg) Ultraschallbad Ultrasonic Cleaner (a. VWR, Laborcenter Nürnberg) Verschiedene Pipetten und Multipetten (Eppendorf, Hamburg) EDTA-Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht) Plastikröhrchen mit Deckel, Nutzvolumen 13 ml und 30 ml (Laborcenter Nürnberg) Rollrandampullen mit teflonkaschierten Gummisepten und Aluminiumverschlusskappen, Volumen 2 ml (Macherey-Nagel, Düren) Schraubgläschen mit teflonkaschierten Gummisepten und Schraubdeckel, Volumen 5 ml und 20 ml Mikroeinsätze für die Rollrandampullen, Nutzvolumen 100 µl (Macherey-Nagel, Düren) Chemikalien Diethylether p. a. (Merck, Darmstadt) Ethanol p. a. (Merck, Darmstadt) 2-Propanol p.a. (Merck, Darmstadt) Ethylacetat p.a. (Merck, Darmstadt) Toluol für die Gaschromatographie (Merck, Darmstadt) n-hexan für die Gaschromatographie (Merck, Darmstadt) Salzsäure konzentriert 37 % (Merck, Darmstadt) Wasser deionisiert

53 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 42 ormamid ultrapure (United States Biochemicals, Cleveland, USA) N-2-Cyanoethylvalin-Leucin-Anilid (Bachem Biochemica, Heidelberg) N-2-Carbamoylethylvalin-Leucin-Anilid (Bachem Biochemica, Heidelberg) N-2-Ethoxyethylvalin-Alanin-Anilid (Bachem Biochemica, Heidelberg) Natriumcarbonat wasserfrei (Merck, Darmstadt) Natriumhydroxid p.a. (Merck, Darmstadt) Natriumchlorid p.a. (Merck, Darmstadt) Pentafluorphenylisothiocyanat (luka, Buchs, Schweiz) Helium Reinheit 5.0 (a. Linde, München) Lösungen 50 mm HCl in 2-Propanol In einen 1000 ml Messkolben werden ca. 500 ml 2-Propanol vorgelegt. Es werden 4,1 ml konzentrierte Salzsäure (37%) zugegeben und der Messkolben mit 2-Propanol bis zur Marke aufgefüllt. 0,9 %ige NaCl-Lösung 9 g NaCl werden in einen 1000 ml Messkolben eingewogen und der Kolben mit deionisiertem Wasser bis zur Marke aufgefüllt. 1 N NaH-Lösung 2 g NaH-Plätzchen werden in einem Becherglas eingewogen und mit ca. 30 ml deionisiertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wird unter Nachspülen mit deionisiertem Wasser quantitativ in einen 50 ml-meßkolben überführt und der Kolben mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung ist im Kühlschrank ca. 3 Tage haltbar und sollte nach diesem Zeitraum frisch angesetzt werden. 0,1 M Na 2 C 3 -Lösung 530 mg Na 2 C 3 (wasserfrei) werden in einem Becherglas eingewogen und in ca. 30 ml deionisiertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wird unter Nachspülen mit deionisiertem Wasser quantitativ in einen 50 ml-meßkolben überführt und der Kolben mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt.

54 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Vergleichsstandards Da die Adduktgehalte im Blut vereinbarungsgemäß als freies, addukt-tragendes Valin berechnet und angegeben werden, müssen für die Berechnung der Dipeptid- Einwaage die entsprechenden Molekulargewichte berücksichtigt werden. In Tabelle 6-1 werden die entsprechenden Einwaagen sowie die daraus resultierenden Konzentrationen zusammengefasst. Die Strukturformeln der eingesetzten Dipeptide sind in Abbildung 6-1 dargestellt. CH 3 CH 3 N C NH H 3 C NH CH 3 NH N-2-Cyanoethylvalin-Leucin-Anilid CH 3 CH 3 C NH NH NH NH 2 H 3 C CH 3 N-2-Carbamoylethylvalin-Leucin-Anilid CH 3 H 3 C NH NH NH H 3 C CH 3 N-2-Ethoxyethylvalin-Alanin-Anilid (ISTD) Abbildung 6-1: Strukturformeln der zur Kalibrierung eingesetzten Dipeptide.

55 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 44 Alle Konzentrationen beziehen sich im olgenden auf den Gesamtgehalt an addukttragendem Valin in der Lösung. Et--Et-Val (ISTD) Cyanoethylvalin N-2-Carbamoylethylvalin Molekulargewicht Dipeptid (g/mol) 335,4 358,5 376,5 Molekulargewicht addukt-tragendes 188,3 169,2 187,2 Valin (g/mol) aktor 1,78 2,12 2,01 Einwaage Dipeptid 17,8 mg 10,6 10,0 Volumen 100 ml 10 ml 10 ml Konzentration Addukt-tragendes Valin (Stammlösung) 100 mg/l 500 mg/l 500 mg/l Tabelle 6-1: Molekulargewichte der Dipeptide und der N-Alkyl-Valine sowie Einwaagen der Dipeptid-Stammlösungen Interner Standard (2-Ethoxyethylvalin-Alanin-Anilid) Etwa 17,8 mg N-2-Ethoxyethylvalin-Alanin-Anilid werden genau in einen 100 ml Messkolben eingewogen und der Kolben mit Ethanol bis zur Marke aufgefüllt. Bezogen auf das Molekulargewicht des addukt-tragenden Valins ergibt sich eine Konzentration von 100 mg/l (siehe Tabelle 6-1). 200 µl dieser Stammlösung werden in einem 20 ml-messkolben pipettiert und der Kolben mit Ethanol bis zur Marke aufgefüllt. Diese Arbeitslösung entspricht einer Konzentration von 1 mg/l Ethoxyethylvalin. Dipeptide Es werden jeweils etwa 10,6 mg N-2-Cyanoethylvalin-Leucin-Anilid sowie etwa 10,0 mg N-2-Carbamoylethylvalin-Leucin-Anilid in einen 10 ml Messkolben genau eingewogen und der Kolben mit Ethanol bis zur Marke aufgefüllt. Die so erhaltenen Stammlösungen entsprechen jeweils 500 mg/l des alkylierten Valins (siehe Tabelle 6-1). Aus den so hergestellten Stammlösungen werden nach folgendem Pipettierschema für die Analyten N-Cyanoethylvalin und N-2-Carbamoylethylvalin gemeinsame Dotierlösungen zur Herstellung von Kalibrierstandards in Poolglobin hergestellt.

56 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 45 Volumen Endvolumen Konzentration N-Alkylvalin Je 1 ml Stammlsg. 5 ml 100 mg/l Zwischenverdünnung (ZV) 100 µl ZV 10 ml 1 mg/l Arbeitslösung 2 10 µl ZV 10 ml 100 µg/l Arbeitslösung 3 Tabelle 6-2: Herstellung der Zwischenverdünnung und der Arbeitslösungen. Die so hergestellten ethanolischen Lösungen sind bei -18 C mindestens 1 Jahr ohne Verluste lagerfähig Probennahme und Probenaufbereitung Gewinnung des Erythrocytenhämolysats Nach Desinfektion der Einstichstelle werden dem Probanden 5 ml Vollblut mit Hilfe einer EDTA-Monovette entnommen. Anschließend wird das Vollblut 10 min bei maximal 800 g zentrifugiert, der lüssigkeitsstand in der Monovette markiert und die überstehende Plasmafraktion abgehoben. Die Erythrocytenfraktion wird mit 0,9%iger Kochsalzlösung wieder auf das Ursprungsvolumen aufgefüllt, auf dem Laborschüttler gut durchmischt und erneut 10 min bei 800 g zentrifugiert. Der Überstand wird wiederum abgehoben und verworfen. Diese Prozedur wird wiederholt, bis der Überstand klar und farblos ist. In der Regel sind hierzu 2 3 Waschvorgänge mit 0,9%iger Kochsalzlösung notwendig. Zur Lyse der Zellen wird das Erythrocytensediment mit Wasser wieder auf das Ursprungsvolumen aufgefüllt und bei -18 C eingefroren. Die so erhaltenen Erythrocytenlysate sind bis zu 12 Monate unverändert lagerfähig.

57 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Isolierung des Globins Zur Gewinnung des Globins werden 2 ml des Erythrocytenlysats in ein 30 ml Plastikröhrchen mit Deckel pipettiert und mit 12 ml der 50 mm HCl/Isopropanol- Lösung versetzt. Nach dem Durchmischen auf einem Vortex-Mixer (ca. 60 s) wird die Lösung bei 3500 g scharf zentrifugiert (10 min). Dabei werden ausgefällte Zell-Reste abzentrifugiert. Der klare, braun gefärbte Überstand wird in ein 20 ml-schraubglas abdekantiert und in der olge langsam mit insgesamt 8 ml Ethylacetat versetzt. Durch dieses Vorgehen wird die Proteinfraktion des gelösten Hämoglobins ausgefällt. Um eine quantitative ällung der Proteine zu gewährleisten, wird die Probe anschließend für 60 min bei 4 C gelagert. Danach wird das gefällte Globin 5 min bei 800 g abzentrifugiert. Die überstehende, braune Lösung wird verworfen und das Globin in 10 ml Ethylacetat suspendiert und intensiv auf einem Vortex-Mixer durchmischt. Das Globin wird wiederum abzentrifugiert (800 g, 5 min), das Ethylacetat verworfen und der Vorgang wiederholt. Abschließend wird das Globin in 5 ml n-hexan resuspendiert, durchmischt und nochmals abzentrifugiert. Das gereinigte Protein liegt als weiss-graues Pulver vor und wird über Nacht im Vakuumexsikkator getrocknet. Die Globin-Proben sind bei -18 C mindestens 6 Monate ohne Verluste lagerfähig. Herstellung von Poolglobin Zur Kalibrierung des Analysenverfahrens wird Poolglobin benötigt. Zu diesem Zweck werden Globine wie oben beschrieben aus Blutproben isoliert und anschließend vereinigt. Dabei liegt es nahe, zur Verwendung als Kalibriermaterial möglichst Globin zu verwenden, das einen geringen Gehalt an den Addukten Cyanoethylvalin (CEV) und N-2-Carbamoylethylvalin (AAV) enthält. Eine eventuell vorhandene hohe Hintergrundbelastung an Addukten würde die Quantifizierung im niedrigeren Konzentrationsbereich erschweren und wäre mit einer höheren analytischen Unsicherheit verbunden. Demnach sollte wenn möglich auf Blutproben von Nichtrauchern zurückgegriffen werden. Zur Herstellung von Kalibriermaterial werden 1000 mg gepooltes Globin in einem Becherglas eingewogen und unter vorsichtigem Rühren auf dem Magnetrührer in 30 ml ormamid gelöst (entspricht 100 mg Globin in 3 ml ormamid). Jeweils 3 ml der Lösung werden dann in 5 ml-schraubgläschen aliquotiert und bei -18 C eingefroren.

58 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Herstellung von Kalibrierstandards Zur Herstellung von Kalibrierstandards werden aus den nach Kap hergestellten Arbeitslösungen (AL 2 und AL 3 sowie ISTD-AL) verschiedene Volumina den aliquotierten Poolglobin-Lösungen zupipettiert. Dabei wird nach folgendem Pipettierschema vorgegangen. Standard Vol. des zuges. Standards (µl) Konzentration des Kalibierstandards ISTD-AL AL 3 AL 2 (µg N-Alkylvalin/l ormamid) LW , , , , , ,0 Tabelle 6-3: Pipettierschema zur Herstellung von Kalibrierstandards in Poolglobin Derivatisierung des Globins Zur Durchführung des modifizierten Edman-Abbaus werden ca. 100 mg des zuvor aus den zu untersuchenden Blutproben isolierten Globins (siehe 6.3.2) in ein 5-ml- Schraubglas genau eingewogen und unter Mischen auf dem Wippschüttler in 3 ml ormamid gelöst. Es werden 40 µl 1 N NaH, 100 µl der Arbeitslösung des Internen Standards (ISTD-AL) sowie 15 µl Pentafluorphenylisothiocyanat zugegeben und die Probe weiterhin für 6 8 Stunden bei Raumtemperatur auf dem Wippschüttler durchmischt. Anschließend wird die Probe für 90 Minuten im Wasserbad bei 45 C erwärmt. Nach dem Abkühlen werden nochmals 75 µl 1 N NaH zugegeben und die ormamidphase wird zweimal mit je 3 ml Diethylether extrahiert, wobei die Probe jeweils für 60 Sekunden intensiv auf einem Vortex-Mixer durchmischt wird. Zur besseren Phasentrennung erfolgt eine Zentrifugation der Proben bei g für 5 Minuten. Sollte sich dabei keine Phasentrennung einstellen, da die Proteinmatrix eine gelartige Konsistenz angenommen hat, kann die Probe erneut kurz gevortext und wiederum bei 4500 g zentrifugiert werden. Die vereinigten Etherphasen werden unter einem leichten Stickstoffstrom bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 1,5 ml Toluol aufgenommen. Die Toluolphase wird anschließend nacheinander mit 2 ml Wasser und 2 ml 0,1 M

59 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 48 Na 2 C 3 -Lösung gewaschen. Dazu wird die Probe jeweils für 60 s auf dem Vortex- Mixer intensiv durchmischt und anschließend bei 800 g für 5 min zentrifugiert. Schließlich wird die Toluolphase abgehoben und in eine 2 ml-rollrandampulle überführt. Die Probe wird im Stickstoffstrom bis zur Trockne eingeengt, wobei ein leichtes Erwärmen mit einem Magnetrührer erfolgen kann. Der Rückstand wird in 30 µl Toluol resuspendiert und in ein Mikrovial überführt. Das Gläschen wird schließlich mit einer teflonkaschierten Aluminiumverschlusskappe verschlossen. 1 µl dieser Lösung wird in den Gaschromatographen injiziert Gaschromatographisch-massenspektrometrische Arbeitsbedingungen Kapillarsäule DB 17-HT 30 m x 0,25 mm, 0,15 µm ilmdicke (J & W Scientific, olsom, CA, USA) Trägergas Helium 5.0 lussgeschwindigkeit 1,25 ml/min (constant flow) Injektion 1 µl, splitless Inlet purge off time 1 min Gerätetemperaturen Injektor 280 C Transferline 300 C Säulenofen 90 C, 1 min halten 25 C/min auf 120 C 5 C/min auf 240 C 25 C/min auf 280 C, 20 min halten Ionisierung Elektronenstoßionisation Ionisierungsenergie 70 ev Detektion Selected Ion Monitoring (SIM) Messzeit pro Ion (dwell time) 80 ms Elektronenmultiplier V rel (~2600 V)

60 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Analytische Bestimmung Je 1 µl der nach aufgearbeiteten Proben wird splitless in das GC/MS-System injiziert. Die Identifizierung der Pentafluorphenylthiohydantoine erfolgt anhand der Retentionszeit und dem Verhältnis der charakteristischen Ionenspuren, die für die Analyten aufgenommen werden. Die EI-Massenspektren sowie das ragmentierungsschema der Analyten sind im Anhang dieser Arbeit abgebildet. In Tabelle 6-4 werden die Retentionszeiten sowie die aufgenommenen Ionenspuren für die einzelnen Analyten unter den angegebenen Bedingungen dargestellt. Die zur Quantifizierung herangezogenen Ionenspuren sind unterstrichen. Es ist dabei zu betonen, dass die hier dargestellten Verhältnisse der Ionenspuren lediglich als Anhaltspunkt dienen können und abhängig von den Geräteeinstellungen teilweise deutlichen Schwankungen unterliegen können. Analyt R (t) Registrierte Verhältnis Ionenspuren (min) (m/z) N-Ethoxyethylvalin (ISTD) , 363 ~ 1 : 3,6 N-2-Cyanoethylvalin (CEV) , 377 ~ 2 : 1 N-2-Carbamoylethylvalin (AAV) , 378, (363) ~ 1 : 3,8 Tabelle 6-4: Retentionszeiten und detektierte Ionenspuren für die Analyten. Abbildung 6-2 zeigt beispielhaft das Chromatogramm der aufgearbeiteten Blutprobe eines Rauchers aus der Allgemeinbevölkerung.

61 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 50 Abundance 5665 ISTD Ion ( to ) Time--> Abundance Time--> Ion ( to ) Abundance CEV Ion ( to ) Time--> 0 Abundance 2814 Time--> 0 Abundance Ion ( to ) Ion ( to ) AAV Time--> Abundance Ion ( to ) Time--> Abbildung 6-2: Chromatogramm der aufgearbeiteten Blutprobe eines Rauchers aus der Allgemeinbevölkerung. Die hier dargestellte Probe enthielt eine Addukt- Konzentration von 106 pmol/g Globin N-2-Cyanoethylvalin (CEV) und 50 pmol/g Globin N-2-Carbamoylethylvalin (AAV).

62 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Kalibrierung Die Kalibrierung erfolgt mit Vergleichsstandards, die in aufgelöstem Poolglobin angesetzt werden und in der gleichen Weise behandelt werden wie die zu analysierenden Proben. Als interner Standard wird den Vergleichstandards und den zu analysierenden Proben N-2-Ethoxyethylvalin-Alanin-Anilid zugesetzt. Die gemäß hergestellten Kalibrierstandards werden entsprechend den zu analysierenden Proben nach aufgearbeitet und in das GC/MS-System injiziert. Kalibrierkurven werden erstellt, indem der Quotient der integrierten Peakflächen der einzelnen Addukte (lediglich die in Tab. 6-4 angegebenen Quantifier-Ionen werden berücksichtigt) und des Internen Standards gebildet wird und gegen die zudotierte Konzentration im Kalibrierstandard (in µg N-Alkylvalin/l ormamid) aufgetragen wird. Die Kalibrierkurven sind im Bereich bis zu 10 µg/l ormamid linear. Dieser Bereich ist für umweltmedizinische ragestellungen ausreichend. Die Linearität der Kalibrierkurven ist auch bis zu 40 µg/l ormamid gegeben. Aus praktischen Gründen wurde auf den hohen Bereich der Kalibrierung allerdings verzichtet. Abbildung 6-3 zeigt beispielhaft die Kalibrierkurven für N-2-Cyanoethylvalin und N-2- Carbamoylethylvalin im angegebenen Bereich Berechnung des Analysenergebnisses Zur Bestimmung des Gehaltes an Addukt-tragendem Valin in aufgearbeiteten Blutproben wird für jede Probe der Quotient Q aus den integrierten Peakflächen des jeweiligen Analyten und des internen Standards gebildet. Mit Hilfe der Steigung der Kalibrierkurve B kann somit die Konzentration C der Probe nach folgender ormel berechnet werden: C= Q/B Der Achsenabschnitt der Kalibrierkurve (siehe auch Abb. 6-2) ist bedingt durch den physiologischen Adduktgehalt des zur Kalibrierung eingesetzten Poolglobins und muss daher nicht bei der Berechnung berücksichtigt werden. Mit Hilfe der oben genannten Gleichung erhält man die Konzentration der Probe in µg N-Alkylvalin pro Liter ormamid. Der Adduktgehalt des Globins wird üblicherweise in der nationalen und internationalen Literatur auf ein Gramm Globin bezogen und

63 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 52 als pmol/g Globin angegeben. Zur Umrechnung wird der aus der Kalibrierkurve ermittelte Messwert mit folgender ormel umgerechnet: Adduktgehalt (pmol/g Globin) = Meßwert (µg Addukt/l ormamid) x 0,003 L 0,1 g Globin x Molgewicht des N-Alkylvalins mit M (N-Cyanoethylvalin) = 169,2 g/mol = 169,2 x 10-6 µg/pmol und M (N-Carbamoylethylvalin) = 187,2 g/mol = 187,2 x 10-6 µg/pmol ergeben sich demnach folgende Umrechnungsfaktoren für die beiden Analyten: N-Cyanoethylvalin (pmol/g Globin) = Messwert (µg/l ormamid) x 177,3 N-Carbamoylethylvalin (pmol/g Globin) = Messwert (µg/l ormamid) x 160,3 Der Adduktgehalt kann auch in µg Addukt-tragendes Valin pro Liter Blut angegeben werden. Dies gilt unter der Annahme, dass der durchschnittliche Globingehalt des Blutes etwa 144 g/l 78 beträgt und der Beitrag der 4 Hämgruppen zum Gesamt- Molekulargewicht des Hämoglobins von 64 kda vernachlässigt werden kann. Die Umrechnung erfolgt dann anhand folgender ormel: Adduktgehalt (µg/l Blut) = Adduktgehalt (pmol/g Globin) Molgewicht des N-Alkylvalins x 144 g/l mit M (N-Cyanoethylvalin) = 169,2 g/mol = 169,2 x 10-6 µg/pmol und M (N-Carbamoylethylvalin) = 187,2 g/mol = 187,2 x 10-6 µg/pmol ergeben sich also folgende Umrechnungsfaktoren für die beiden Analyten: N-Cyanoethylvalin (µg/l Blut) = N-Cyanoethylvalin (pmol/g Globin) x 0,025 N-Carbamoylethylvalin (µg/l Blut) = N-Carbamoylethylvalin (pmol/g Globin) x 0,0271 Eine alternative Vorgehensweise besteht darin, die den Kalibrierstandards zudotierte Menge an Analyten bereits in die gewünschte Konzentrationsangabe (pmol/g Globin

64 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 53 bzw. µg/l Blut) anhand der hier dargestellten ormeln umzurechnen und entsprechend in die Kalibrierkurve einzusetzen. Der Gehalt aufgearbeiteter Proben berechnet sich dann entsprechend mit Hilfe der Steigung nach oben genannter ormel.

65 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 54 Kalibrierkurve N-2-Cyanoethylvalin 5 4,5 4 y = 0,4597x + 0,0328 R 2 = 0,9998 3,5 Quotient 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 zudotierte Menge [µg/l ormamid] Kalibrierkurve N-2-Carbamoyl-ethylvalin 1,4 1,2 y = 0,116x + 0,0059 R 2 = 0,999 1 Quotient 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 zudotierte Menge [µg/l ormamid] Abb. 6-3: Kalibrierkurven für N-2-Cyanoethylvalin und N-2-Carbamoylethylvalin in Poolglobin.

66 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Qualitätssicherung Zur Sicherung der Qualität der erhaltenen Analysenergebnisse werden in jeder Serie zwei Qualitätskontrollproben mitanalysiert. Da zertifiziertes Kontrollmaterial kommerziell nicht erhältlich ist, wurde zu diesem Zweck einem Nichtraucher (Q niedrig ) und einem Raucher (Q hoch ) jeweils ca. 20 ml Blut entnommen und daraus Kontrollglobin hergestellt. Die Herstellung und Aufarbeitung des Kontrollmaterials erfolgt wie in Kapitel 6.3. beschrieben. Die Abbildungen 6-4 bis 6-6 zeigen die Qualitätskontrollkarten für die Raucher- bzw. Nichtraucherprobe. Da N-2-Cyanoethylvalin im Blut von Nichtrauchern nicht nachweisbar ist, wurde nur eine Qualitätskontrollkarte geführt. Eingezeichnet sind jeweils der Mittelwert (Sollwert) sowie die zweifache Standardabweichung (obere bzw. untere Warngrenze) und die dreifache Standardabweichung (obere bzw. untere Kontrollgrenze). 137 Q hoch N-2-Carbamoylethylvalin MW = 86,2 pmol/g Globin; s = 13 pmol/g Globin = 14,7 % 124 MW + 3 sd AAV (pmol/g Globin) MW + 2 sd MW MW - 2 sd 48 MW - 3 sd Analysenserie Abb. 6-4: Qualitätskontrollkarte Q hoch der Bestimmung von N-2-Carbamoylethylvalin (AAV). MW = Mittelwert, sd = Standardabweichung.

67 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Q niedrig N-2-Carbamoylethylvalin MW = 18,5 pmol/g Globin; sd = 4,9 pmol/g Globin = 26,4 % 33 AAV (pmol/g Globin) Analysenserie Abb. 6-5: Qualitätskontrollkarte Q niedrig der Bestimmung von N-2-Carbamoylethylvalin (AAV). MW = Mittelwert, sd = Standardabweichung. 223 Q N-2-Cyanoethylvalin MW = 167,1 pmol/g Globin; sd = 14 pmol/g Globin = 8,4 % 209 MW + 3 sd CEV (pmol/g Globin) MW + 2 sd MW MW - 2 sd 125 MW - 3 sd Analysenserie Abb. 6-6: Qualitätskontrollkarte Q der Bestimmung von N-2-Cyanoethylvalin (CEV). MW = Mittelwert, sd = Standardabweichung.

68 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Beurteilung des Verfahrens Präzision Zur Ermittlung der Präzision in der Serie sowie von Tag zu Tag wurde das unter Kap beschriebene Globin eines Rauchers bzw. eines Nichtrauchers analog Kap aufgearbeitet. Die Präzision in der Serie wurde jeweils an 5 Proben bestimmt. Probe CEV AAV Q hoch (n=5) Mittelwert (pmol/g Globin) Stdabw. (pmol/g Globin) Stdabw. (%) 7,6 13,1 Q niedrig (n=5) Mittelwert (pmol/g Globin) < 4 20 Stdabw. (pmol/g Globin) Stdabw. (%) Tabelle 6-5: Präzisionen in der Serie. CEV: N-2-Cyanoethylvalin, AAV: N-2- Carbamoylethylvalin Die Präzision von Tag zu Tag wurde anhand der aufgearbeiteten Globinproben aus zehn aufeinanderfolgenden Analysenserien ermittelt (siehe auch Kap Qualitätssicherung). Probe CEV AAV Q hoch (n=10) Mittelwert (pmol/g Globin) 167,1 86,2 Stdabw. (pmol/g Globin) Stdabw. (%) 8,4 9,7 Q niedrig (n=10) Mittelwert (pmol/g Globin) < 4 18,5 Stdabw. (pmol/g Globin) --- 4,9 Stdabw. (%) ,4 Tabelle 6-6: Präzisionen von Tag zu Tag. CEV: N-2-Cyanoethylvalin, AAV: N-2- Carbamoylethylvalin

69 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Richtigkeit und Robustheit der Methode Zur Überprüfung der Richtigkeit der hier vorgestellten Methode müsste ein Globin mit einem definierten Adduktgehalt (Referenzmaterial) untersucht und die mit Hilfe der Dipeptid-Kalibrierung erhaltenen Ergebnisse mit dem definierten Sollwert verglichen werden. Da ein solches Globin nicht zur Verfügung steht, kann die Richtigkeit der Methode nicht abschließend beurteilt werden. Da die Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivate der Addukte als Analyten ebenfalls nicht käuflich erhältlich sind und erst im Laufe der Aufarbeitung aus den Addukten bzw. den Dipeptiden entstehen, können auch die aufarbeitungsbedingten Verluste nicht bestimmt werden. Um einen möglichen Einfluss unterschiedlicher Matrices auf das Analysenergebnis zu untersuchen, wurde die Wiederfindung in unterschiedlichen Individualglobinen untersucht. Zu diesem Zweck wurden je zwei Nichtraucher- und zwei Raucherglobine in einer Doppelbestimmung jeweils undotiert und mit einer Dotierung von 1 µg Dipeptid/l ormamid (entspricht 176 pmol/g Globin N-2-Cyanoethylvalin und 160 pmol/g Globin N-2-Carbamoylethylvalin) analysiert. Aus den erhaltenen Ergebnissen wurde die relative Wiederfindung bestimmt. Mit Hilfe dieser Vorgehensweise kann ein eventuell auftretender Effekt unterschiedlicher Matrices auf das Analysenergebnis abgeschätzt werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 6-7 zusammengefasst. Es zeigen sich in diesem Versuch nur geringfügige Ab weichungen zwischen dotiertem und gefundenem Wert in Abhängigkeit von der Matrix, die zwischen % für CEV und % für AAV liegen. Tendenziell zeigen dabei die Raucherglobine im Vergleich zu den Nichtraucherglobinen eine Abweichung zu höheren Werten. Dies kann zumindest als Indiz dafür gewertet werden, dass die Art des für die Kalibrierung verwendeten Globins (sprich: Raucher- bzw. Nichtraucher) einen Einfluss auf den absoluten Messwert hat. Dennoch sei darauf hingewiesen, dass die hier gezeigten Abweichungen durchaus im Bereich der üblichen Schwankungsbreite der Methode liegen. Ein Matrixeffekt kann somit nicht mit absoluter Sicherheit bestätigt werden. Die Richtigkeit und vor allem die Robustheit der hier vorgestellten Methode können somit im Rahmen der durchgeführten Überprüfung als gut bezeichnet werden.

70 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 59 NR 1 NR 2 R 1 R 2 CEV AAV CEV AAV CEV AAV C EV AAV Leerwer t (pmol/ g Globin ) Dotierung ( pmol/g Globin) < < LW + Dotierun g (pmol/ g Globin) 178 * * Gefundene r Wert ( pmol/g Globin) Rel. Wieder findung % % % % % % % % Tab elle 6-7 : Wiederfindung in unterschiedlichen Globinmatrices. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte aus ei ner Doppelbestimm ung. NR: Nichtraucher, R : Raucher. CE V: N-2-Cyanoethylva lin, AA V: N-2-Carbamo ylethylvalin. * Werte kleiner Nachweisgrenz e werde n mi t halber Nachweisgrenze berechne t.

71 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 60 Zur weiteren Überprüfung der Richtigkeit wurde von Seiten des Arbeitskreises Analysen in biologischem Material der Deutschen orschungsgemeinschaft im ebruar 2004 ein Ringversuch organisiert, an dem sich insgesamt 4 deutsche Laboratorien (einschließlich des Instituts für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin (IPASUM)) beteiligten. Zu diesem Zweck wurde einem Raucher eine angemessene Menge Blut (ca. 10 EDTA-Röhrchen) entnommen und am IPASUM die Erythrocyten isoliert, gewaschen und lysiert. Die so erhaltenen Erythrocytenlysate wurden tiefgefroren mit Hilfe von Trockeneis an die teilnehmenden Laboratorien verschickt. Die Wahl der Methode sowie des Kalibrierverfahrens war den Laboratorien dabei freigestellt. Die für diese Probe in den Laboratorien erhaltenen Resultate sind in Tabelle 6-8 zusammengefasst. Labor CEV (pmol/g Globin) AAV (pmol/g Globin) Erlangen (IPASUM) La bor Labor Labor Mittelwert aller Teilnehmer 92,5 75 Stdabw. 39,3 23,2 Tabelle 6-8: Ergebnisse eines Ringversuchs zur Bestimmung von Acrylnitril- und Acrylamid-Hämoglobin-Addukten. Zur Beurteilung der Ergebnisse der Ringversuchsteilnehmer kann der so genannte z- Score herangezogen werden. Der z-score stellt ein Maß für die Abweichung einer Analyse vom mittleren Analysenwert dar. Die Abweichung eines Messwerts ist dabei umso geringer, je kleiner der Wert des z-scores ist. Der z-score wird nach folgender ormel berechnet: Z-Score z = Mittelwert (X) Meßwert (xy) Standardabweichung (X)

72 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 61 Mit: Mittelwert (X) = Mittelwert aller Teilnehmer Meßwert (xy) = Messwert des Teilnehmers xy Stdabw (X) = Standardabweichung der Mittelwerte aller Teilnehmer Ergeben sich für die genannten Parameter somit für die einzelnen Teilnehmer folgende z-scores: Erlangen Labor 2 Labor 3 Labor 4 CEV 0,34 0,88 0,22 1,44 AAV 0,43 1,21 0,91 0,73 Tabelle 6-9: z-scores der Ringversuchsteilnehmer. bwohl die Aussagekraft des z-scores aufgrund der geringen Teilnehmerzahl deutlich eingeschränkt ist, lässt sich doch erkennen, dass die Methode in Anbetracht der äußerst aufwendigen und anspruchsvollen Analytik zu sehr gut vergleichbaren Ergebnissen führt Nachweisgrenze Unter den angegebenen Bedingungen für die Probenaufbereitung konnten auf der Basis des dreifachen Signal-Rausch-Verhältnisses des GC/MS-Systems für die Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivate folgende Nachweisgrenzen abgeschätzt werden. Analyt pmol/g Globin Nachweisgrenzen µg/l Blut CEV 4 0,1 AAV 12 0,3 Tabelle 6-10: Nachweisgrenzen der Methode in pmol/g Globin und µg/l Blut. CEV: N-2-Cyanoethylvalin, AAV: N-2-Carbamoylethylvalin.

73 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Störeinflüsse Um die Reinheit des verwendeten Globins gewährleisten zu können, ist es äußerst wichtig, dass vor der ällung aus Erythrocytenlysat remdproteine so weit wie möglich abgetrennt werden. Diese Proteine könnten bei der Prozedur mit ausgefällt werden und so das Ergebnis verfälschen. Dies betrifft vor allem Serumproteine, wie etwa Albumin oder auch das Dipeptid Glutathion. Deshalb ist es von grosser Bedeutung, das Waschen der Erythrocyten mit 0,9%iger Kochsalzlösung sorgfältig durchzuführen, bevor die Isolierung des Globins erfolgt. Auch die Waschschritte mit Ethylacetat sind sorgfältig durchzuführen, bis ein klarer, ungefärbter Überstand erreicht ist. Ein Einfluss der Lagerung des Erythrocytenlysats (bei 18 o C) konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht festgestellt werden. Das Erythrocytenlysat eines Rauchers (siehe Kap. 6.8) zeigte über einen Zeitraum von ca. einem Jahr keine signifikante Veränderung des CEV- und AAV-Adduktgehaltes. Auf die Derivatisierungsausbeute des modifizierten Edman-Abbaus hat die Reinheit des dazu verwendeten ormamids einen grossen Einfluss. Auch reines ormamid enthält herstellungsbedingt immer Verunreinigungen mit Ammoniak oder Aminen, die den ph-wert der Reaktionslösung beeinflussen können und somit zu unerwünschten Nebenreaktionen und damit einer verminderten Reaktionsausbeute des modifizierten Edman-Abbaus führen können. Um lagerungsbedingte Verunreinigungen zu vermeiden, empfiehlt sich für das verwendete ormamid dauerhaft die Lagerung bei 18 o C. Mit dem in dieser Arbeit verwendeten ultrareinen ormamid der irma USB Biochemicals (Reinheit > 99,8 %, ph-wert 6-7) wurden bisher sehr gute Erfahrungen gemacht. Dennoch zeigten sich auch hier deutliche Unterschiede zwischen verschiedenen Chargen, die unter Umständen Einfluss auf die mit dieser Methode erreichbaren Nachweisgrenzen haben können. Von entscheidender Bedeutung für die Erstellung einer Kalibrierkurve ist, daß die Kalibrierstandards in Globinlösungen angesetzt werden. Wie bereits in Kap und dargelegt, sollte die Kalibrierung in gepooltem Globin von Nichtrauchern erfolgen. Die Kalibrierung mit Hilfe der Dipeptid-Standards in reinem ormamid ohne Proteinmatrix führte unter gleichen Bedingungen zu ganz erheblichen Störungen in der Chromatographie sowie zu minimalsten Ausbeuten im Edman-Abbau. Diese Tatsache erschwert in der Praxis etwas die chromatographische Suche nach den entsprechenden Pentafluorphenylthiohydantoin-Analyten, da die Analyten erst im

74 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 63 Zuge der Aufarbeitung aus den Dipeptiden gebildet werden. Hierzu kann der Vergleich der Chromatogramme eines undotierten sowie eines sehr hoch dotierten Poolglobin-Standards (ca. 1 mg/l) im SCAN-Modus des Massenspektrometers hilfreich sein. Die Gründe für diesen Effekt sind derzeit unbekannt. Es darf angenommen werden, dass das Vorhandensein der Proteinmatrix mit ihren zahlreichen kationischen und anionischen Aminosäure-Resten einen gewissen puffernden Effekt auf den ph-wert der Lösung während des Edman-Abbaus hat. Da für den modifizierten Edman-Abbau eine weitgehend neutrale Lösung erforderlich ist und es im Zuge der Reaktion zu einer Erniedrigung des ph-wertes kommt (siehe Kapitel 3.3), erscheint diese Erklärung plausibel. Ein weiterer Störeinfluss ist das mögliche Gelieren der derivatisierten Proben während der Extraktion mit Diethylether. Die Proteinmatrix kann in einigen ällen als Emulgator wirken und zu einer gelartigen Konsistenz des ormamid-diethylether- der Analyten bis hin zum Gemisches führen, wodurch keine Phasentrennung mehr möglich ist. Es konnten bisher keine signifikanten Einflussfaktoren für das Auftreten dieses Effektes bestimmt werden. Die Zugabe von 75 µl 1 N NaH vor dem Extrahieren der ormamid-phase mit Diethylether verhindert hier sehr effizient das Gelieren der Proben. Durch die Erhöhung des ph-wertes kommt es dabei teilweise zu einer Proteinfällung, die für die Extraktionsausbeute der Pentafluorphenylthiohydantoinderivate (speziell AAV) sehr positive Effekte zeigte. In einigen ällen zeigte sich im Bereich des internen Standards auf der zur Qualifizierung registrierten Ionenspur m/z 363 ein analytischer Störuntergrund, der allerdings in der Regel die Quantifizierung des Internen Standards auf der Ionenspur m/z 396 nicht beeinträchtigte. Das Auftreten des so genannten rontings in den Peaks Auftreten von Doppelpeaks deutet auf Verschmutzungen am Injektionssystem und/oder am Beginn der analytischen Säule hin und lässt sich durch Wechseln des Liners sowie ein Kürzen der Säule leicht beheben.

75 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils Diskussion der Methode Mit der hier vorgestellten Methode lassen sich die Addukte von Acrylnitril und Acrylamid am N-terminalen Valin des Hämoglobins im umweltmedizinischen Konzentrationsbereich spezifisch, empfindlich und reproduzierbar nachweisen. Die Probenaufarbeitung ist vergleichsweise aufwendig und dauert ausgehend von Vollblut etwa 3 Tage. Eine routinierte Laborkraft (ganztags) kann in einer Woche circa 48 Proben (inclusive Kalibrierstandards und Qualitätskontrollmaterial) aufarbeiten. ür größere Serien ist es dabei nicht erforderlich, jedes Mal eine vollständige Kalibrierkurve aufzunehmen. Es genügt, mit Hilfe des Poolglobin-Leerwertes sowie eines Kalibrierstandards eine Ein-Punkt-Kalibrierung durchzuführen. Sollten im Zuge der Qualitätskontrolle größere Abweichungen auftreten, wird das erneute Aufnehmen einer vollständigen Kalibrierung sowie eine Überprüfung der Standards empfohlen. Ein erheblicher Vorteil der Methode im Vergleich mit bisher veröffentlichten 25,26 Arbeiten besteht im Einsatz eines Single-Quadrupol-Massenspektrometers im robusten EI-Modus zum massenspektrometrischen Nachweis der Thiohydantoine. Der Verzicht auf die wesentlich störanfälligere Negative Chemische Ionisation, die darüber hinaus große Erfahrung des Personals vorraussetzt, ist eine wesentliche Vorraussetzung für die Routinefähigkeit dieser Methode und ihre mögliche Anwendung auf größere Kollektive. Die erzielten Nachweisgrenzen sind im Vergleich zur Tandem-Massenspektrometrischen Detektion im NCI-Modus zwar um den 20,22,25 aktor 2 bis 3 schlechter, aber dennoch ausreichend für die Bestimmung der Hintergrundbelastung der Allgemeinbevölkerung. Ein weiterer Vorteil dieser Methode liegt in der Art der Kalibrierung mit Hilfe von Dipeptid-Standards. Während in zahlreichen bisher veröffentlichten Arbeiten Globine mit einem vorher aufwendig mit radiochemischen Methoden bestimmten Adduktgehalt zur Kalibrierung eingesetzt wurden, liegt nun in Gestalt der (bei der a. Bachem erhältlichen) Dipeptid-Standards eine definierte und chemisch vollständig charakterisierte Standardsubstanz gegebener Reinheit vor. Dies bietet somit eine äußerst elegante Möglichkeit der Quantifizierung, da diese Standards ebenfalls den gesamten Aufarbeitungsprozess durchlaufen und mögliche Verluste oder niedrigere Derivatisierungsausbeuten sehr gut kompensieren können. 25

76 Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Acrylnitrils 65 Die Präzisionsdaten der Methode können vor dem Hintergrund der sehr aufwendigen Analytik als gut bezeichnet werden. Dabei sollte erwähnt werden, dass für diese Bestimmungen jeweils von zuvor isoliertem Globin ausgegangen wurde, d. h. die ermittelten Werte beinhalten auch den möglichen ehler beim Einwiegen des Globins und sind daher sehr gut geeignet, die Präzision der Methode unter realen Bedingungen zu beurteilen. Im untersuchten Raucherglobin (Q hoch ) betrug die Präzision von Tag zu Tag für N- Cyanoethylvalin (CEV) 8,4 % sowie für N-2-Carbamoylethylvalin (AAV) 13,1 %. Im untersuchten Nichtraucherglobin (Q niedrig ) kann die Präzision von Tag zu Tag für AAV mit einem Wert von 26,4 % jedoch nur als zufriedenstellend bezeichnet werden. Die Konzentration an AAV in dieser Probe lag jedoch mit einem Mittelwert von 18,5 pmol/g Globin in der Nähe der für dieses Addukt angegebenen Nachweisgrenze von 12 pmol/g Globin. Da im Bereich der Nachweisgrenze einer Methode naturgemäß eine größere Unsicherheit in der Quantifizierung besteht, können die hier ermittelten Daten als akzeptabel angesehen werden. Zur Prüfung der Richtigkeit der Methode wurden Wiederfindungsversuche in unterschiedlichen Matrices durchgeführt. Dazu wurden Globine ohne und mit Zugabe definierter Mengen der entsprechenden Dipeptid-Standards analysiert. Die relativen Wiederfindungsraten für CEV betrugen zwischen 85 und 113 % und für den Parameter AAV zwischen 88 und 111 % bei einer dotierten Konzentration von 176 bzw. 160 pmol/g Globin. Damit kann die Richtigkeit der Methode als gut bezeichnet werden. Durch den Vergleich der verwendeten Raucher- und Nichtraucherglobine konnte ein Matrixeffekt nicht eindeutig belegt werden, obwohl die Raucherglobine tendenziell höhere Wiederfindungsraten zeigten. Eine Richtigkeitsbestimmung auf der Basis der aufarbeitungsbedingten Verluste erfolgte nicht, da keine entsprechenden Referenzsubstanzen der Pentafluorphenylthiohydantoine zur Verfügung stehen. Zur weiteren Überprüfung der Richtigkeit wurde ein Ringversuch mit 3 weiteren Laboratorien durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Ergebnisse der Laboratorien für beide Parameter eine erfreulich gute Übereinstimmung zeigten, die sich in niedrigen z-score Ergebnissen manifestiert. Das hier vorgestellte Verfahren stellt somit eine relativ robuste Analysenmethode dar, die sich durch niedrige Nachweisgrenzen und gute Präzisionsdaten auszeichnet.

77 Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung 7.1. Hintergrund Die Anwendung der hier erarbeiteten Methode auf ein Kollektiv der Allgemeinbevölkerung liefert wertvolle Hinweise auf die tatsächliche innere Belastung des Menschen gegenüber den krebserzeugenden Substanzen Acrylamid sowie Acrylnitril. Dabei ist auch von besonderem Interesse, inwiefern der Konsum von Zigaretten zur inneren Belastung beider Substanzen beiträgt. Darüber hinaus stellt sich die rage, ob die tägliche umweltbedingte Aufnahme von Acrylamid über die Nahrung auch bei Nichtraucherm zu einer messbaren Belastung in orm des Acrylamid-Hämoglobin-Adduktes führt. Aus den kinetischen Daten der Hämoglobin-Addukte sowie bereits bekannten Messgrößen (z. B. der Bindungskonstante von Acrylamid an das N-terminale Valin) lassen sich ferner auf individueller Basis Abschätzungen der täglich aufgenommenen Dosis durchführen. Auf diese Weise kann die mit der Aufnahme von Acrylamid verbundene Beanspruchung erkannt und gegebenenfalls abgesenkt werden. Auch könnten durch die Anwendung des biologischen Effektmonitorings etwaige Risikogruppen erkannt werden. Um nun eine erste Abschätzung der inneren Exposition in der deutschen Allgemeinbevölkerung durchführen zu können, wurde von uns eine Gruppe von Personen ohne berufliche Belastung gegenüber Acrylamid mit Hilfe der hier vorgelegten Methode auf die Hämoglobin-Addukte von Acrylamid (N-2- Carbamoylethylvalin, AAV) und Acrylnitril (N-Cyanoethylvalin, CEV) untersucht.

78 Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung Kollektivbeschreibung Das Kollektiv bestand aus insgesamt 72 erwachsenen Personen (63 Männer, 9 rauen), die im Großraum München bzw. Nürnberg wohnen. Das Alter der Personen lag zwischen 19 und 59 Jahren mit einem Altersmedian von 34 Jahren. Die Blutproben wurden im November 2000 gewonnen, die Erythrocyten isoliert und o lysiert und bei 18 C eingefroren. Einige Wochen danach erfolgte dann die Analyse der Hämoglobin-Addukte. 62 der untersuchten Personen waren Angestellte einer irma, die bei der Produktion von Emulgatoren und Detergentien potentiell beruflichen Kontakt gegenüber Ethylenoxid und Propylenoxid hatten und in einer früheren Studie bereits auf die entsprechenden Globin-Addukte (N-2-Hydroxyethylvalin und N-(R,S)-2-79 hydroxypropylvalin) untersucht wurden. erner sind in diesem Kollektiv noch 10 Personen aus unserem Labor enthalten. Da ein beruflicher Kontakt mit Acrylamid bzw. Acrylnitril für alle untersuchten Personen ausgeschlossen werden kann, entschieden wir uns, beide Gruppen zu vereinen und mit Bezug auf die umweltbedingte Hintergrundbelastung durch Acrylamid neu zu bewerten. bwohl die untersuchte Personengruppe somit nicht als repräsentativ für die Allgemeinbevölkerung gewertet werden kann, sollten unsere Ergebnisse doch eine erste Aussage über die Höhe der inneren Belastung mit Acrylamid in Deutschland erlauben. Besonders wichtig für die Beurteilung ist dabei die Hintergrundbelastung in der nichtrauchenden Allgemeinbevölkerung. Acrylnitril wurde - ebenso wie Acrylamid - als Bestandteil des Tabakrauchs identifiziert. Demnach bietet es sich an, durch die parallele Bestimmung des Acrylnitril-Addukts den individuellen Raucherstatus der untersuchten Personen festzulegen. In der Tat hat sich die Bestimmung des Hämoglobin-Addukts von Acrylnitril (N- Cyanoethylvalin, CEV) in einer Vielzahl von Studien als ein spezifischer und sehr empfindlicher Parameter für die Abschätzung der individuellen Rauchgewohnheiten erwiesen 24,26. Durch die Erfassung dieses Addukts kann der Raucherstatus einer Person damit über einen längeren Zeitraum erfasst werden als über die Ausscheidung des Nicotin-Metaboliten Cotinin. Das Kollektiv wurde folglich anhand des im Blut gemessenen Acrylnitril-Adduktes (N- Cyanoethylvalin, CEV) in Raucher und Nichtraucher unterteilt. Jede Person mit

79 Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung 68 nachweisbaren Mengen dieses Addukts (Nachweisgrenze: 4 pmol/g Globin) wurde als Raucher eingestuft. Parallel dazu wurde in einem ragebogen das Rauchverhalten der Personen abgefragt, um Informationen über die Anzahl der täglich gerauchten Zigaretten zu erhalten. Demnach bestand das Kollektiv aus 25 Nichtrauchern im Alter von 21 bis 59 Jahren mit einem Altersmedian von 37 Jahren. erner wurden 47 Raucher (Altersmedian: 32 Jahre, Bereich Jahre) untersucht. Die Angaben der Personen über ihr Rauchverhalten lagen zwischen 2 und 40 täglich gerauchten Zigaretten mit einem Median von 20 Zigaretten/Tag. Die Bestimmung der Globin-Addukte erfolgt nach der in Kap. 6 vorgestellten Methode. Die statistische Auswertung und die Berechnung der Ergebnisse erfolgten mit Microsoft Excel 2000 und Microcal rigin Ergebnisse des biochemischen Effektmonitorings Die Ergebnisse des biochemischen Addukt-Monitorings für das untersuchte Kollektiv, aufgeteilt in Nichtraucher und Raucher, sind in Tabelle 7-1 zusammengefasst. Demnach konnte eine Hintergrundbelastung durch Acrylamid auch in der nichtrauchenden Allgemeinbevölkerung anhand der Hämoglobin-Addukte nachgewiesen werden. Im Median beträgt diese Hintergrundbelastung 21 pmol/g Globin, das entspricht etwa 0,6 µg Addukt/l Blut. Die im Blut von Rauchern nachgewiesenen Konzentrationen sind deutlich höher. Der Median-Wert für das Acrylamid-Addukt bei Rauchern beträgt 85 pmol/g Globin (entsprechend 2,3 µg Addukt/l Blut) und ist damit 4fach höher als in Nichtrauchern. Der Unterschied zwischen Rauchern und Nichtrauchern wird in der in Abbildung 7-1 gezeigten relativen Häufigkeitsverteilung für AAV verdeutlicht. Das entsprechende Acrylnitril-Addukt CEV konnte bei Rauchern mit einem Medianwert von 109 pmol/g Globin (2,7 µg Addukt/l Blut) gefunden werden. Erwartungsgemäß war dieses Addukt bei den Nichtrauchern nicht nachweisbar.

80 Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung 69 Acrylnitril-A ddukt ( CEV) Acrylamid-Add ukt ( AAV) (pmol/g Globin) ( µ g/ l Blut) (pmol/ g Globi n) ( µ g/l Blut) Nichtraucher (n=25) Raucher (n=47) N WG 4 0, 1 12 Medi an < 4 < 0, Perzen til < 4 < 0,1 Berei ch < 4 < 0,1 < < 0,3 1,4 Medi an 109 2, Perzen til 238 5, Berei ch ,2 6, ,4 8, ,3 0,6 1,3 2,3 4,3 Tabelle 7-1: Hämoglobin-Addukte von Acrylnitril und Acryla mid im Blut vo n Nichtrauchern und Rauchern.

81 Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung 70 99,9 rel. Summenhäufigkeit (%) Nichtraucher (n=25) Raucher (n=47) N-2-Carbamoylethylvalin (pmol/g Globin) 300 Abb. 7-1: Relative Summenhäufigkeit für die N-2-Carbamoylethylvalin-Konzentration (AAV) im Blut von Nichtrauchern und Rauchern. Daneben wurde im Zuge unserer Untersuchungen der Einfluss des Zigarettenrauchens auf den Adduktspiegel untersucht. Dazu wurden die gemessenen Addukte mit den im ragebogen angegebenen Rauchgewohnheiten korreliert. ür Nichtraucher wurde die Anzahl der täglich gerauchten Zigaretten demnach mit Null aufgeführt. Es muss hier jedoch darauf hingewiesen werden, dass für einige Personen trotz der Angabe Nichtraucher im ragebogen geringe Addukt- (bis zu 14 pmol/g Globin). Es kann Level des Cyanoethylvalins nachweisbar waren angenommen werden, dass diese Addukt-Level durch gelegentliches Rauchen ( Partyraucher ) oder starke Passivrauchbelastung zustande gekommen sind. Es zeigten sich deutlich positive Korrelationen, besonders für das raucherspezifische Acrylnitril-Addukt CEV. Aber auch der Spiegel des Acrylamid-Adduktdurch das Rauchen beeinflusst. Die Korrelationen sind in Abb. 7-2 und Abb. 7-3 AAV wird stark dargestellt.

82 Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung 71 Einfluss des Zigarettenrauchens auf den Acrylnitril-Addukt-Spiegel N-2-Cyanoethylvalin (pmol/g globin) y = 6,16 x + 12,8 R = 0,80054 p < 0, Zigaretten pro Tag Abb. 7-2: Korrelation des anamnestisch erhobenen Rauchverhaltens mit dem Gehalt an N-Cyanoethylvalin im Blut. Einfluss des Zigarettenrauchens auf den Acrylamid-Addukt-Spiegel N-2 - Carbamoy leth ylvalin (pmol/g globin) y = 3,40 x + 32,5 R = 0,6749 p < 0, Zigaretten pro Tag Abb. 7-3: Korrelation des anamnestisch erhobenen Rauchverhaltens mit dem Gehalt an N-2-Carbamoylethylvalin im Blut.

83 Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung 72 Demnach erhöht der tägliche Konsum einer Zigarette den Addukt-Spiegel für das Acrylnitril-Addukt CEV um etwa 6,2 pmol/g Globin. Die Erhöhung des Acrylamid- Addukt-Spiegels AAV beträgt im Schnitt etwa 3,4 pmol/g Globin. Wie in Abb. 7-2 und 7-3 dargelegt, ergeben sich allerdings sehr große Schwankungsbreiten für diese Abschätzungen, so dass aus dem Adduktgehalt keine exakten Rückschlüsse auf die Quantität des Rauchverhaltens möglich sind Berechnung der in vivo-dosis und Abschätzung der täglichen Aufnahme an Acrylamid Wie bereits in Kapitel 3.2 dargelegt, reflektieren die hier bestimmten Addukt- Konzentrationen die durchschnittliche Exposition des Menschen gegenüber Acrylamid über die mittlere Lebensdauer des Erythrocyten in der Blutbahn, die etwa 120 Tage beträgt. Somit kann davon ausgegangen werden, dass die Addukt-Level die mittlere steady state -Konzentration von Acrylamid im Blut widerspiegeln. Anhand von Angaben in einem Review von Calleman 48 über die Pharmakokinetik von Acrylamid, der sehr ausführliche Beschreibungen über die Kinetik und die Bindung von Acrylamid an Proteine enthält, lässt sich über sehr einfache ormeln die täglich aufgenommene in vivo-dosis D abschätzen. Die in vivo-dosis ist dabei definiert als das zeitliche Integral der Konzentration des elektrophilen Stoffes im Blut. Die in vivo-dosis D ist hierbei gleichzusetzen mit der sogenannten Area under the curve AUC: in vivo-dosis D [µmol*h] = AUC = c (Acrylamid) Blut dt Die Addukt-Konzentration im steady-state bestimmt sich aus der täglichen Konzentration der alkylierenden Substanz im Blut, also der in vivo-dosis D, der Reaktionskonstante von Acrylamid mit dem N-terminalen Valin k sowie dem durchschnittlichen Alter der Erythrocyten im Menschen nach folgender ormel: Addukt-Level (pmol/g Globin) = D * k * Alter der Erythrocyten Ā

84 Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung 73 Durch mathematisches Umformen ergibt sich somit folgende ormel zur Berechnung der in vivo-dosis D (oder AUC): in vivo Dosis D = AUC = Steady state Addukt-Level (pmol/g Globin) Mittleres Alter der Erythr. Ā * k Die Bindungskonstante von Acrylamid an das N-terminale Valin konnte experimentell bestimmt werden 80 und beträgt k = 4,4 * 10-6 L* g Globin -1 * h -1. Die Altersverteilung der Erythrocyten im Blut ist bei gesunden Personen ohne größere Blutverluste (die eine verstärkte Neubildung zur olge hätten) annähernd normalverteilt. Es werden fortlaufend neue Blutzellen gebildet, während alte Erythrocyten abgebaut werden (steady state). Näherungsweise kann demnach aus der mittleren Lebensdauer der Erythrocyten im Menschen von 120 Tagen auf ein durchschnittliches Alter der im Blut zirkulierenden Erythrocyten von 60 Tagen geschlossen werden. Selbstverständlich handelt es sich hierbei nur um eine erste Näherung. ür die in dieser Arbeit untersuchten Nichtraucher mit einem Median des Acrylamid- Adduktes von 21 pmol/g Globin würde sich demnach folgende ormel ergeben: in vivo Dosis D [pmol * h/tag*l] = 21 pmol/g Globin 60 Tage * 4,4 * 10-6 L* g Globin -1 * h -1 Aus dieser Berechnung ergibt sich folglich für Nichtraucher eine in vivo-dosis (oder A UC) von pmol * h/tag*l = 0, µmol * h/tag*l. Somit lässt sich also die durchschnittliche tägliche Konzentration an (freiem) Acrylamid im Blut, die für die gemessenen Addukt-Werte verantwortlich sein muss, grob abschätzen. Zur Berechnung der täglich aufgenommenen Menge an Acrylamid werden allerdings noch weitere Angaben benötigt: hier spielt die Ausscheidungskinetik eine tragende Rolle, d. h. die Geschwindigkeit, mit der Acrylamid aus dem Blut eliminiert wird.

85 Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung 74 In Ratten wurden entsprechende Versuche durchgeführt und Eliminationskonstanten E k zwischen 0,37 h -1 und 0,5 h -1 bestimmt. In einer allstudie wurde von Calleman eine deutlich langsamere Elimination von Acrylamid im Menschen bestimmt. Demnach wird die Eliminationskonstante für Acrylamid im Menschen von ihm mit Ek = 0,15 h -1 abgeschätzt 48. Acrylamid wird nach der Aufnahme im gesamten Körper gleichmässig verteilt (vgl. Kap ). Da die Konzentration demnach in allen Geweben gleich ist, muss zur Berechnung der täglich aufgenommenen Menge auch das Verteilungsvolumen im menschlichen Körper einbezogen werden. Als vereinfachende Annahme kann man davon ausgehen, dass das Verteilungsvolumen VD = 1 L/kg beträgt. Zur Berechnung der täglich aufgenommenen Acrylamid-Menge ergibt sich demnach folgende ormel: Tägliche Aufnahme [µg/kg KG * Tag] = In vivo Dosis [µmol * h/tag*l] * E k [1/h] * Molgewicht Acrylamid [g/mol] * Verteilungsvolumen [L/kg] Mit den bereits bestimmten Konstanten (aus den Daten für Nichtraucher): In vivo Dosis D = 0, [µmol*h/tag*l] E k = 0,15 h -1 Molgewicht Acrylamid = 71 g/mol Verteilungsvolumen im menschlichen Körper VD = 1 L/kg Ergibt sich also: Tägliche Aufnahme [µg/kg KG * Tag] = 0, [µmol * h/tag*l] * 0,15 [1/h] * 71 [g/mol] * 1 [L/kg] Aus dieser Berechnung ergibt sich folglich für Nichtraucher eine tägliche Aufnahme von 0,847 µg Acrylamid/ kg Körpergewicht. ür einen ca. 70 kg schweren Erwachsenen bedeutet dies eine tägliche Aufnahme von ca. 60 µg Acrylamid. Da Raucher im Median mit 85 pmol/g Globin eine 4fach höhere innere Beanspruchung durch Acrylamid aufweisen, bedeutet dies, dass für Raucher eine tägliche Aufnahme von 3,43 µg Acrylamid / kg Körpergewicht abgeschätzt werden kann. ür einen ca. 70 kg schweren, rauchenden Erwachsenen bedeutet dies eine tägliche Aufnahme von ca. 240 µg Acrylamid.

86 Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung Risikoabschätzungen Man geht davon aus, dass die weitgehend nahrungsmittelbedingte Exposition gegenüber Acrylamid einen nicht zu vernachlässigenden Beitrag zum Krebsrisiko der Allgemeinbevölkerung darstellt. Die lineare Extrapolation der Ergebnisse von Tierversuchen auf den Menschen wird hierbei allerdings kontrovers gesehen. Zum einen wird dabei von den im Tierversuch beobachteten Wirkungen auf die beim Menschen zu erwartenden geschlossen. Zum anderen muss dabei von hohen Konzentrationen auf solche geschlossen werden, die um einige Zehnerpotenzen niedriger liegen. Dennoch geben solche Risikoabschätzungen, die nationale und internationale Gremien durchführen, einen Hinweis auf die gesundheitliche Relevanz von Schadstoffen, die in der Umwelt auftreten. In Bezug auf Acrylamid liegen verschiedene solcher Risikoabschätzungen vor. Nach Angaben der WH bewirkt die lebenslange Aufnahme von 1 µg Acrylamid pro kg Körpergewicht und Tag 70 zusätzliche Krebsfälle pro Einwohnern ( 70 x 10-5 ) 81. Die US-amerikanische EPA berec hnet dieses unit risk auf 450 pro In einer Veröffentlichung von Granath et al. wurde sogar ein Lebenszeitrisiko von pro 10 angegeben. Unter Berücksichtigung der in Kap grob abgeschätzten durchschnittlichen täglichen Belastung von 0,85 µg/kg Körpergewicht ergibt sich für Acrylamid somit je nach verwendetem Modell ein berechnetes Risiko von 60 bis 850 zusätzlichen Krebsfällen pro Einwohnern. Dies belegt die grosse umweltmedizinische Bedeutung von Acrylamid.

87 Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung Diskussion Anhand unserer Untersuchungen ist es möglich, die effektive innere Belastung der Allgemeinbevölkerung gegenüber Acrylamid aus der Nahrung auf individueller Basis zu erfassen. Wie sich zeigte, werden die Addukt-Werte dabei stark durch das Rauchverhalten der Personen beeinflusst. Die von uns ermittelten Konzentrationen stimmen sehr gut mit den beiden Einzigen in der Literatur veröffentlichten Werten für die Allgemeinbevölkerung in Schweden überein. In Tabelle 7-2 werden unsere Daten den Ergebnissen dieser schwedischen Arbeitsgruppe gegenübergestellt. Referenz Personen Mittelwert (pmol/g Globin) Bergmark, Median (pmol/g Globin) Bereich (pmol/g Globin) NR (n=8) 31 k. A R (n=10) 116 k. A Hagmar et al., NR (n=18) k. A. k. A Diese Arbeit NR (n=25) < R (n=47) Tabelle 7-2: Vergleich der in dieser Arbeit erhaltenen Werte mit den bisher verfügbaren Literaturdaten für die Allgemeinbevölkerung. Bergmark konnte im Blut von 8 Nichtrauchern das Acrylamid-Addukt mit einem Mittelwert von 31 pmol/g Globin nachweisen. Der entsprechende Mittelwert bei 10 untersuchten Rauchern lag bei 116 pmol/g Globin 25. Auch in einer arbeitsmedizinischen Studie von Hagmar et al. wurde von einer Hintergrundbelastung in nichtrauchenden Kontrollpersonen im Bereich von pmol/g Globin berichtet ohne weitere statistische Angaben 59. Diese bisher spärliche Datenlage belegt die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen des Zusammenhangs zwischen der Aufnahme von Acrylamid über die Nahrung und der effektiven inneren Dosis 38. Da auch die Proben unseres Kollektivs ursprünglich vor einem arbeitsmedizinischen Hintergrund aquiriert wurden (der möglichen Exposition gegenüber Ethylen- und Propylenoxid), wurden mögliche Einflussfaktoren wie individuelle Ernährungsgewohnheiten (Konsum besonders belasteter Lebensmittel) nicht erfasst. In

88 Biochemisches Effektmonitoring in der Allgemeinbevölkerung 77 weitergehenden Studien mit einer repräsentativen, größeren Personengruppe sollte ein eventueller Zusammenhang geprüft werden. Mit der hier vorliegenden Methode ist das entsprechende Werkzeug für diese Untersuchungen gegeben. Nach Angaben in einer Übersicht von Calleman war es möglich, anhand eines linearen pharmakokinetischen Modells auf der Basis der gemessenen Hb-Addukte die täglich aufgenommene Menge an Acrylamid grob abzuschätzen 48. Unter Berücksichtigung dieser Daten konnten wir für Nichtraucher mit einem Median von 21 pmol/g Globin eine durchschnittliche tägliche Acrylamid-Aufnahme von ungefähr 0,85 µg/kg Körpergewicht berechnen. ür einen Erwachsenen mit einem Körpergewicht von 70 kg bedeutet dies eine tägliche Aufnahme von 60 µg Acrylamid. Die erhaltenen Daten stimmen sehr gut mit den Abschätzungen überein, die von vielen nationalen und internationalen Institutionen auf der B asis der bisher untersuchten Lebensmittel und den durchschnittlichen Ernährungsgewohnheiten durchgeführt wurden (s. Kap ). Die Expositionsabschätzung zeigt, dass von Acrylamid ein nicht zu vernachlässigendes Krebsrisiko für die Allgemeinbevölkerung ausgeht. Wie bereits erwähnt, sind solche Risikoabschätzungen in der wissenschaftlichen Diskussion umstritten. Dabei muss auch berücksichtigt werden, dass sich der Metabolismus und die Toxikokinetik von Acrylamid bei Mensch und Tier unterscheiden kann. Da das Glycidamid für die krebserzeugende Wirkung von Acrylamid verantwortlich ist (vgl. Kap ), ist es notwendig, das Ausmass des oxidativen Stoffwechsels von Acrylamid beim Menschen zu erforschen. Zwischen Mäusen und Ratten bestehen diesbezüglich grosse Unterschiede 49. Die Bestimmung von Biomarkern des oxidativen Stoffwechsels kann demnach helfen, das Krebsrisiko des Menschen, das mit der Aufnahme von Acrylamid mit der Nahrung verbunden ist, besser abschätzen zu können.

89 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids Bestimmung von Hämoglobin-Addukten des Acrylamids und Glycidamids am N-terminalen Valin 8.1. Grundlage des Verfahrens Die hier beschriebene Methode dient zur Quantifizierung der Hämoglobin-Addukte von Acrylnitril, Acrylamid und seinem oxidativen Metaboliten Glycidamid im Blut von Personen, die beruflich oder umweltbedingt gegenüber diesen Substanzen exponiert sind. Mit dem vorliegenden Verfahren kann somit ein wichtiger Beitrag zur Aufklärung des Metabolismus von Acrylamid beim Menschen geleistet werden. Wie bereits in Kapitel 3.2. und erwähnt, kann auch das im Zuge des oxidativen Metabolismus von Acrylamid entstandene Epoxid Glycidamid mit der Aminofunktion des N-terminalen Valins unter Ausbildung eines kovalent gebundenen Addukts reagieren. Im alle des Glycidamids entsteht dabei das Racemat N-(R,S)-2-hydroxy- 2-carbamoylethylvalin (GAV) (siehe Abbildung 8-1). H 3 C CH 3 H H H NH 2 N * + H N Globin NH 2 2 NH globin NH H 3 C CH 3 Dieses Addukt kann ebenfalls mittels eines modifizierten Edman-Abbaus von der Globinkette abgespalten werden. Die Aufarbeitung der Vollblutproben erfolgt dabei analog der bereits beschriebenen Vorschrift zum Nachweis der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Acrylnitril. Aufgrund der größeren Polarität des Glycidamid- Addukts im Vergleich zu den in Kap. 6 behandelten Addukten musste das Verfahren jedoch etwas modifiziert werden. Darüber hinaus ist es für die gaschromatographische Analyse des im Zuge des modifizierten Edman-Abbaus enstehenden Pentafluorphenylthiohydantoins unerlässlich, die Hydroxy-Gruppe des Glycidamid-Addukts durch eine zweite Derivatisierung zu schützen, da durch die hohen Temperaturen des Injektors ein Glycidamid N-terminales Valin N-(R,S)-2-Hydroxy -2- Carbamoylethylvalin (GAV) Abbildung 8-1: Addukt-Bildung von Glycidamid am N-terminalen Valin des Hämoglobins

90 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 79 H 2 N H * NH NH H 3 C CH 3 globin N C S Modifizierter Edman-Abbau H * H 2 N S H 3 C N N CH 3 N-(R,S)-2-Hydroxy-2- Carbamoylethylvalin (GAV) H 3 C H 3 C * H 3 C CH 3 PPTH-Derivat des GAV NH N H 3 C CH 3 S N + H 2 S 4 Acetonisiertes PPTH-Derivat des GAV N-(2,2-dimethyl-4-oxazolidinonylmethylvalin)-PPTH Abbildung 8-2: Schema der Derivatisierung zum Nachweis von Glycidamid- Addukten 83. unspezifischer Zerfall erfolgen kann. Diese zweite Derivatisierung erfolgt mit Hilfe von Aceton und Schwefelsäure, die zur Bildung eines Halbacetals und damit einem Ringschluss führt 83. Das entsprechende xazolidinon-derivat kann dann nach kapillargaschromatographischer Trennung massenspektrometrisch detektiert werden. Abbildung 8-2 zeigt das Prinzip der Derivatisierung. Da die Pentafluor- phenylthiohydantoin-derivate der Addukte des Acrylamids (N-2-Carbamoylethylvalin, AAV) und Acrylnitrils (N-Cyanoethylvalin, CEV) von der zweiten Derivatisierung nicht betroffen sind, können diese Substanzen mit diesem Verfahren ebenfalls parallel miterfasst werden. Weil die Konzentrationen des Glycidamid-Adduktes in Human-Blutproben deutlich geringer angenommen werden als diejenigen des Acrylamid-Adduktes sowie aufgrund zu erwartender größerer Extraktionsverluste für dieses Addukt wurde für die Detektion der Pentafluorphenylthiohydantoine die Negativ Chemische Ionisation

91 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 80 (NCI) mit Methan als Reaktandgas gewählt, um eine empfindlichere Detektion zu gewährleisten. Zur Kalibrierung wird wiederum Poolglobin von Nichtrauchern eingesetzt, das mit Lösungen von Dipeptid-Standards versetzt wird, die die addukt-tragenden letzten beiden N-terminalen Aminosäuren der Hämoglobin-Kette simulieren. ür das Addukt des Glycidamids N-(R,S)-2-hydroxy-2-carbamoylethylvalin (GAV) war ein solcher Dipeptid-Standard bisher nicht käuflich erhältlich und wurde von der irma Bachem Biochemica (Heidelberg) als Auftragssynthese für unser Institut hergestellt. Wie sich im Zuge der Methodenentwicklung zeigte, wurde das Signal des bisher verwandten Internen Standards (N-2-Ethoxyethylvalin-Alanin-Anilid) (vgl. Kap ) durch chromatographisch überlagernde Störsubstanzen in der Detektion im NCI- stark gequencht. Demnach konnte der Interne Standard für die Analytik nicht Modus verwendet werden. Die Kalibrierung und Auswertung erfolgte daher ohne Bezug auf den internen Standard Geräte, Chemikalien und Lösungen Geräte Gaschromatograph Agilent 6890 (Agilent, Waldbronn) Massenspektrometer Agilent 5973 Series (Agilent, Waldbronn) Autosampler HTS PAL (CTC analytics, Zwingen, Schweiz) 10 µl-spritze für die GC (Hamilton, Bonaduz, Schweiz) Hängethermostat für Wasserbäder (Haake Messtechnik, Karlsruhe) Evaporatorstation ReactiVap III (Pierce, Laborcenter Nürnberg) Zentrifuge Multifuge 3 L-R (a. Heraeus, Laborcenter Nürnberg) Vortex-Mixer Genie 2 (a. Scientific Industries, Laborcenter Nürnberg) Wippschüttler RM 5 (a. CAT, Laborcenter Nürnberg) Magnetrührer IKAMAG RH (a. IKA Labortechnik, Laborcenter Nürnberg) Ultraschallbad Ultrasonic Cleaner (a. VWR, Laborcenter Nürnberg) Verschiedene Pipetten und Multipetten (Eppendorf, Hamburg) EDTA-Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht) Plastikröhrchen mit Deckel, Nutzvolumen 13 ml und 30 ml (Laborcenter Nürnberg)

92 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 81 Rollrandampullen mit teflonkaschierten Gummisepten und Aluminiumverschlusskappen, Volumen 2 ml (Macherey-Nagel, Düren) Schraubgläschen mit teflonkaschierten Gummisepten und Schraubdeckel, Volumen 5 ml und 20 ml Mikroeinsätze für die Rollrandampullen, Nutzvolumen 100 µl (Macherey-Nagel, Düren) Chemikalien Diethylether p. a. (Merck, Darmstadt) Ethanol p. a. (Merck, Darmstadt) 2-Propanol p.a. (Merck, Darmstadt) Ethylacetat p.a. (Merck, Darmstadt) Acetonitril seccosolv (Merck, Darmstadt) Triethylamin p.a. (Merck, Darmstadt) Essigsäureanhydrid p.a. (Merck, Darmstadt) Aceton für die Gaschromatographie (Merck, Darmstadt) Toluol für die Gaschromatographie (Merck, Darmstadt) n-hexan für die Gaschromatographie (Merck, Darmstadt) Salzsäure konzentriert 37 % (Merck, Darmstadt) Schwefelsäure konzentriert 98 % (Merck, Darmstadt) Wasser deionisiert ormamid ultrapure (United States Biochemicals, Cleveland, USA) N-2-Cyanoethylvalin-Leucin-Anilid (Bachem Biochemica, Heidelberg) N-2-Carbamoylethylvalin-Leucin-Anilid (Bachem Biochemica, Heidelberg) N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin-Leucin-Anilid (Bachem Biochemica, Heidelberg, Auftragssynthese) (Reinheit > 99 %) Natriumcarbonat wasserfrei (Merck, Darmstadt) Natriumhydrogencarbonat p.a. (Merck, Darmstadt) Natriumhydroxid p.a. (Merck, Darmstadt) Natriumchlorid p.a. (Merck, Darmstadt) Pentafluorphenylisothiocyanat (luka, Buchs, Schweiz) Helium Reinheit 5.0 (a. Linde, München) Methan Reinheit 4.5 (a. Linde, München)

93 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids Lösungen 50 mm HCl in 2-Propanol In einen 1000 ml Messkolben werden ca. 500 ml 2-Propanol vorgelegt. Es werden 4,1 ml konzentrierte Salzsäure (37%) zugegeben und der Kolben wird mit 2-Propanol bis zur Marke aufgefüllt. 0,9 %ige NaCl-Lösung 9 g NaCl werden in einen 1000 ml Messkolben eingewogen und der Kolben wird mit deionisiertem Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Gesättigte NaCl-Lösung Ca. 20 g NaCl werden in ein 100 ml-becherglas gegeben und in ca. 100 ml deionisiertem Wasser aufgelöst. Es wird unter ständigem Rühren auf dem Magnetrührer weiter NaCl zugegeben, bis sich kein weiteres NaCl mehr löst. 1 N NaH-Lösung 2 g NaH-Plätzchen werden in einem Becherglas eingewogen und mit ca. 30 ml deionisiertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wird unter Nachspülen mit deionisiertem Wasser quantitativ in einen 50 ml-meßkolben überführt und der Kolben wird mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung ist im Kühlschrank ca. 3 Tage haltbar und sollte nach diesem Zeitraum frisch angesetzt werden. 0,1 M Na 2 C 3 -Lösung 530 mg Na 2 C 3 (wasserfrei) werden in einem Becherglas eingewogen und in ca. 30 ml deionisiertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wird unter Nachspülen mit deionisiertem Wasser quantitativ in einen 50 ml-meßkolben überführt und der Kolben mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt. 0,1 M NaHC 3 -Lösung 420 mg NaHC 3 werden in einem Becherglas eingewogen und in ca. 30 ml deionisiertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wird unter Nachspülen mit deionisiertem Wasser quantitativ in einen 50 ml-meßkolben überführt und der Kolben wird mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt.

94 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 83 1% Schwefelsäure in Aceton (v/v) In einen 10 ml Messkolben werden ca. 5 ml Aceton für die Gaschromatographie vorgelegt. Es werden 100 µl konzentrierte Schwefelsäure (98 %) zugegeben und der Kolben mit Aceton für die Gaschromatographie bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung ist nicht haltbar und sollte erst kurz vor dem Einsatz stets frisch hergestellt werden!! Vergleichsstandards Analog Kap werden die Adduktgehalte im Blut jeweils als freies, addukttragendes Valin berechnet und angegeben. Es können dabei die für die Bestimmung der Addukte des reduktiven Stoffwechsels angesetzten Stammlösungen verwendet (s. Kap ). Im olgenden wird auf die für die Bestimmung des Glycidamid- Adduktes zusätzlich notwendige Stammlösung eingegangen. Die Strukturformel des dafür eingesetzten Dipeptids ist in Abbildung 8-1 dargestellt. CH 3 H CH 3 H N * 2 NH NH NH H 3 C CH 3 N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin-Leucin-Anilid Abbildung 8-1: Strukturformel des zur Kalibrierung des Glycidamid-Adduktes eingesetzten Dipeptids. Analog beziehen sich die Konzentrationen im olgenden auf den Gesamtgehalt an addukt-tragendem Valin in der Lösung.

95 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 84 Stammlösung des GAV-Dipeptids Es werden etwa 9,6 mg N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin-Leucin-Anilid in einen 10 ml Messkolben genau eingewogen und der Kolben mit Ethanol bis zur Marke aufgefüllt. Die so erhaltene Stammlösung entspricht 500 mg/l des alkylierten Valins (siehe Tabelle 8-1). N-(R,S)-2-Hydroxy-2- Carbamoylethylvalin Molekulargewicht des Dipeptids (g/mol) 392,5 Molekulargewicht des addukt-tragenden Valins (g/mol) 204,2 aktor 1,92 Einwaage Dipeptid 9,6 mg Volumen 10 ml Konzentration Addukt-tragendes Valin (Stammlösung) 500 mg/l Tabelle 8-1: Molekulargewicht des Dipeptids und des N-Alkyl-Valins sowie Einwaage der Dipeptid-Stammlösung Aus der so hergestellten Stammlösung sowie den nach Kapitel angesetzten Stammlösungen werden nach folgendem Pipettierschema für die Analyten N- Cyanoethylvalin, N-2-Carbamoylethylvalin sowie N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin neue, gemeinsame Dotierlösungen zur Herstellung von Kalibrierstandards in Poolglobin hergestellt. Volumen Endvolumen Konzentration N-Alkylvalin Je 1 ml Stammlsg. 5 ml 100 mg/l Zwischenverdünnung (ZV) 100 µl ZV 10 ml 1 mg/l Arbeitslösung 2 10 µl ZV 10 ml 100 µg/l Arbeitslösung 3 Tabelle 8-2: Herstellung der Zwischenverdünnung und der Arbeitslösungen. Die so hergestellten ethanolischen Lösungen sind bei -18 C mindestens 1 Jahr ohne Verluste lagerfähig Probennahme und Probenaufbereitung Gewinnung des Erythrocytenhämolysats Erfolgt analog der in Kap gegebenen Arbeitsvorschrift.

96 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids Isolierung des Globins Erfolgt analog der in Kap gegebenen Arbeitsvorschrift. Herstellung von Poolglobin Erfolgt analog der in Kap gegebenen Arbeitsvorschrift Herstellung von Kalibrierstandards Zur Herstellung von Kalibrierstandards werden aus den nach Kap neu hergestellten Arbeitslösungen (AL 2 und AL 3) verschiedene Volumina den aliquotierten Poolglobin-Lösungen zupipettiert. Dabei wird analog Kapitel nach folgendem Pipettierschema vorgegangen: Standard Vol. des zuges. Standards (µl) Konzentration des Kalibierstandards ISTD-AL AL 3 AL 2 (µg N-Alkylvalin/l ormamid) LW , , , ,0 Tabelle 8-3: Pipettierschema zur Herstellung von Kalibrierstandards in Poolglobin Durchführung des modifizierten Edman-Abbaus Die Durchführung des modifizierten Edman-Abbaus erfolgt in enger Anlehnung an die in Kap gegebene Arbeitsvorschrift. Dennoch mussten aufgrund der höheren Polarität des Glycidamid-Adduktes einige Modifikationen eingefügt werden. Es werden ca. 100 mg des zuvor aus den zu untersuchenden Blutproben isolierten Globins in ein 5-ml-Schraubglas genau eingewogen und unter Mischen auf dem Wippschüttler in 3 ml ormamid gelöst. Es werden 40 µl 1 N NaH, 100 µl der Arbeitslösung des Internen Standards (ISTD-AL) sowie 15 µl Pentafluorphenylisothiocyanat zugegeben und die Probe weiterhin für 6 8 Stunden bei Raumtemperatur auf dem Wippschüttler durchmischt. Anschließend wird die Probe für 90 Minuten im Wasserbad bei 45 C erwärmt. Nach dem Abkühlen werden 400 µl gesättigte NaCl-Lösung zugegeben und die ormamidphase wird zweimal mit je 3 ml Diethylether extrahiert, wobei die Probe

97 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 86 jeweils für 60 Sekunden intensiv auf einem Vortex-Mixer durchmischt wird. Zur besseren Phasentrennung erfolgt eine Zentrifugation der Proben bei g für 5 Minuten. Sollte sich dabei keine Phasentrennung einstellen, da die Proteinmatrix eine gelartige Konsistenz angenommen hat, kann die Probe erneut kurz gevortext und wiederum bei 4500 g zentrifugiert werden. Die vereinigten Etherphasen werden unter einem leichten Stickstoffstrom bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 1,5 ml Toluol aufgenommen. Die Toluolphase wird anschließend nacheinander mit 2 ml Wasser und 2 ml 0,1 M Na 2 C 3 -Lösung gewaschen. Dazu wird die Probe jeweils für 60 s auf dem Vortex- Mixer intensiv durchmischt und anschließend bei 800 g für 5 min zentrifugiert. Schließlich wird die Toluolphase abgehoben und in ein neues 5-ml-Schraubglas überführt. Die Probe wird im Stickstoffstrom bis zur Trockne eingeengt, wobei ein leichtes Erwärmen mit einem Magnetrührer erfolgen kann. Anschließend erfolgt die Acetonisierung des Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivates des Glycidamid- Adduktes Acetonisierung des GAV-Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivates Der trockene Rückstand wird in 100 µl der frisch angesetzten Lösung von 1% Schwefelsäure in Aceton (v/v) aufgelöst. Das 5-ml-Schraubglas wird fest verschlossen und mindestens 2 Stunden (vorzugsweise über Nacht) bei Raumtemperatur belassen. Die saure Lösung wird dann durch Zugabe von 150 µl der 0,1 M NaHC 3 -Lösung neutralisiert. Es wird 1 ml Toluol zugegeben und die Lösung zweimal mit je 2 ml Wasser gewaschen. Dazu wird die Probe jeweils für 60 s auf dem Vortex-Mixer intensiv durchmischt und anschließend bei 800 g für 5 min zentrifugiert. Schließlich wird die Toluolphase abgehoben und in eine 2 ml-rollrandampulle überführt. Die Probe wird im Stickstoffstrom erneut bis zur Trockne eingeengt, wobei ein leichtes Erwärmen mit einem Magnetrührer erfolgen kann. Der Rückstand wird in 50 µl Toluol gelöst und in ein Mikrovial überführt. Das Gläschen wird schließlich mit einer teflonkaschierten Aluminiumverschlusskappe verschlossen. 1 µl dieser Lösung wird in den Gaschromatographen injiziert.

98 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids Derivatisierungsalternative: Acetylierung des GAV-Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivates Der nach Kapitel erhaltene trockene Rückstand wird in 150 µl Acetonitril gelöst. Es werden 20 µl Triethylamin und 20 µl Essigsäureanhydrid zugegeben. Das 5-ml-Schraubglas wird fest verschlossen und für eine Stunde auf dem Wippschüttler durchmischt. Dann werden 1,5 ml Toluol zugegeben und die Lösung zweimal mit je 2 ml Wasser gewaschen. Dazu wird die Probe jeweils für 60 s auf dem Vortex-Mixer intensiv durchmischt und anschließend bei 800 g für 5 min zentrifugiert. Schließlich wird die Toluolphase abgehoben und in eine 2 ml-rollrandampulle überführt. Die Probe wird im Stickstoffstrom erneut bis zur Trockne eingeengt, wobei ein leichtes Erwärmen mit einem Magnetrührer erfolgen kann. Der Rückstand wird in 50 µl Toluol gelöst und in ein Mikrovial überführt. Das Gläschen wird schließlich mit einer teflonkaschierten Aluminiumverschlusskappe verschlossen. 1 µl dieser Lösung wird in den Gaschromatographen injiziert. Diese Derivatisierung zeigte eine deutlich schlechtere Response für das GAV- als das unter Kap beschriebene Verfahren. Pentafluorphenylthiohydantoin Darüber hinaus war das Derivat durch eine ungenügende chromatographische Trennung der Stereoisomere gekennzeichnet. erner zeigte das Derivat im Massenspektrometer eine starke ragmentierung mit unspezifischen Hauptfragmenten. Aus diesen Gründen wurde diese Derivatisierungsalternative im Verlauf dieser Arbeit nicht weiterverfolgt. Im Anhang ist das EI-Massenspektrum des acetylierten GAV- Pentafluorphenylthiohydantoins wiedergegeben.

99 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids Gaschromatographisch-massenspektrometrische Arbeitsbedingungen Kapillarsäule DB 17-HT 30 m x 0,25 mm, 0,15 µm ilmdicke (J & W Scientific, olsom, CA, USA) Trägergas Helium 5.0 lussgeschwindigkeit 1,2 ml/min (constant flow) Injektion 1 µl, pulsed splitless Pulsed pressure 30 psi für 1,2 min Purge off time 1,2 min Gerätetemperaturen Injektor 300 C Transferline 320 C Säulenofen 90 C, 1 min halten 25 C/min auf 120 C 10 C/min auf 240 C 25 C/min auf 310 C, 10 min halten Ionisierung Negative Chemische Ionisation Ionisierungsenergie 207 ev Reaktandgas Methan 4.5 Ionenquellendruck 2,2 x 10 Torr (Methan-luss: 45 Prozent) Ionenquellentemperatur 160 C Temperatur des Quadrupols 120 C Detektion Selected Ion Monitoring (SIM) Messzeit pro Ion (dwell time) 100 ms Elektronenmultiplier V rel (~2300 V) Analytische Bestimmung Je 1 µl der nach und aufgearbeiteten Proben wird im pulsed-splitless- Modus in das GC/MS-System injiziert. Die Identifizierung der Pentafluorphenylthiohydantoine erfolgt anhand der Retentionszeit und der charakteristischen Ionenspur,

100 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 89 die für den jeweiligen Analyten aufgenommen wird. Da die Massenspektren in der Negativen Chemischen Ionisation aufgrund der weichen Ionisierung in der Regel nur geringe Zerfallsmuster aufzeigen, können anders als in der Elektronenstoss- mit hinreichender ionisation hier keine weiteren Ionenspuren als Qualifier Empfindlichkeit aufgenommen werden. Die NCI-Massenspektren sowie das rag- Ionenspuren mentierungsschema der Analyten sind im Anhang dieser Arbeit abgebildet. In Tabelle 8-4 werden die Retentionszeiten sowie die aufgenommenen für die einzelnen Anal yten unter den angegebenen Bedingungen dargestellt. Die in Tabelle 8-4 angegebenen Retentionszeiten können dabei nur als Anhaltspunkt dienen und - abhängig von der Trennleistung der verwendeten Kapillarsäule Schwankungen unterliegen. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang die Grundlinientrennung des R- und S- Derivates des acetonisierten N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin-Pentafluor- wurden auch bereits mit phenylthiohydantoin-derivates. Ähnliche Beobachtungen anderen racemischen Valin-Addukten, wie etwa dem Addukt des Propylenoxids (N- 79,84. (R,S)-2-hydroxypropylvalin) gemacht und in der Literatur beschrieben Da die stereoisomeren ormen nicht als Reinsubstanzen zur Verfügung standen, konnten die Peaks nicht der entsprechenden R- bzw. S-orm des Analyten zugeordnet werden. Abbildung 8-2 zeigt beispielhaft das Chromatogramm der aufgearbeiteten Blutprobe eines Nichtrauchers aus der Allgemeinbevölkerung. Analyt R (t) (min) Registrierte Ionenspur (m/z) N-2-Cyanoethylvalin (CE V) N-2-Carbamoylethylvalin ( AAV) N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin (acetonisiert) (GAV) Tabelle 8-4: Retentionszeiten und detektierte Ionenspuren für die Analyten 431

101 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 90 Abundance m/z 375 AAV Time--> Abundance m/z=431 GAV Time--> Abbildung 8-2: Repräsentatives Chromatogramm der aufgearbeiteten Blutprobe eines Nichtrauchers aus der Allgemeinbevölkerung. Die hier dargestellte Probe enthielt Addukt-Konzentrationen von 25 pmol/g Globin N-2-Carbamoylethylvalin (AAV) und 21 pmol/g Globin N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin (GAV). Die beiden Peaks mit den Retentionszeiten und min repräsentieren die stereoisomeren ormen des GAV.

102 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids Kalibrierung Der bisher verwendete Interne Standard N-2-Ethoxyethylvalin-Alanin-Anilid konnte aufgrund von chromatographischen Störungen, die in der Negativen Chemischen Ionisierung zu starken Quenching-Effekten führten, nicht verwendet werden. Daher erfolgte die Kalibrierung ohne Berücksichtigung des Internen Standards. Da Verluste der Analyten daher nicht mehr durch einen Internen Standard kompensiert werden können, ist bei der Durchführung der Analytik höchste Sorgfalt geboten. Die gemäß hergestellten Kalibrierstandards in Poolglobin werden entsprechend den zu analysierenden Proben nach und aufgearbeitet und in das GC/MS-System injiziert. Kalibrierkurven werden erstellt, indem die integrierten Peakflächen der einzelnen Addukte gegen die zudotierte Konzentration im Kalibrierstandard (in µg N-Alkylvalin/l ormamid) aufgetragen werden. Im alle des acetonisierten N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalins (GAV), das sich chromatographisch in zwei separate Peaks trennt, werden die beiden Peakflächen einzeln integriert und dann addiert. Die Kalibrierkurven sind im Bereich bis zu 10 µg/l ormamid linear. Abbildung 8-3 zeigt beispielhaft die Kalibrierkurven für N-2-Cyanoethylvalin (CEV), N-2- Carbamoylethylvalin (AAV) sowie die Summe von N-(R,S)-2-Hydroxy-2- Carbamoylethylvalin im angegebenen Bereich.

103 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 92 Kalibrierkurve N-2-Cyanoethylvalin y = x R = 0, läche ,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 zudotierte Menge [µg/l ormamid] Kalibrierkurve N-2-Carbamoylethylvalin y = 3E+06x R = 0, läche ,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 zudotierte Menge [µg/l ormamid]

104 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 93 Kalibrierkurve N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin y = x R 2 = 0,999 läche Peak ,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 zudotierte Menge [µg/l ormamid] Abb. 8-3: Kalibrierkurven für N-2-Cyanoethylvalin, N-2-Carbamoylethylvalin und N- (R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin in Poolglobin Berechnung des Analysenergebnisses Zur Bestimmung des Gehaltes an Addukt-tragendem Valin in aufgearbeiteten Blutproben werden für jede Probe die Peakflächen P des jeweiligen Analyten integriert (im alle des Glycidamid-Adduktes wird die Summe der integrierten Peaks der beiden Stereoisomere gebildet). Mit Hilfe der Steigung der Kalibrierkurve B kann somit die Konzentration C der Probe nach folgender ormel berechnet werden: I. C= P/B Der Achsenabschnitt der Kalibrierkurve (siehe auch Abb. 8-2) wird durch den physiologischen Adduktgehalt des zur Kalibrierung eingesetzten Poolglobins bedingt. Mit Hilfe der oben genannten Gleichung erhält man die Konzentration der Probe in µ g N-Alkylvalin pro Liter ormamid. Der Adduktgehalt des Globins wird üblicherweise in der nationalen und internationalen Literatur auf ein Gramm Globin bezogen und als pmol/g Globin angegeben. Die Umrechnung in pmol/g Globin erfolgt analog der in Kap angegebenen ormeln.

105 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 94 Mit dem Molekulargewicht des Glycidamid-Valin-Adduktes II. M (N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin) = 204,2 g/mol = 204,2 x 10-6 µg/pmol ergibt sich demnach folgender Umrechnungsfaktor für den Analyten: III. N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin (pmol/g Globin) = C (µg/l ormamid) x 146,9 Der Adduktgehalt kann auch in µg Addukt-tragendes Valin pro Liter Blut angegeben werden. Dies gilt unter der Annahme, dass der durchschnittliche Globingehalt des Blutes etwa 144 g/l 78 beträgt und der Beitrag der 4 Hämgruppen zum Gesamt- ormel und ergibt Molekulargewicht des Hämoglobins von 64 kda vernachlässigt werden kann. Die Umrechnung erfolgt analog der in Kap angegebenen folgenden Umrechnungsfaktor für den Analyten: IV. N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin (µg/l Blut) = N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin (pmol/g Globin) x 0, Qualitätssicherung Das ehlen eines Internen Standards erfordert äußerste Genauigkeit bei der Durchführung dieser Analytik. Um ehler zu minimieren sowie um Empfindlichkeits- Kontrollmaterials erfolgt wie in Kapitel 8.3. schwankungen des GC/NCI-MS-Systems auszugleichen, wurde in jeder analytischen Serie eine komplette Kalibrierkurve mitgeführt. Zur Sicherung der Qualität der erhaltenen Analysenergebnisse wurde darüber hinaus in jeder Serie eine Qualitätskontrollprobe mitanalysiert. Da zertifiziertes Kontrollmaterial kommerziell nicht erhältlich ist, wurde zu diesem Zweck einem Raucher ca. 20 ml Blut entnommen und ausreichende Mengen an Kontrollglobin hergestellt. Die Herstellung und Aufarbeitung des beschrieben.

106 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids Beurteilung des Verfahrens Präzision Dieses Verfahren wurde zum Nachweis der Addukte in einer kleinen Gruppe der Allgemeinbevölkerung angewandt. Dabei wurden insgesamt 5 Aufarbeitungen durchgeführt. Die anhand der Qualitätskontrollprobe ermittelten Präzisionen von Tag zu Tag sind in Tabelle 8-5 zusammengefasst. Probe CEV AAV GAV Q Raucher (n=5) Mittelwert (pmol/g Globin) Stdabw. (pmol/g Globin) Stdabw. (%) 20,9 14,1 16,4 Tabelle 8-5: Präzisionen von Tag zu Tag. CEV: N-2-Cyanoethylvalin, AAV: N-2- Carbamoylethylvalin, GAV: N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin Richtigkeit und Robustheit der Methode ür die Überprüfung der Richtigkeit ergeben sich die bereits in Kap dargelegten Schwierigkeiten. Da ein Referenzglobin nicht zur Verfügung steht, kann die Richtigkeit der Methode nicht abschließend beurteilt werden. Da die Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivate der Addukte als Analyten ebenfalls nicht käuflich erhältlich sind und erst im Laufe der Aufarbeitung aus den Addukten bzw. den Dipeptiden entstehen, können auch die aufarbeitungsbedingten Verluste nicht bestimmt werden. Um Informationen über die Zuverlässigkeit der Methode zu gewinnen, wurden in einem Methodenvergleich insgesamt 29 Blutproben aus der Allgemeinbevölkerung (16 Raucher, 13 Nichtraucher) sowohl mit Hilfe des in Kap. 6 vorgestellten Verfahrens mittels GC/EI-MS auf die Parameter CEV und AAV als auch mit dem hier behandelten Verfahren mittels GC/NCI-MS auf die Parameter CEV, AAV und GAV untersucht. ür die Parameter CEV und AAV können die mit den unterschiedlichen Verfahren erhaltenen Werte somit direkt verglichen werden. Abbildung 8-4 zeigt die Korrelationen zwischen den mit den beiden Verfahren erhaltenen Ergebnissen für N-Cyanoethylvalin (CEV) und N-2-Carbamoylethylvalin (AAV). Dabei scheinen für den Parameter CEV mit der Negativen Chemischen

107 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 96 Ionisation (NCI) tendenziell etwas höhere Werte erhalten zu werden, die Steigung der Regressionsgeraden liegt bei b=1,28. Demgegenüber stimmen die Ergebnisse für das Acrylamid-Addukt zwischen beiden Verfahren äußerst gut überein. Die Steigung der Regressionsgeraden liegt hier mit b=0,87 im Bereich der Schwankungsbreite beider Verfahren. Die Richtigkeit des Verfahrens kann also im Rahmen dieses Methodenvergleichs als gut bezeichnet werden. Die hervorragenden Korrelationen zwischen den unterschiedlichen Methoden mit Korrelationskoeffizienten von r > 0,97 verdeutlichen die gute Pr äzision des in Kap. 8 behandelten Verfahrens. ür den Parameter GAV konnte ein solcher Methodenvergleich nicht durchgeführt werden, da dieser Parameter mit der in Kap. 6 vorgestellten GC/EI-MS-Methode nicht empfindlich genug erfasst werden kann.

108 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 97 N-Cy anoethylvalin (p mol/ g Globin) mit GC/ N CI-MS y = 1,28 * x + 4,4 r = 0, N-Cyanoethylvalin (pmol/g Globin) mit GC/EI-MS N-2-Carbamoylethylvalin (pmol/g Globin) mit GC/NCI-MS 200 y = 0,87 * x - 0,7 r = 0, N-2-Carbamoylethylvalin (pmol/g Globin) mit GC/EI-MS Abbildung 8-4: Methodenvergleich zwischen den beiden Verfahren für die Parameter CEV und AAV.

109 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids Nachweisgrenze Unter den angegebenen Bedingungen für die Probenaufbereitung konnten auf der Basis des dreifachen Signal-Rausch-Verhältnisses des GC/MS-Systems für die Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivate folgende Nachweisgrenzen abgeschätzt werden. Analyt pmol/g Globin Nachweisgrenzen µg/l Blut CEV 4 0,1 AAV 4 0,1 GAV 4 0,1 Tabelle 6-10: Nachweisgrenzen der Methode in pmol/g Globin und µg/l Blut. CEV: N-2-Cyanoethylvalin, AAV: N-2-Carbamoylethylvalin, GAV: N-(R,S)-2-Hydroxy- 2-Carbamoylethylvalin Störeinflüsse Neben den bereits in Kapitel ausgeführten Störeinflüssen wirkt sich für diese Analytik speziell das ehlen eines Internen Standards negativ auf die Praktikabilität der Analytik aus. So muss eine Probe oder ein Standard, bei der es zu einem sichtbaren größeren Analyt-Verlust (z. B. durch fehlerhaftes Abpipettieren der Extraktionsphasen, undichte Gläschen o. ä.) gekommen ist, auf jeden all verworfen werden, da diese Verluste nicht mehr kompensiert werden können. Des Weiteren ist darauf zu achten, dass die Gläschen, in denen die Acetonisierung stattfindet, dicht verschlossen sind. Wie in Kap dargelegt, wurde die Acetonisierungslösung vorzugsweise über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Undichtigkeiten können dabei unter Umständen zur Verdampfung des Acetons und einem trockenen Rückstand führen. In diesem alle sind speziell für das Glycidamid- Addukt keine verlässlichen Resultate mehr zu erwarten. Weiterhin sollte im Zuge der Neutralisierung der Acetonisierungslösung mit 0,1 M NaHC 3 -Lösung zügig weitergearbeitet werden. Das gebildete xazolidinon-derivat ist in alkalischer Lösung instabil, ein längeres Verbleiben des Analyten in der Lösung sollte daher vermieden werden. erner ist darauf hinzuweisen, dass die Zugabe des Internen Standards (100 µl der ISTD-AL, 1 mg/l Ethoxyethylvalin-Alanin-Anilid in Ethanol) zu empfehlen ist, obwohl der Interne Standard aufgrund der starken Quenching-Effekte in der Negativen Chemischen Ionisierung für die Auswertung nicht herangezogen werden kann. Im

110 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 99 Zuge der Aufarbeitung ohne die Zugabe des Internen Standards fiel auf, dass nach dem finalen Einengen der Toluolphase zur Trockne ein kristalliner Rückstand zurück blieb, der in den Aufarbeitungen mit Zugabe des ISTDs nicht auftrat. Wie sich herausstellte, führt dieser Rückstand zu einer erheblichen Belastung der chromatographischen Säule, was sich in verstärktem Säulenbluten sowie höherem Grundrauschen in den Chromatogrammen bemerkbar macht. Die Gründe für dieses Phänomen sind bisher unklar, es kann ange nommen werden, dass der Rückstand aus nicht abreagiertem Pentafluorphenylisothiocyanat oder entsprechenden Hydrolyseprodukten besteht. Inwiefern die Zugabe des ISTDs hier einen Einfluss auf das Abreagieren bzw. die Aufreinigung von diesen Rückständen hat, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden Herstellen von D 3 -CEV und D 3 -AAV als interne Standards Erst im Zuge der Anwendung des Verfahrens wurde bemerkt, dass der bisherige Interne Standard für diese Methode in der Negativen Chemischen Ionisierung nicht auswertbar ist. Das ehlen eines Internen Standards wirkt sich nachteilig auf die Zuverlässigkeit der Methode aus. Um daher für zukünftige Studien einen Internen Standard zur Verfügung zu haben, wurden unter Verwendung von Nichtraucherblut die Deuterium-markierten Analyten D 3 -CEV und D 3 -AAV als Interne Standards hergestellt. Dabei wird der Mechanismus der Michael-Addition (s. Kap. 3.2) ausgenutzt. Zunächst wird das Erythrocytenlysat eines Nichtrauchers entsprechend der in Kap beschriebenen Vorgehensweise hergestellt. 2,5 ml dieses Erythrocytenlysats werden in ein 5 ml-schraubglas mit teflonkaschiertem Innenseptum und Schraubdeckel pipettiert. Es werden 50 µl D 3 -Acrylamid (z. B. Dr. Ehrenstorfer) bzw. 50 µl D 3 -Acrylnitril (z. B. Aldrich) hinzugegeben, das Schraubgläschen wird fest verschlossen und die Probe für 4 Stunden bei Raumtemperatur auf dem Wippschüttler durchmischt. 2 ml des so behandelten Erythrocytenlysats werden in ein 30 ml Plastikröhrchen mit Deckel pipettiert und das Globin analog der in Kap gegebenen Arbeitsvorschrift isoliert. Das so isolierte Globin muss für den Einsatz als Interner Standard verdünnt werden. Dazu werden 100 mg des Globins in 3 ml ormamid aufgelöst (= Stammlösung des D 3 -markierten Internen Standards). Von diesen Stammlösungen werden jeweils 200

111 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 100 µl in einen 20-ml-Messkolben pipettiert, der mit ormamid bis zur Marke aufgefüllt wird (= Arbeitslösung des Internen Standards). Von dieser Arbeitslösung können 10 µl als Interner Standard dem Ansatz des modifizierten Edman-Abbaus analog der in Kap bzw gegebenen Arbeitsvorschrift zugegeben werden. Die Stammlösung sowie die Arbeitslösung sollten bei -18 C gelagert werden, hierbei ist auf die Volumenausdehnung des ormamids beim Einfrieren zu achten. Die Haltbarkeit der so gelagerten Lösungen kann derzeit noch nicht abgeschätzt werden. Der Addukt-Gehalt der auf diese Weise hergestellten Globine kann sehr stark schwanken, abhängig von der Reaktionszeit und -ausbeute. Die hier beschriebene Verdünnung kann lediglich als Anhaltspunkt gesehen werden, gegebenenfalls muss das Globin weiter verdünnt werden. Die Massenspektren der so hergestellten Internen Standards D 3 -AAV bzw. D 3 -CEV im EI-Modus des Massenspektrometers sind im Anhang dieser Arbeit dargestellt. Eine Verunreinigung durch Addukte von nicht-markiertem Acrylamid bzw. Acrylnitril (entsprechend AAV bzw. CEV) war dabei nicht zu beobachten. Auch ein Austausch der Deuterium-Atome konnte im Zuge der Aufarbeitung nicht nachgewiesen werden Diskussion der Methode Mit der hier vorgestellten Methode lassen sich neben den Addukten des Acrylamids sowie seines oxidativen Metaboliten Glycidamid auch das Addukt des Acrylnitrils am N-terminalen Valin des Hämoglobins im umweltmedizinischen Konzentrationsbereich spezifisch, hochempfindlich und mit guter Reproduzierbarkeit nachweisen. Die Probenaufarbeitung ist aufwendiger als das in Kap. 6 behandelte Verfahren und dauert ausgehend von Vollblut etwa 4 Tage. Die Nachweisgrenze des hier behandelten Verfahrens ist dabei speziell für AAV mit 4 pmol/g Globin deutlich niedriger als das in Kap. 6 behandelte Verfahren und ist vergleichbar mit den in der Literatur für GC/MS/MS-Geräte beschriebenen Nachweisgrenzen 25. ür die Detektion der Analyten wurde dabei die Negative Chemische Ionisation (NCI- MS) gewählt. Im Zuge der Methodenentwicklung an einem GC-EI-MS-Gerät zeigte sich sehr rasch, daß nur so eine für die Bestimmung des Glycidamid-Adduktes im Blut der Allgemeinbevölkerung ausreichende Nachweisgrenze erreicht werden kann. Dabei wurde festgestellt, dass der bisherige Interne Standard für die NCI-Messung

112 Bestimmung von Hb-Addukten des Acrylamids und Glycidamids 101 nicht geeignet ist. ür die durchgeführte Pilotstudie wurden die bereits aufgearbeiteten Blutproben deshalb ohne Berücksichtigung des Internen Standards anhand der mitgeführten Kalibrierkurven ausgewertet. Die erhaltenen Präzisionsdaten sowie der in Kap dargelegte Methodenvergleich zeigen, dass diese Vorgehensweise zu gut reproduzierbaren und vergleichbaren Ergebnissen führte. ür den Einsatz des Verfahrens in der Routineanalytik und in weiterführenden Studien ist ein interner Standard jedoch unerlässlich. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit Deuterium-markierte Interne Standards für die Addukt-Analytik hergestellt (s. Kap ). Die hergestellten D 3 -CEV- sowie D 3 -AAV-Globinlösungen sind dabei als Interne Standards in idealer Weise geeignet, da sie bis auf die Markierung mit Deuterium mit den nachzuweisenden Addukten identisch sind und somit alle im Zuge der Aufarbeitung und der GC/MS-Bestimmung möglicherweise auftretenden Effekte kompensieren können. Im Zuge der Übertragung der hier vorgestellten Methode auf ein neuerworbenes GC/MS/MS-System wurden diese markierten Standards erstmals eingesetzt (vgl. Kapitel 10).

113 Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter und der Allgemeinbevölkerung Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter sowie der Allgemeinbevölkerung 9.1. Hintergrund Die Anwendung der in Kapitel 8 vorgestellten Methode auf Humanblutproben liefert einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung des oxidativen Metabolismus von Acrylamid beim Menschen. Wie in Kapitel bereits dargelegt, wird Glycidamid aufgrund seiner hohen Reaktivität gegenüber der DNA massgeblich für die kanzerogenen Eigenschaften des Acrylamids verantwortlich gemacht. Vor dem Hintergrund der ubiquitären Exposition der Allgemeinbevölkerung über die Nahrung liefert die Bestimmung des Hämglobin-Addukts des Glycidamids als ein Mass für die effektive in vivo-dosis des genotoxischen Agens wertvolle Informationen für die Risikobewertung der täglichen Acrylamid-Aufnahme. Durch den Vergleich mit den Ergebnissen von Tierversuchen können dabei Rückschlüsse auf das tatsächliche kanzerogene Potential von Acrylamid für den Menschen gezogen werden. Bisher liegen über das Ausmass des oxidativen Metabolismus von Acrylamid beim Menschen speziell im umweltmedizinischen Konzentrationsbereich keine umfassenden Untersuchungen vor. Im Rahmen der Studie ist dabei auch von Interesse, inwiefern die höhere Exposition von Rauchern bzw. am Arbeitsplatz gegenüber Acrylamid exponierten Personen sich auf die effektive innere Dosis des Glycidamids im Sinne einer Dosis-Wirkungsbeziehung auswirkt. Zu diesem Zweck wurden von uns eine größere Anzahl von Blutproben von Nichtrauchern und Rauchern der deutschen Allgemeinbevölkerung mit Hilfe der in Kapitel 8 vorgestellten Methode auf die Hämoglobin-Addukte von Acrylnitril (N- Cyanoethylvalin, CEV), Acrylamid (N-2-Carbamoylethylvalin, AAV) sowie Glycidamid (N-(R,S)-2-hydroxy-2-carbamoylethylvalin) untersucht. Gleichzeitig standen uns Blutproben von Arbeitern zur Verfügung, die im Zuge der Produktion von Brandschutzglas am Arbeitsplatz gegenüber Acrylamid exponiert waren.

114 Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter und der Allgemeinbevölkerung Kollektivbeschreibung Das Kollektiv der Allgemeinbevölkerung bestand aus insgesamt 29 erwachsenen Personen (7 Männer, 22 rauen), die innerhalb Bayerns wohnen und an einem größer angelegten Projekt zur Bestimmung der inneren Belastung der bayrischen Bevölkerung gegenüber Acrylamid und aromatischen Aminen teilgenommen haben. Das Alter der Personen lag zwischen 16 und 67 Jahren mit einem Altersmedian von 35 Jahren. Die Blutproben des Projektes wurden von Mai 2003 bis Januar 2004 gewonnen, die Erythrocyten isoliert und lysiert und bei -18 C bis zur Analyse eingefroren. Das Kollektiv wurde sowohl anhand der in einem projektbegleitenden ragebogen angegebenen, selbst berichteten Rauchgewohnheiten als auch analog der Vorgehensweise in Kap anhand des im Blut gemessenen Acrylnitril- Hämoglobin-Addukts CEV in Raucher und Nichtraucher unterteilt. Demnach bestand das Kollektiv der Allgemeinbevölkerung aus 13 Nichtrauchern (3 Männer, 10 rauen) im Altersbereich Jahre (Median: 39 Jahre). erner wurden 16 Raucher (4 Männer, 12 rauen) im Alter zwischen 16 und 67 Jahren untersucht (Median: 35 Jahre). Die Angabe der täglich gerauchten Zigaretten lag zwischen 2 und 30 Zigaretten/Tag mit einem Median von 10 Zig./Tag. Des Weiteren standen uns noch insgesamt 17 Blutproben von männlichen Arbeitern zur Verfügung, die im Rahmen der Produktion von Brandschutzglas am Arbeitsplatz potentiell gegenüber Acrylamid exponiert sind. Das Alter dieser Personen reichte von 18 bis 48 Jahren mit einem Altersmedian von 30 Jahren. Eine Abfrage der individuellen Rauchgewohnheiten wurde für diese Personen nicht vorgenommen. Die Bestimmung der Globin-Addukte von Acrylnitril, Acrylamid und Glycidamid erfolgte nach der in Kap. 8 beschriebenen Methode. Die statistische Auswertung und die Berechnung der Ergebnisse erfolgten mit Microsoft Excel XP und Microcal rigin Ergebnisse der Hb-Addukt-Untersuchungen Die Ergebnisse für die Hämoglobin-Addukte des Acrylnitrils (CEV), Acrylamid (AAV) und Glycidamids (GAV) in den untersuchten Nichtrauchern, Rauchern und potentiell belasteten Arbeitern sind in Tabelle 9-1 zusammengefasst.

115 Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter und der Allgemeinbevölkerung 104 Nichtraucher (n=13) Rauche r (n=16) Acrylnitril-Adduk t (CEV) Acrylamid-Addukt (AAV) Glycidamid-A ddukt ( GAV) GA V : AAV pmol/ g Globin µg/l Blut l/g Globin pmo µg/ l Blut pmol/ g Glo bin µg/l Blut % N WG Median 95. Perz. Bereich 4 < 4 < 4 < 4 0,1 < 0,1 < 0, 1 < 0, ,1 0,5 0,8 0,2 0, ,1 0,5 0,6 0,3 0, Median 95. Perz. Bereich ,2 7,8 0,9 8, ,2 4,5 0,7 5, ,3 3,3 0,7 3, Arbeiter (n=17) * Median 243 6, , Perz , , ,3 --- Bereich ,4 14, ,8 55, ,6 10, Verhältnis unterscheidet sich signifi kant von NR ( zweiseitiger t-t est, p < 0,05) 3,8 52 ** Verhältnis unterscheidet sich signifi kant von R (zweiseitige r t-test, p < 0, 01) Tabelle 9-1: Hämoglobin-Addukte von Acrylnitril, Acrylami d und Glycidamid im Blut von Nichtrauchern, Rauch ern und potentiell Acrylamid-exponierten Arbeitern. **

116 Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid der Allgemeinbevölkerung In dieser Tabelle ebenfalls enthalten ist im Blut belasteter Arbeiter und das Ausmass des oxidativen Stoffwechsels von Acrylamid in den untersuchte n Personengruppen, ausgedrückt als prozentuales Verhältnis der Hämoglobin-Addukte des oxidativen Metaboliten Glycidamid zu den Addukten des Acrylamids. Bemerkenswert ist in erster Linie, dass in jeder der untersuchten Blutproben sowohl Hämoglobin-Addukte von Acrylamid als auch von dessen Metaboliten Glycidamid nachgewiesen werden konnten. Dies ist nicht zuletzt auf die sehr hohe Empfindlichkeit und Selektivität der angewandten Methode zurückzuführen. Zum anderen wurden d abei für das allgemeinen Erwartung erstaunlich hohe Konzentrationen ermittelt. Die in Nichtrauchern nachgewiesenen Konzentrationen für das Acrylamid-Addukt betragen dabei sowohl für das Acrylamid-Addukt als auch für das Addukt des genotoxischen Metaboliten Glycidamid im Median 18 pmol/g Globin (0,5 µg/l Blut). Wie bereits anhand der in Kap itel 7 dargelegten Ergebnisse erwartet wurde, ist die effektive innere Belastung von Rauchern deutlich höher: die Acrylamid-Addukt- Konzentration im Blut der Raucher beträgt im Median 83 pmol/g Globin (2,2 µg/l Blut), w ährend der Level des Glycidamid-Addukts im Blut von Rauchern im Median 44 pmol/g Globin (1,3 µg/l Blut) beträgt. Das Acrylnitril-Addukt Cyanoethylvalin war (analog Kap. 7.2.) nur in der Gruppe der rauchenden Allgemeinbevölkerung nachweisbar mit einem Median von 130 pmol/g Globin (3,2 µg/l Blut). In der Gruppe der Acrylamid-exponierten Arbeiter sind deutlich höhere Acrylamid- Addukt-Konzentrationen messbar (vgl. K ap c)). Dies gilt jedoch nicht generell für alle Arbeiter und ist vermutlich von der Tätigkeit sowie den getroffenen persönlichen Schutzmassnahmen des Arbeiters abhängig. Derartige Informationen sicher auch das Rauchverhalten der Konzentration. Leider lagen hierzu keine Informationen vor. Im Median betrug die Konzentration des Acrylamid-Addukts im Blut der Arbeiter 237 pmol/g Globin (6,4 µ g/l Blut) und ist untersuchten Rauchern des Vergleichskollektivs. Demgegenüber wurde das Glycidamid-Addukt mit einem Median nachgewiesen. Bemerkenswert ist dabei der grosse Streubereich der Ergebnisse mit Werten von pmol/g Globin (0,8-55,9 µg/l Blut) für AAV und pmol/g Globin (0,6-10,7 µg/l Blut). 105 Addukt des Glycidamids entgegen der Arbeiter einen Einfluss auf die Addukt- wurden im Zuge der Probenaquirierung jedoch nicht erhoben. Darüber hinaus hat damit nochmals 4fach höher als bei den von 131 pmol/g Globin (3,8 µg/l Blut)

117 Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter und der Allgemeinbevölkerung Die teilweise ebenfalls nachgewiesenen, sehr hohen Konzentrationen für das Acrylnitril-Addukt CEV im Blut dieser Arbeiter (bis zu 561 pmol/g Globin = 14 µg/l Blut) können unter Umständen auf eine Co-Exposition der Arbeiter mit Acrylnitril hindeuten. Da keine Informationen über das Rauchverhalten dieser Personen sowie die bei der Produktion zusätzlich verwendeten Arbeitsstoffe (oder mögliche Verunreinigungen) vorliegen, kann diese rage nicht abschließend geklärt werden Diskussion Die Konzentrationen der Addukte des unveränderten Acrylamids sowie seines oxidativen Metaboliten Glycidamid im Blut der untersuchten Personen zeigen eine hochsignifikante Korrelation. Abbildung 9-1 zeigt das individuelle Verhältnis zwischen dem Addukt des oxidativen Stoffwechsels von Acrylamid (GAV) und des reduktiven Stoffwechsels (AAV), aufgeteilt auf die untersuchten Kollektive. n) pmol/g Globi GAV ( Nichtraucher (n=13) Raucher (n=16) expon. Arbeiter (n=17) y = 0,194 x + 39,2 R = 0,9084 p < 0, AAV (pmol/g Globin) Abb. 9-1: Korrelation zwischen der Konzentration an Addukten des Glycidamids (GAV) und des Acrylamids (AAV) im Blut der untersuchten Personen.

118 Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter und der Allgemeinbevölkerung Dabei zeigt sich ein deutliches Abflachen der Korrelation bei erhöhten inneren Expositionen gegenüber Acrylamid. Wie Tabelle 9-1 und Abbildung 9-1 bereits andeuten, scheint der Addukt-Level des Glycidamids bei erhöhter innerer Exposition gegenüber Acrylamid nicht in gleicher Weise anzusteigen wie die Konzentration des (reduktiven) Acrylamid-Adduktes. In diesem Zusammenhang muss betont werden, dass sich das GAV/AAV-Verhältnis in allen 3 untersuchten Unterkollektiven (Nichtraucher, Raucher, Arbeiter) signifikant voneinander unterscheidet (zweiseitiger t-test, p < 0,05 bzw. p < 0,01). Dies wird auch in Abbildung 9-2 deutlich, in der das Ausmass des oxidativen Stoffwechsels (als prozentuales Verhältnis GAV/AAV) gegen die effektive innere Acrylamid-Dosis (als AAV) aufgetragen wurde GAV / AAV (%) Nichtraucher (n=13) Raucher (n=16) expon. Arbeiter (n=17) AAV (pmol/g globin) Abb. 9-2: xidativer Stoffwechsel von Acrylamid in Abhängigkeit von der effektiven inneren Dosis (AAV) Demnach scheint eine höhere innere Exposition gegenüber Acrylamid (gemessen als AAV) mit einem geringeren oxidativen Metabolismus von Acrylamid (ausgedrückt als Verhältnis GAV/AAV) verknüpft zu sein.

119 Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter und der Allgemeinbevölkerung Eine Vielzahl von möglichen Gründen kann für dieses Phänomen verantwortlich sein. Dies könnte einerseits ein Indiz für eine Sättigung des für die xidation von Acrylamid zu Glycidamid zuständigen Enzymsystems in der Leber (CYP 2 E1, vgl. Abb. 5-2) sein. Ähnliche Beobachtungen wurden in Tierversuchen an Ratten bereits festgestellt, bei denen als Marker für die innere Belastung ebenfalls die Hämoglobin- Alternativ könnte eine mögliche Induktion der für die Hydrolyse von Glycidamid zu Addukte nachgewiesen wurden 85. Allerdings waren die diesen Ratten dabei verabreichten Acrylamid-Dosen und nachgewiesenen inneren Belastungen um ein Vielfaches höher als die in dieser Studie nachgewiesenen Addukt-Konzentrationen. 2,3-dihydroxypropionamid zuständigen Enzymsysteme für das Abflachen der inneren Exposition gegenüber Glycidamid bei steigender Exposition gegenüber Acrylamid verantwortlich sein (vgl. Abb. 5-2). Die unterschiedlich hohe Acrylamid-Exposition (Nahrung, Rauchen, Arbeitsplatz) der in dieser Studie untersuchten Personen beeinflusst massgeblich die im Blut nachgewiesenen Glycidamid-Addukt-Konzentrationen. Die hohe Variabilität der effektiven inneren Dosis von Glycidamid (als GAV) innerhalb der untersuchten Gruppen könnte darüber hinaus als Indiz für den Einfluss der interindividuell unterschiedlichen Suszeptibilität gelten, z. B. die Aktivität der im Metabolismus ebenfalls bedeutsamen Glutathion-S-Transferasen bzw. die Aktivität des oxidierenden Leberenzymsystems CYP 2E1. Da CYP 2E1 auch in der Verstoffwechselung von Alkohol sowie verschiedenster Medikamente eine entscheidende Rolle spielt (und entsprechend induziert werden kann), könnten die individuellen Lebensgewohnheiten ebenfalls entscheidenden Einfluss auf das GAV/AAV-Verhältnis nehmen 86,87. Durch die Untersuchung von grösseren Bevölkerungsgruppen auf die Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid sowie die parallele Bestimmung der oben erwähnten Suszeptibilitätsparameter 88 (und ggf. die Erfassung der Lebensgewohnheiten) könnte ein für die Risikobewertung bedeutsamer Einblick in den Metabolismus von Acrylamid beim Menschen und mögliche Einflussfaktoren gewonnen werden. Die hier vorgestellte Studie stellt die grösste bisher durchgeführte Studie zur Bestimmung der inneren Exposition von Menschen gegenüber Acrylamid und Glycidamid dar. Tabelle 9-2 gibt einen Überblick über alle weltweit bisher veröffentlichten Studien zur Bestimmung von Acrylamid- und Glycidamid-Hb- 108

120 Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter und der Allgemeinbevölkerung Addukten in Menschen und Versuchsnagern. Dabei sind die in den einzelnen Studien bestimmten Mittelwerte für die Addukte angegeben. ür Menschen liegen bisher lediglich 3 Arbeiten vor. Paulsson et al. haben dabei im Blut von 5 nichtrauchenden Personen im Mittel Konzentrationen von 27 pmol/g Globin für AAV und 26 pmol/g Globin für GAV nachgewiesen 83. Die Werte sind zwar etwas höher als die in dieser Arbeit bestimmten Werte für die Nichtraucher, liegen jedoch in einem vergleichbaren Rahmen. Perez et al. haben in einer früheren Studie ebenfalls AA- und GA-Hb-Addukte im Blut von Arbeitern einer koreanischen Chemiefabrik zur Herstellung von Acrylamid sowie 2 rauchenden und 2 nichtrauchenden Kontrollpersonen gemessen 89. Im Gegensatz zu allen anderen in Tabelle 9-2 aufgeführten Studien beträgt das prozentuale Verhältnis zwischen GAV und AAV in dieser Studie lediglich 7 9 %. Eine mögliche Erklärung für diese Diskrepanz liegt in der Art, wie diese Autoren die Kalibrierung und Quantifizierung der untersuchten Addukte durchgeführt haben. In dieser Studie wurden die Pentafluorphenylthiohydantoinderivate (PPTH) von AAV und GAV chemisch synthetisiert und gaschromatographisch-massenspektrometrisch untersucht. In diesen Untersuchungen wurde der Response-aktor für die GC/MS- Analyse (bei gleichen Konzentrationen) zwischen dem PPTH-Derivat von AAV und GAV bestimmt. In der olge wurde mit Hilfe des zuvor bestimmten Responsefaktors und der Kalibrierfunktion für AAV (für die ein entsprechendes Kalibrierglobin vorlag, vgl. Kap ) die Kalibrierfunktion für GAV erstellt, anhand derer die Konzentration an GAV in den unbekannten Proben bestimmt wurde. Diese Vorgehensweise setzt einerseits ähnliche chemische Eigenschaften des PPTH-Derivats von AAV und GAV voraus sowie andererseits ähnliche Reaktionsausbeuten im modifizierten Edman-Abbau. Aufgrund der deutlich höheren Polarität des GAV-PPTH-Derivates im Vergleich zum AAV-PPTH-Derivat und den damit verbundenen niedrigeren Extraktionsausbeuten kann die GAV-Konzentration durch diese Vorgehensweise deutlich unterschätzt werden. 109

121 Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter und der Allgemeinbevölkerung 110 Referenz Diese Arbeit Mensc h Paulsson et al Spezie s Exposition N AAV (pmol/g globin) NR ± ± 48 Arbeiter ± 636 Mensc h NR 5 27 ± 6 Ratte Kontroll e 6 8 ± 2 Ma us Kontroll e 6 7 ± 1 Paulsson et al. Ratte 1,4 mmol AA/kg KG, i.p. Maus 1,4 mmol AA/kg KG, i.p ennell et al Ratte Perez et al Mensch Bergmark et al Mensch Kontroll e ± ± mg AA/kg KG, oral ± Arbeiter NR 1 < 10 Arbeiter Tabelle 9-2: Vergleich aller bishe r veröffentlichten Studien zu Hb-Addukten von Acrylamid und Glyc idamid in Menschen und Nagern. Angegeben sind die Mittelwerte so wie - wenn möglich - die Standardabweichung. R GAV ( pmol/g glo bin ) 17 ± 4 53 ± ± ± 6 14 ± 5 38 ± ± < GAV: AAV NR R (%)

122 Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid der Allgemeinbevölkerung im Blut belasteter Arbeiter und 111 Die früheste Studie zum Nachweis von Glycidamid-Hämoglobin-Addukten im Menschen stammt von Bergmark et al 80. Dabei wurde GAV im Blut von hochbelasteten Arbeitern einer chinesischen Acrylamid-Produktionsstätte nach der Totalhydrolyse des zuvor isolierten Globins einer sehr aufwendigen Prozedur mittels GC/MS nachgewiesen. Da die Carbamoylfunktion des GAV durch die Säurehydrolyse in eine Carboxylfunktion überführt wurde, ist der Nachweis des entsprechenden Adduktes nicht mehr Exposition mit Acrylnitril vor, dessen oxidativer Metabolit Cyanoethylenepoxid ebenfalls mit Globin reagieren kann. Nach demnach mit dem Parameter 2-Carboxy-2-hyd roxyethylvalin beide Addukte gemeinsam erfasst. Die mit diesem Verfahren erreichte Nachweisgrenze reichte zur Bestimmung der Hintergrundbelastung der Allgemeinbevölkerung nicht aus. Die in einer Kontrollperson ermittelten Werte lagen unterhalb der Nachweisgrenze von 10 bzw pmol/g Globin. als 2-Carboxy-2-hydroxyethylvalin in der erfolgten Säurehydrolyse wurden spezifisch für Glycidamid. Zudem lag für die untersuchten Arbeiter eine Co- Vergleicht man das in Tabelle 9-2 aufgeführte Ausma ss des oxidativen Metabolismus von Acrylamid in den einzelnen Spezies (ausgedrückt als Verhältnis der effektiven inneren Dosis GAV/AAV), so fällt auf, dass der Metabolismus von Acrylamid beim Menschen den Ergebnissen in Ratten deutlich näher steht als etwa in Mäusen. So liegt das durchschnittliche Verhältnis GAV/AAV in nicht-exponierten Kontrollratten zwischen 75 % 57 und 175 % 56. Dies ist durchaus vergleichbar mit dem im Rahmen dieser Studie in Nichtrauchern nachgewiesenen Verhältnis von im Mittel 96 % (Bereich: %). Im Gegensatz dazu überwiegt der oxidative Metabolismus bei den untersuchten Mäusen deutlich: das Verhältnis GAV/AAV in nicht-exponierten Kontrollmäusen lag mit durchschnittlich 543 % ca. 4 5fach höher als etwa in Ratten oder Menschen. Da die metabolische Aktivierung von Acrylamid zu seinem genotoxischen Metaboliten Glycidamid im Menschen also zu einem durchaus vergleichbaren Ausmass wie etwa in Ratten erfolgt, liegt es nahe, anzunehmen, dass die Risikoabschätzungen für Acrylamid 64,81, die auf der Basis von Tierversuchen an Ratten aufgestellt wurden, das Krebsrisiko für den Menschen in adäquater Weise widerspiegeln.

123 Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter und 112 der Allgemeinbevölkerung An dieser Stelle sei darauf hingewiesen, dass die innere Acrylamid-Exposition der untersuchten, nicht exponierten Kontrolltiere vermutlich analog der humanen Exposition über das verabreichte utter erfolgt ist. Eine kürzlich veröffentlichte Publikation stellt in diesem Zusammenhang heraus, dass speziell das für das utter von Labortieren übliche Sterilisieren durch die dabei auftretenden hohen Temperaturen zu einem Anstieg der Acrylamid-Konzentration im utter führt 90. Auch in Kraftfutter von Milchkühen konnte vor kurzem eine beträchtliche Konzentration an Acrylamid (bis zu 180 µg/kg) nachgewiesen werden, ein quantitativ bedeutsamer Übergang in die Milch wurde allerdings ausgeschlossen 91. ür die immer wieder diskutierte, mögliche endogene Bildung von Acrylamid innerhalb des Stoffwechsels (oder durch andere endogene Prozesse) gibt es derzeit keinerlei wissenschaftlich fundierte Anhaltspunkte. Andererseits kann eine mögliche endogene Bildung sowie ein daraus resultierender Beitrag zur inneren Acrylamid- Belastung der Allgemeinbevölkerung nicht vollständig ausgeschlossen werden.

124 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS Hintergrund Durch den Erwerb eines neuen GC-MS/MS-Systems war es möglich, die Hämoglobin-Addukte von Acrylamid, Glycidamid und Acrylnitril auch tandemmassenspektrometrisch mittels Negativer Chemischer Ionisierung nachzuweisen. Die Aufarbeitung erfolgte dabei nach der in Kapitel 8 beschriebenen Methode, im olgenden wird lediglich auf die gerätespezifischen Parameter und geringfügige Änderungen eingegangen. Im Rahmen der Übertragung der Methode auf das Tandem-Massenspektrometer konnte auch die Eignung der nach Kapitel hergestellten Internen Standards D-3-CEV und D-3-AAV bestätigt werden Geräte, Chemikalien und Lösungen Geräte Gaschromatograph CP-3800 (Varian, Darmstadt) Triple-Quadrupol-Massenspektrometer 1200L (Varian, Darmstadt) Autosampler CP-8400 (Varian, Darmstadt) 10 µl-spritze für die GC (Hamilton, Bonaduz, Schweiz) Hängethermostat für Wasserbäder (Haake Messtechnik, Karlsruhe) Evaporatorstation ReactiVap III (Pierce, Laborcenter Nürnberg) Zentrifuge Multifuge 3 L-R (a. Heraeus, Laborcenter Nürnberg) Vortex-Mixer Genie 2 (a. Scientific Industries, Laborcenter Nürnberg) Wippschüttler RM 5 (a. CAT, Laborcenter Nürnberg) Magnetrührer IKAMAG RH (a. IKA Labortechnik, Laborcenter Nürnberg) Ultraschallbad Ultrasonic Cleaner (a. VWR, Laborcenter Nürnberg) Verschiedene Pipetten und Multipetten (Eppendorf, Hamburg) EDTA-Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht)

125 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS 114 Plastikröhrchen mit Deckel, Nutzvolumen 13 ml und 30 ml (Laborcenter Nürnberg) Schraubampullen mit teflonkaschierten Gummisepten und Schraubverschluss- kappen, Volumen 2 ml (Macherey-Nagel, Düren) Schraubgläschen mit teflonkaschierten Gummisepten und Schraubdeckel, Volumen 5 ml und 20 ml Mikroeinsätze für die Rollrandampullen, Nutzvolumen 200 µl (Macherey-Nagel, Düren) Chemikalien Diethylether p. a. (Merck, Darmstadt) Ethanol p. a. (Merck, Darmstadt) 2-Propanol p.a. (Merck, Darmstadt) Ethylacetat p.a. (Merck, Darmstadt) Aceton für die Gaschromatographie (Merck, Darmstadt) Toluol für die Gaschromatographie (Merck, Darmstadt) n-hexan für die Gaschromatographie (Merck, Darmstadt) Salzsäure konzentriert 37 % (Merck, Darmstadt) Schwefelsäure konzentriert 98 % (Merck, Darmstadt) Wasser deionisiert ormamid ultrapure (United States Biochemicals, Cleveland, USA) N-2-Cyanoethylvalin-Leucin-Anilid (Bachem Biochemica, Heidelberg) N-2-Carbamoylethylvalin-Leucin-Anilid (Bachem Biochemica, Heidelberg) N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin-Leucin-Anilid (Bachem Biochemica, Heidelberg, Auftragssynthese) (Reinheit > 99 %) Natriumcarbonat wasserfrei (Merck, Darmstadt) Natriumhydrogencarbonat p.a. (Merck, Darmstadt) Natriumhydroxid p.a. (Merck, Darmstadt) Natriumchlorid p.a. (Merck, Darmstadt) Pentafluorphenylisothiocyanat (luka, Buchs, Schweiz) Helium Reinheit 5.0 (a. Linde, München) Methan Reinheit 4.5 (a. Linde, München) Argon Reinheit 5.0 (a. Linde, München)

126 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS Lösungen entsprechend Kap Vergleichsstandards entsprechend Kap Probennahme und Probenaufbereitung Gewinnung des Erythrocytenhämolysats Erfolgt analog der in Kap gegebenen Arbeitsvorschrift Isolierung des Globins Erfolgt analog der in Kap gegebenen Arbeitsvorschrift. Herstellung von Poolglobin Erfolgt analog der in Kap gegebenen Arbeitsvorschrift Herstellung von Kalibrierstandards entsprechend Kap Durchführung des modifizierten Edman-Abbaus Es werden ca. 100 mg des zuvor aus den zu untersuchenden Blutproben isolierten Globins in ein 5-ml-Schraubglas genau eingewogen und unter Mischen auf dem Wippschüttler in 3 ml ormamid gelöst. Es werden 40 µl 1 N NaH, 10 µl der Arbeitslösung der deuterium-markierten Internen Standards (D-3-CEV und D-3-AAV, vgl. Kap ) sowie 15 µl Pentafluorphenylisothiocyanat zugegeben und die Probe weiterhin für 6 8 Stunden bei Raumtemperatur auf dem Wippschüttler durchmischt. Die weitere Aufarbeitung erfolgt analog der in Kap gegebenen Arbeitsvorschrift.

127 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS Acetonisierung des GAV-Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivates Der trockene Rückstand wird in 100 µl der frisch angesetzten Lösung von 1% Schwefelsäure in Aceton (v/v) aufgelöst. Das 5-ml-Schraubglas wird fest verschlossen und mindestens 2 Stunden (vorzugsweise über Nacht) bei Raumtemperatur belassen. Die saure Lösung wird dann durch Zugabe von 150 µl der 0,1 M NaHC 3 -Lösung neutralisiert. Es wird 1 ml Toluol zugegeben und die Lösung zweimal mit je 2 ml Wasser gewaschen. Dazu wird die Probe jeweils für 60 s auf dem Vortex-Mixer intensiv durchmischt und anschließend bei 800 g für 5 min zentrifugiert. Schließlich wird die Toluolphase abgehoben und in eine 2 ml-schraubampulle überführt. Die Probe wird im Stickstoffstrom erneut bis zur Trockne eingeengt, wobei ein leichtes Erwärmen mit einem Magnetrührer erfolgen kann. Der Rückstand wird in 100 µl Toluol gelöst und in ein Mikrovial überführt. Das Gläschen wird schließlich mit einer Schraubverschlusskappe mit teflonkaschiertem Innenseptum verschlossen. 1 µl dieser Lösung wird in den Gaschromatographen injiziert Gaschromatographisch-massenspektrometrische Arbeitsbedingungen Kapillarsäule DB 17-HT 30 m x 0,25 mm, 0,15 µm ilmdicke (J & W Scientific, olsom, CA, USA) Trägergas Helium 5.0 lussgeschwindigkeit 1,3 ml/min (constant flow) Injektion 1 µl, splitless Gerätetemperaturen Injektor 280 C Transferline 280 C Säulenofen 90 C, 1 min halten 25 C/min auf 120 C 10 C/min auf 240 C 25 C/min auf 310 C, 10 min halten

128 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS 117 Ionisierung Negative Chemische Ionisation Ionisierungsenergie 70 ev Reaktandgas Methan 4.5 Ionenquellendruck ~ 6,5 Torr Ionenquellentemperatur 150 C Detektion Multiple Reaction Monitoring (MRM) Argon-Druck in der Collision Cell (Q2): ~ 2 mtorr Analytische Bestimmung Je 1 µl der nach und aufgearbeiteten Proben wird splitless in das GC/MS/MS-System injiziert. Die Identifizierung der Pentafluorphenylthiohydantoine erfolgt anhand der Retentionszeit und der charakteristischen Ionenzerfälle, die für den jeweiligen Analyten aufgenommen werden. Dabei wurden für die Analyten in der Regel zwei Zerfälle des im ersten Quadrupol isolierten, spezifischen Mutter-Ions aufgenommen. Die Tochterionenspektren der Analyten sind im Anhang dieser Arbeit abgebildet. In Tabelle 10-1 werden die Retentionszeiten, die aufgenommenen Ionenzerfälle sowie die Kollisionsenergie für die einzelnen Analyten unter den angegebenen Bedingu ngen dargestellt. Die in Ta belle 10-1 angegebenen Retentionszeiten können dabei nur als Anhaltspunkt dienen und - abhängig von der Trennleistung der verwendeten Kapillarsäule Schwankungen unterliegen. Abbildung 10-1 zeigt beispielhaft das Chromatogramm der aufgearbeiteten Blutprobe eines Rauchers aus der Allgemeinbevölkerung. In Abbildung 10-2 wird das Chromatogramm der Blutprobe eines Nichtrauchers dargestellt.

129 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS 118 Analyt Retentionszeit [min] Ionenübergänge (MS/MS, NCI-Modus) Kollisionsenergie Q 1 Q 3 Q 2 CEV 13, * ev D-3-CEV 13, ev AAV 15, * ev D-3-AAV 15, ev GAV 16,25 16, ev Tabelle 10-1: Retentionszeiten, detektierte Ionenübergänge sowie eingestellte Kollisionsenergie für die Analyten. Die mit * gekennzeichneten Übergänge werden zur Quantifizierung herangezogen.

130 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS 119 Chromatogram Plots ile:...dokumente und Einstellungen\promotion\tw.xms Sample: TW per ator: TS Scan Range: Time Range: min. Date: :56 MCounts kcoun ts MCounts MCounts kcounts (-) CI SRM > (10.0 ev) (-) CI SRM > (10.0 ev) (-) CI SRM > (10.0 ev) min. CE V min min. D-3-CEV IST D (-) CI SRM > (10.0 ev ) min. AAV (-) CI SRM > (10.0 ev) min. MCounts (-) CI SRM > (10.0 ev) D-3-AAV ISTD min. MCounts (-) CI SRM > (10.0eV) min. GAV minutes Abbildung 10-1: Repräsentatives Chromatogramm der aufgearbeiteten Blutprobe eines Rauchers aus der Allgemeinbevölkerung. Die hier dargestellte Probe enthielt Addukt-Konzentrationen von 234 pmol/g Globin N-2-Cyanoethylvalin (CEV), 179 pmol/g Globin N-2-Carbamoylethylvalin (AAV) und 87 pmol/g Globin N-(R,S)-2- Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin (GAV).

131 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS 120 C hromatogram Plots ile:...dokumente und Einstellungen\promotion\p_ xms Sa mple: P_ perator: TS S can Range: Time Range: min. Date: :32 kcounts k Counts MCounts k Counts k Counts MCounts (-) CI SRM > (10.0 ev) (-) CI SRM > (10.0 ev) (-) CI SRM > (10.0 ev) min. D-3-CEV ISTD (-) CI SRM > (10.0 ev) AAV (-) CI SRM > (10.0 ev) (-) CI SRM > (10.0 ev) D-3-AAV ISTD min min min. 0 k Counts (-) CI SRM > (10.0 ev) min. GAV minutes Abbildung 10-1: Repräsentatives Chromatogramm der aufgearbeiteten Blutprobe eines Nichtrauchers aus der Allgemeinbevölkerung. Die hier dargestellte Probe enthielt Addukt-Konzentrationen von 56 pmol/g Globin N-2-Carbamoylethylvalin (AAV) und 54 pmol/g Globin N-(R,S)-2-Hydroxy-2-Carbamoylethylvalin (GAV).

132 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS Kalibrierung Die Kalibrierung erfolgt mit Vergleichsstandards, die in aufgelöstem Poolglobin angesetzt werden und in der gleichen Weise behandelt werden wie die zu analysierenden Proben. Als interner Standard wird den Vergleichstandards und den zu analysierenden Proben 10 µl einer Lösung der nach Kap hergestellten, deuterium-markierten Internen Standards D-3-CEV und D-3-AAV zugesetzt. Die gemäß (bzw ) hergestellten Kalibrierstandards werden entsprechend den zu analysierenden Proben nach aufgearbeitet und in das GC/MS/MS-System injiziert. Kalibrierkurven werden erstellt, indem der Quotient der integrierten Peakflächen für die einzelnen Addukte (lediglich die in Tab angegebenen Quantifier-Ionenübergänge werden berücksichtigt) und des jeweiligen deuterierten Internen Standards gebildet wird und gegen die zudotierte Konzentration im Kalibrierstandard (in µg N-Alkylvalin/l ormamid) aufgetragen wird. ür den Parameter GAV wird als Interner Standard D-3-AAV verwendet. Abbildung 10-3 zeigt beispielhaft die Kalibrierkurven für N-2-Cyanoethylvalin, N-2- Carbamoylethylvalin und N-(R,S)-2-hydroxy-2-carbamoylethylvalin im Bereich bis 10 µ g/l ormamid. Kalibrierkurve (GC-NCI/MS/MS) N-2-Cyanoethylvalin (CEV) 1,2 e D-3-CEV Peakfläche CEV/Peakfläch 1 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 0,101x + 0,0074 R 2 = 0, zudotierte Menge [µg/l ormamid]

133 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS 122 Kalibrierkurve (GC-NCI/MS/MS) N-2-Carbamoylethylvalin (AAV) 1,6 Peakfläch e AA V/Peakfläch e D-3-AA V 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 0,1467x + 0, R = 0, Konzentration AAV (µg/l ormamid) Kalibrierkurve (GC-NCI/MS/MS) N-(R,S)-2-hydroxy-2-carbamoylethylvalin (GAV) 10 Peakfläche GAV/Peakfläche D -3-A A V y = 0,8952x + 0,302 2 R = 0, zudotierte Menge GAV [µg/l ormamid] 12 Abb. 10-3: Kalibrierkurven für N-2-Cyanoethylvalin, N-2-Carbamoylethylvalin und N- (R,S)-2-hydroxy-2-carbamoylethylvalin in Poolglobin.

134 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS Berechnung des Analysenergebnisses Die Berechnung des Analysenergebnisses erfolgt nach den in Kap (bzw. 8.7.) angegebenen ormeln. Dabei wird für jede Probe der Quotient aus den integrierten Peakflächen des jeweiligen Analyten sowie des entsprechenden internen Standards gebildet. Mit Hilfe der Steigung der Kalibrierkurve kann die Konzentration der Probe entsprechend berechnet werden (siehe Kap. 6.7.). : Nachweisgrenze Unter den angegebenen Bedingungen für die Probenaufbereitung konnten auf der Basis des dreifachen Signal-Rausch-Verhältnisses des GC/MS/MS-Systems für die Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivate folgende Nachweisgrenzen abgeschätzt werden. Analyt pmol/g Globin Nachweisgrenzen µg/l Blut CEV 2 0,05 AAV 2 0,05 GAV 2 0,05 Tabelle 10-2: Nachweisgrenzen der Methode in pmol/g Globin und µg/l Blut. CEV: N-2-Cyanoethylvalin, AAV: N-2-Carbamoylethylvalin, GAV: N-(R,S)-2-Hydroxy- 2-Carbamoylethylvalin Störeinflüsse Durch die Verwendung der nach Kapitel hergestellten, Deuterium-markierten Internen Standards können alle während der Aufarbeitung auftretenden Verluste sowie mögliche Effekte in der Detektion hervorragend kompensiert werden. Aufgrund des hochspezifischen Nachweises mittels Tandem-Massenspektrometrie sind die erhaltenen Chromatogramme frei von jeglichen Störkomponenten. Die äußerst empfindliche Detektion der Analyten mittels GC-NCI-MS/MS erfordert allerdings einen sehr sorgfältigen Spülvorgang der zur Injektion am Autosampler benutzten GC- um Verschleppungen zu vermeiden. Dabei sollten Lösungsmittel Spritze, verschiedener Polarität zum Einsatz kommen (z.b. Toluol und Ethanol).

135 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte mittels GC/MS/MS 124 Neben den bereits in Kapitel diskutierten Einflüssen konnten im Rahmen der Übertragung der Methode auf das GC/MS/MS-System keine zusätzlichen Störeinflüsse beobachtet werden Diskussion der Methode Mit der Übertragung der Methode auf ein GC/MS/MS-System sowie durch den Einsatz Deuterium-markierter Interner Standards konnten die unter Kapitel diskutierten Probleme weitgehend gelöst werden. Mit Hilfe der Tandem- und den Einsatz der Methode in der Routine-Analytik Massenspektrometrischen Detektion wurde die Spezifität und Empfindlichkeit der Methode erheblich gesteigert. Darüber hinaus wird die Verwendung der nach Kapitel hergestellten Internen Standards die Richtigkeit und Präzision des Verfahrens deutlich steigern erleichtern.

136 Zusammenfassung Zusammenfassung Die Entwicklung und Validierung von Analysenverfahren zum Nachweis von remdstoffen oder deren metabolischen Produkten in biologischem Material (biologisches Monitoring) stellt die Basis für eine umfassende Prävention chemisch bedingter Gesundheitsrisiken dar. Durch die Weiterentwicklung der Analysengeräte sowie der angewandten analytischen Verfahren kann das Biologische Monitoring heute neben berufsbedingten Schadstoffaufnahmen auch zur Erfassung von umweltbedingten Expositionen eingesetzt werden. Einen besonderen Stellenwert besitzen in diesem Zusammenhang analytische Verfahren, mit denen ein Biochemisches Effekt-Monitoring krebserzeugender Arbeits- und Umweltstoffe möglich ist. Krebserzeugende Chemikalien zeichnen sich dadurch aus, dass sie aufgrund ihrer hohen Reaktivität entweder spontan oder nach metabolischer Aktivierung kovalente Bindungen mit der DNA eingehen können. Die Bindung eines Schadstoffes an die DNA wird als initialer Schritt der Kanzerogenese angesehen. Genotoxische Stoffe binden aber auch an andere körpereigene Makromoleküle, wie z. B. Hämoglobin oder Albumin. Es hat sich gezeigt, dass die Addukte eines Schadstoffes an Hämoglobin als Surrogate der DNA-Addukte angesehen werden können, die sich bis heute einem spezifischen Nachweis weitgehend entziehen. Durch die lange Lebensdauer des Erythrocyten im menschlichen Blutkreislauf ist die Quantifizierung von Hämoglobin-Addukten am N-terminalen Valin des Hämoglobins mit Hilfe des modifizierten Edman-Abbaus ideal zur Erfassung von umweltbedingten Niedrigexpositionen gegenüber alkylierenden Substanzen geeignet. Im Zuge der Entdeckung, dass die krebserzeugende Substanz Acrylamid beim Erhitzen verschiedenster stärkehaltiger Lebensmittel entstehen kann und die Allgemeinbevölkerung demnach kontinuierlich gegenüber dieser Substanz exponiert ist, ergab sich aus umweltmedizinischer Sicht erheblicher orschungsbedarf. Dabei galt das Interesse zunächst der Erfassung der inneren Exposition der Allgemeinbevölkerung. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein analytisches Verfahren erarbeitet und validiert werden, welches die simultane Quantifizierung von Addukten der krebserzeugenden Verbindungen Acrylnitril (N-Cyanoethylvalin) und Acrylamid (N-2- Carbamoylethylvalin) im Blut der Allgemeinbevölkerung erlaubt.

137 Zusammenfassung 126 Zur Quantifizierung wurden dabei käuflich erhältliche Dipeptid-Standards eingesetzt, deren Struktur die addukt-tragenden N-terminalen Aminosäuren der Globinkette simuliert. Die Zuverlässigkeit und Vergleichbarkeit der mit dieser Methode ermittelten Ergebnisse wurde in einem Ringversuch belegt, an dem 4 nationale Laboratorien beteiligt waren. Mit dem entwickelten Verfahren war es erstmals möglich, die nahrungsbedingte Hintergrundbelastung der nichtrauchenden Allgemeinbevölkerung gegenüber Acrylamid in Deutschland anhand der Hämoglobin-Addukte zu quantifizieren. Der Acrylamid-Adduktgehalt in Globinen von 25 erwiesenen Nichtrauchern betrug im Median 21 pmol N-2-Carbamoylethylvalin pro Gramm Globin. Da ein Beitrag des Tabakkonsums für diese Personen ausgeschlossen werden kann, muss davon ausgegangen werden, dass die so bestimmte Hintergrundbelastung nahezu ausschließlich auf den Konsum Acrylamid-belasteter Lebensmittel zurückzuführen ist. ür Raucher wurde eine Hintergrundkonzentration von 85 pmol/g Globin ermittelt. Aus den der Literatur entnommenen kinetischen Daten der Hämoglobin-Addukte sowie bereits bekannten Messgrößen (z. B. der Bindungskonstante von Acrylamid an das N-terminale Valin) konnte ferner auf der Basis der in vivo gemessenen Addukt- Konzentration eine Abschätzung der täglich aufgenommenen Acrylamid-Dosis vorgenommen werden. Dabei wurde für Nichtraucher eine mittlere tägliche Acrylamid-Aufnahme von 0,85 µg/kg Körpergewicht berechnet. Im Rahmen der Untersuchungen an Globinproben von Rauchern stellte sich heraus, dass ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der angegebenen Anzahl der täglich gerauchten Zigaretten und der nachgewiesenen Addukt-Konzentration besteht. Besonders eng ist dieser Zusammenhang für das Addukt des Acrylnitrils, N- Cyanoethylvalin. Der Konsum von einer Zigarette pro Tag führt demnach zu einer Zunahme der Konzentration an N-2-Cyanoethylvalin im Erythrocyten um ca. 6 pmol/g Globin. Im Gegensatz dazu ist in Globinen von Nichtrauchern bis zu einer Nachweisgrenze von 4 pmol/g Globin kein entsprechendes Addukt nachweisbar.

138 Zusammenfassung 127 In einem zweiten Schritt konnte mit Hilfe einer weiterentwickelten Methode das Parameterspektrum auch auf die Quantifizierung der Hämoglobin-Addukte von Glycidamid (N-(R,S)-2-hydroxy-2-carbamoylethylvalin), des genotoxischen Metaboliten von Acrylamid, erweitert werden. Unter Anwendung dieses weiterentwickelten Verfahrens war es somit erstmals möglich, die effektive innere Dosis des für die krebserzeugenden Eigenschaften von Acrylamid massgeblichen Metaboliten im Blut der Allgemeinbevölkerung zu quantifizieren. Dabei wurden im Blut von Nichtrauchern annähernd gleiche Konzentrationen der Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin-Addukte nachgewiesen. Die Konzentrationen sowohl des N-2-Carbamoylethylvalins als auch des N-(R,S)-2-hydroxy-2-carbamoylethylvalins lagen für Nichtraucher im Median bei 18 pmol/g Globin. Im Zuge der Anwendung der Analytik auf Raucher und gegenüber Acrylamid exponierte Arbeiter ergaben sich hervorragende Korrelationen zwischen den Konzentrationen der Acrylamid- und Glycidamid-Addukte im Blut der untersuchten Personen. Dabei wurde ein nichtlinearer Zusammenhang zwischen der effektiven inneren Dosis von Acrylamid und Glycidamid beobachtet, das heißt, dass mit steigender Acrylamid- Belastung der relative Anteil des Glycidamid-Adduktes abnimmt. Demnach scheint eine höhere innere Exposition gegenüber Acrylamid mit einem geringeren oxidativen Metabolismus von Acrylamid verknüpft zu sein. Neben einer Sättigung der für die Aktivierung von Acrylamid zuständigen Enzymsysteme (CYP 2E1) kann hier ein Einfluss der individuellen Suszeptibilität diskutiert werden. Ein Vergleich der in dieser Arbeit erhaltenen Daten mit den Ergebnissen aus Tierversuchen an Nagetieren zeigt, dass die metabolische Aktivierung von Acrylamid zu seinem genotoxischen Metaboliten Glycidamid im Menschen zu einem durchaus vergleichbaren Ausmass wie etwa in Ratten erfolgt. Demnach liegt es nahe, anzunehmen, dass die Risikoabschätzungen, die auf der Basis von Tierversuchen an Ratten aufgestellt wurden, das Krebsrisiko von Acrylamid für den Menschen in adäquater Weise widerspiegeln. Im Rahmen dieser Arbeit wurde darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung von isotopenmarkierten Internen Standards für die exakte Quantifizierung der genannten Addukte erarbeitet, welches für die Weiterentwicklung der Addukt-Analytik auch im Hinblick auf eine bessere Vergleichbarkeit der ermittelten Ergebnisse - von grossem

139 Zusammenfassung 128 praktischem Nutzen sein wird. Durch die Übertragung der entwickelten Methoden auf ein GC/MS/MS-System und den Einsatz der synthetisierten Internen Standards konnte in einem abschließenden Schritt die Spezifität, Empfindlichkeit und Routinefähigkeit der vorgestellten Methode nochmals erheblich gesteigert werden.

140 Summary Summary The development and validation of analytical methods for the determination of hazardous substances or their metabolites in biological material (Biological Monitoring) provides the basis for a comprehensive prevention of health risks due to chemical exposures. Because of the continuing further development of analytical devices and the applied analytical methods, biological monitoring can be used today for the determination of occupational as well as environmental exposures. In this context, analytical methods for a biochemical effect monitoring of carcinogenic substances at the workplace or in the environment are of particular importance. Carcinogenic substances are characterised by their high reactivity, so that they can form covalently bond adducts with DNA either spontaneously or after their metabolic activation. The binding of a chemical to the DNA can be regarded as the initial step in carcinogenesis. Genotoxic substances may also bind to other macromolecules in the body like for example hemoglobin or albumin. It has been shown that the adducts of a carcinogen to hemoglobin can be regarded as surrogates for DNA-adducts, which cannot be determined specifically to date. Due to the long lifetime of erythrocytes in the human blood circuit, the quantification of hemoglobin adducts to the N-terminal valine of hemoglobin using the modified Edman-procedure is ideally suited for the measurement of low-level-exposures to alkylating substances. The discovery of acrylamide as a food-borne toxicant generated in the heating process of starch-containing food and the chronic exposure of the general population to this substance resulted in considerable research needs for environmental medicine. irst of all, the determination of the internal exposure of the general population was one of the main interests. Within the scope of this work an analytical method for the simultaneous quantification of the adducts of the carcinogens acrylonitrile (N-cyanoethylvaline) and acrylamide (N-2-carbamoylethylvaline) in the blood of the general population was developed and validated. or quantification purposes we used commercially available dipeptide standards that simulate the structure of the adduct-bearing N-terminal amino acids of the globin chain. The reliability and comparability of the results determined with this method were proven in a interlaboratory comparison which included 4 national research laboratories.

141 Summary 130 With the developed method, it was possible to quantify the body burden of the nonpopulation in Germany to acrylamide by determining the smoking general hemoglobin adducts. The median concentration of the acrylamide adduct in globin of 25 proven non-smokers was 21 pmol N-2-carbamoylethylvaline per gramm globin. Because a contribution of tobacco smoking could be excluded for these persons, it can be assumed that this body burden is mainly due to the consumption of foodstuff burdened with acrylamide. A median background level of 85 pmol/g globin was determined for smokers. rom the kinetics of hemoglobin adducts taken from the literature and some data already known for acrylamide (e.g. the binding constant of acrylamide to the N-terminal valine) we could estimate the daily uptake of acrylamide on the basis of the adduct concentration measured in vivo. In doing so, we calculated a mean daily acrylamide uptake of 0.85 µg/kg body weight. Within the scope of our investigation of smokers globin samples, the self-reported number of daily smoked cigarettes turned out to be significantly correlated with the measured adduct concentration. This correlation is especially close for the adduct of acrylonitrile, N-cyanoethylvaline. Thus, the daily consumption of one cigarette leads to an increase in the adduct level of N-cyanoethylvaline in the erythrocytes of about 6 pmol/g globin. In contrast, this adduct cannot be determined above the limit of detection of 4 pmol/g globin in blood of non-smokers. In a second step, we could also determine the hemoglobin adduct of glycidamide (N- (R,S)-2-hydroxy-2-carbamoylethylvaline), the genotoxic metabolite of acrylamide with the help of an advanced method. Using this advanced procedure, it was for the first time possible to quantify the effective internal dose of the metabolite of acrylamide that is responsible for its carcinogenic properties in the blood of the general population. Thereby we could detect almost equal concentrations of the hemoglobin adducts of acrylamide and glycidamide in blood of non-smokers. The median concentrations of N-2-carbamoylethylvaline as well as of N-2-hydroxy-2- carbamoylethylvaline were 18 pmol/g globin in non-smokers. In the course of the application of the method to smokers and persons with occupational exposure to acrylamide we could find excellent correlations between the concentrations of acrylamide- and glycidamide adducts in the blood of the examined persons.

142 Summary 131 We could notice a non-linear correlation between the effective internal dose of acrylamide and glycidamide. This means that the relative proportion of glycidamide adducts is decreasing with an increasing burden to acrylamide. Consequently, an elevated internal exposure to acrylamide is associated with a lower oxidative metabolism of acrylamide. Apart from a saturation of the enzyme systems involved in the metabolic activation of acrylamide (CYP 2E1), an influence of individual susceptibility can also be discussed. A comparison of the data obtained in this work with the results of animal experiments on rodents shows that the activation of acrylamide to its genotoxic metabolite glycidamide in humans occurs to a similar extent as in rats. Thus, one may assume that the risk assessments based on animal experiments in rats reflect the cancer risk of acrylamide for humans in an adequate way. urthermore, a procedure for the preparation of isotopically labelled internal standards for the accurate quantification of the mentioned adducts was developed within the scope of this work. This procedure will be of great practical value for the further development of the analysis of hemoglobin adducts, especially regarding the comparability of the results obtained. As a last step, the transfer of the developed method to a GC/MS/MS-system and the introduction of the newly synthesized internal standards finally increased the specifity, sensitivity and applicability for routine use of the method presented in this work.

143 Anhang Anhang Massenspektren und Zerfallsschemata der Analyten EI-Massenspektrum N-2-Ethoxyethylvalin-Pentafluorphenylthiohydantoin (ISTD) Elektronenstossionisation (70 ev) Abun dance m/z-- > ragmentierungsschema H 3 C H 3 C H 3 C N CH 3 N S N Mc-Lafferty-Uml. S N + H 2 C m/z = 396 m/z = 363 N S N m/z = 308

144 Anhang 133 Massenspektrum N-2-Cyanoethylvalin-Pentafluorphenylthiohydantoin (CEV) Elektronenstossionisation (70 ev) Abund ance m/z--> ragmentierungsschema N C H 3 C +. N C +. N CH 3 N S N Mc-Lafferty-Uml. S N m/z = 377 m/z = 335

145 Anhang 134 Massenspektrum N-2-Carbamoylethylvalin-Pentafluorphenylthiohydantoin (AAV) Elektronenstossionisation (70 ev) A bundance m/z--> ragmentierungsschema H 2 N C H 3 C +. + C H 3 C N CH 3 N CH 3 S N S N m/z = 395 m/z = 378

146 Anhang 135 Massenspektrum N-(2,2-dimethyl-4-oxazolidinonylmethylvalin)-Pentafluorphenylthio- (70 hydantoin (GAV, acetonisiert) Elektronenstossionisation ev) Abundance m/z--> ragmentierungsschema H 3 H 3 C C NH * N H 3 C CH 3 +. HN N H 3 C CH 3 + S N S N m/z = 451 m/z = 394

147 Anhang 136 Massenspektrum N-2-Carbamoyl-2-acetoxyethylvalin-Pentafluorphenylthiohydantoin (GAV, acetyliert) Elektronenstossionisation (70 ev) A bundance m/z--> ragmentierungsschema H 3 C H 2 N * S H 3 C N N CH 3 +. H 3 C C * S H 3 C N N CH 3 + m/z = 453 m/z = 436

148 Anhang 137 Massenspektrum d-3-n-2-cyanoethylvalin-pentafluorphenylthiohydantoin (d 3 -CEV) Elektronenstossionisation (70 ev) A bundance m/z--> ragmentierungsschema N C D D S H 3 C D N N CH 3 +. Mc-Lafferty-Uml. N C D D S D N N +. m/z = 380 m/z = 338

149 Anhang 138 Massenspektrum d-3-n-2-carbamoylethylvalin-pentafluorphenylthiohydantoin (d 3 -AAV) Elektronenstossionisation (70 ev) Abundance m/z- -> ragmentierungsschema H 2 N D H 3 C D C CH 3 N D S N +. + D H 3 C D C CH 3 N D S N m/z = 398 m/z = 381

150 Anhang 139 Massenspektrum N-2-Cyanoethylvalin-Pentafluorphenylthiohydantoin (CEV) Negative Chemische Ionisation (207 ev) mit Methan als Reaktandgas Abundance m/z--> 0 ragmentierungsschema N C H 3 C -. N C H 3 C -. S N N CH 3 -H S N N CH 3 m/z = 377 m/z = 357 N C -C H 3 C - N C H 3 C - N CH 3 N CH 3 S N -H S N m/z = 349 m/z = 329

151 Anhang 140 Tochterionenspektrum für N-2-Cyanoethylvalin-Pentafluorphenylthiohydantoin (CEV) Negative Chemische Ionisation (70 ev) mit Methan als Reaktandgas Mutterion (Q1): m/z=357; Kollisionsenergie (Q2): 10 ev; Argon-Druck ~ 2mTorr Spectrum 1A Plot BP 284 (2,987e+7=100%) scan drarbeit_ xms min. Scan: 789 Channel: 1 Ion: NA RIC: 7,707e+7 100% % 80% 70% 60% 50% % 30% 20% 10% m/z

152 Anhang 141 Massenspektrum N-2-Carbamoylethylvalin-Pentafluorphenylthiohydantoin (AAV) Negative Chemische Ionisation (207 ev) mit Methan als Reaktandgas Abu ndance m/z--> ragmentierungsschema H 2 N C N H 3 C CH H 3 C H 2 N CH 3 N S N -H S N m/z = 395 m/z = 375

153 Anhang 142 Tochterionenspektrum für N-2-Carbamoylethylvalin-Pentafluorphenylthiohydantoin (AAV) Negative Chemische Ionisation (70 ev) mit Methan als Reaktandgas Mutterion (Q1): m/z=375; Kollisionsenergie (Q2): 10 ev; Argon-Druck ~ 2mTorr 100% Spectrum 1A Plot min. Scan: 1586 Channel: 1 Ion: NA RIC: 1,687e+8 BP 284 (4,231e+7=100%) scan drarbeit_ xms % 50 % % % m/z

154 Anhang 143 Massenspektrum N-(2,2-dimethyl-4-oxazolidinonylmethylvalin)-Pentafluorphenylthiohydantoin (GAV, acetonisiert) Negative Chemische Ionisation (207 ev) mit Methan als Reaktandgas Abundance m/z--> ragmentierungsschema H 3 H 3 C C NH * N H 3 C CH 3 -. H 3 H 3 C C NH * N H 3 C CH 3 -. S N -H S N m/z = 451 m/z = 431

155 Anhang 144 Tochterionenspektrum für N-(2,2-dimethyl-4-oxazolidinonylmethylvalin)-Pentafluorphenylthiohydantoin (GAV, acetonisiert) Negative Chemische Ionisation (70 ev) mit Methan als Reaktandgas Mutterion (Q1): m/z=431; Kollisionsenergie (Q2): 10 ev; Argon-Druck ~ 2mTorr Spectrum 1A Plot min. Scan: 1822 Channel: 3 Ion: NA RIC: 3,643e+7 BP 303 (1,783e+7=100%) scan drarbeit_ xms 100 % % 50 % 25% 0 % m/z

156 Anhang Einzelergebnisse der Untersuchungen Biochemisches Effekt-Monitoring in der Allgemeinbevölkerung a) Nichtraucher Nr. Alter Zig./Tag CEV AAV pmol/g µg/l Blut pmol/g µg/l Blut Globin Globin Ger-03 M 45 0 < 4 < 0,1 15 0,4 Ger-05 M 59 0 < 4 < 0,1 < 12 < 0,3 Ger-06 M 39 0 < 4 < 0,1 21 0,6 Ger-07 M 36 0 < 4 < 0,1 47 1,3 Ger-12 M 27 0 < 4 < 0,1 < 12 < 0,3 Ger-13 M 52 0 < 4 < 0,1 12 0,3 Ger-25 M 30 0 < 4 < 0,1 27 0,7 Ger-36 W 54 0 < 4 < 0,1 25 0,7 Ger-38 M 36 0 < 4 < 0,1 30 0,8 Ger-39 M 50 0 < 4 < 0,1 30 0,8 Ger-53 M 21 0 < 4 < 0,1 43 1,2 Ger-57 W 28 0 < 4 < 0,1 20 0,5 Ger-59 M 35 0 < 4 < 0,1 24 0,7 Ger-60 M 53 0 < 4 < 0,1 50 1,4 Ger-61 M 37 0 < 4 < 0,1 12 0,3 Ger-63 M 50 0 < 4 < 0,1 22 0,6 Ger-65 M 33 0 < 4 < 0,1 14 0,4 Ger-67 M 47 0 < 4 < 0,1 20 0,5 Ger-70 W 48 0 < 4 < 0,1 27 0,7 Ger-71 M 32 0 < 4 < 0,1 21 0,6 BR M 29 0 < 4 < 0,1 17 0,5 JM M 39 0 < 4 < 0,1 32 0,9 JA M 59 0 < 4 < 0,1 16 0,4 MG M 27 0 < 4 < 0,1 24 0,6 WS M 33 0 < 4 < 0,1 16 0,4

157 Anhang 146 b) Raucher Nr. Alter Zig./Tag CEV AAV Eigene pmol/g µg/l Blut pmol/g µg/l Blut Angabe Globin Globin Ger-01 M ,2 88 2,4 G er-02 M ,0 85 2,3 Ger-08 M ,4 76 2,1 Ger-11 M ,8 85 2,3 Ger-15 M , ,6 Ger-16 M ,0 69 1,9 Ger-17 W ,3 66 1,8 Ger-19 M ,3 88 2,4 Ger-20 M ,6 16 0,4 Ger-21 M ,3 78 2,1 Ger-22 M ,2 80 2,2 Ger-23 M , ,0 Ger-26 M , ,9 Ger-27 M , ,2 Ger-28 M ,8 87 2,4 Ger-29 M , ,0 Ger-30 M ,8 36 1,0 Ger-32 M , ,4 Ger-33 M ,4 85 2,3 Ger-34 M , ,6 Ger-37 M , ,9 Ger-40 M ,6 50 1,3 Ger-42 M ,6 33 0,9 Ger-44 M ,4 52 1,4 G er-45 M , ,0 Ger-46 M , ,8 Ger-48 M ,3 36 1,0 G er-49 M , ,2 G er-50 M , ,8 Ger-51 M ,6 90 2,4 Ger-52 W , ,0 Ger-54 M ,5 60 1,6 Ger-55 M , ,0 Ger-58 M , ,5 Ger-62 M , ,4 Ger-66 M ,7 67 1,8 Ger-68 W , ,8 Ger-69 W , ,4 Ger-31 M 42 k.a. 71 1,8 22 0,6 Ger-35 M ,4 13 0,4 Ger-41 M ,3 29 0,8 Ger-56 M ,2 23 0,6 TS M ,3 30 0,8

158 Anhang 147 Nr. Alter Zig./Tag CEV AAV PS W ,5 26 0,7 HK M ,8 35 1,0 SK W 36 k.a. 48 1,2 49 1,3 TW M ,1 90 2,4

159 Anhang Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut belasteter Arbeiter sowie der Allgemeinbevölkerung a) Belastete Arbeiter Nr. Alter Zig./Tag CEV AAV GAV pmol/g Globin µg/l Blut pmol/g Globin µg/l Blut pmol/g Globin µg/l Blut R-3892 M 29 k. Angabe , , ,7 R-3893 M 24 k. Angabe 243 6, , ,0 R-3894 M 28 k. Angabe 121 3, ,5 80 2,3 R-3895 M 39 k. Angabe 54 1,4 28 0,8 19 0,6 R-3896 M 47 k. Angabe 256 6, , ,2 R-3897 M 34 k. Angabe 17 0,4 63 1,7 37 1,1 R-8742 M 32 k. Angabe 248 6, ,1 70 2,0 R-8743 M 29 k. Angabe , , ,3 R-8744 M 24 k. Angabe 277 6, , ,0 R-8745 M 47 k. Angabe 239 6, , ,8 R-8746 M 39 k. Angabe 196 4, ,2 92 2,7 R-9757 M 18 k. Angabe 171 4, , ,8 R-9758 M 33 k. Angabe 192 4,8 87 2,4 42 1,2 R-9759 M 30 k. Angabe , , ,2 R-9760 M 25 k. Angabe 383 9, , ,7 R-9761 M 24 k. Angabe 125 3, , ,0 R-9762 M 48 k. Angabe 246 6, , ,9

160 Anhang 149 b) Raucher der Allgemeinbevölkerung Nr. Alter Zig./Tag CEV AAV GAV pmol/g Globin µg/l Blut pmol/g Globin µg/l Blut pmol/g Globin µg/l Blut K-10 M , , ,5 K-11 W ,7 32 0,9 31 0,9 K-13 M ,2 82 2,2 33 1,0 K-16 W ,5 84 2,3 55 1,6 K-19 M , ,8 78 2,3 K-22 W , ,8 79 2,3 K-27 M , , , W ,1 45 1,2 28 0,8 701 W ,6 41 1,1 25 0, W ,0 35 0,9 47 1, W ,7 42 1,2 32 0, W ,4 49 1,3 46 1,3 901 W ,9 25 0,7 22 0,7 759 W ,3 94 2,6 40 1, W ,5 96 2,6 66 1, W 16 k. Angabe 119 3,0 86 2,3 43 1,2

161 Anhang 150 c) Nichtraucher der Allgemeinbevölkerung Nr. Alter Zig./Tag CEV AAV GAV pmol/g Globin µg/l Blut pmol/g Globin µg/l Blut pmol/ g Globin µg/l Blut 1103 W 21 0 < 4 < 0,1 18 0, , W 51 0 < 4 < 0,1 31 0, , W 45 0 < 4 < 0,1 25 0, , W 62 0 < 4 < 0,1 14 0, , W 20 0 < 4 < 0,1 18 0, 5 9 0, M 39 0 < 4 < 0,1 29 0, , W 28 0 < 4 < 0,1 17 0, , W 32 0 < 4 < 0,1 10 0, , W 53 0 < 4 < 0,1 7 0, , M 47 0 < 4 < 0,1 18 0, , W 33 0 < 4 < 0,1 24 0, , M 45 0 < 4 < 0,1 21 0, , W 34 0 < 4 < 0,1 20 0, ,7

162 Literatur Literatur 1 Ang erer, J.: Das Biological Mo nitoring in der Arbeits - und Umweltmedizin derzeitiger Stand und künftige Entwicklungen. In: Angerer J., Eds. : Biological Monitoring Heutige und künftige Möglichkeiten in d er Arbeits- und Umweltmedizin. Wiley-VCH, Weinheim Deutsche orschungsgemeinsc haft (DG): Maximale Arbeitsplatzkonzentration en und biologische Arbeitsstoff Toleranzwerte Mitteilung XXXX der Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeits stoffe. VCH, We inheim. 3 Techni sche Regeln für Gefahrstoffe (TR GS) : TRGS 903: Biologische Arbeitsstofftoleranzwerte, Ausgabe April 2001, zule tzt geändert: BArbBl. Heft 5/2004. Im Internet erhältlich unter: ww.baua.d e/prax/ags/trg s903.htm 4 Ehrenberg L., Hiesche K.D., sterman-golkar S., Wenneberg I.: Evaluation of genetic risks of alkylating agents: tissue doses of the mouse from air contaminated with ethylene oxide. Mutat Res 24 (2): (1974). 5 Eide I., Hagemann R., Zahlsen K., Tareke E., Törnqvist M., Kumar R., Vodicka P., Hemminki K.: Uptake, distribution and formation of hemoglobin and DNA adducts after inhalation of C 2 -C 8 -alkenes in the rat. Carcinogenesis 16: (1993). 6 Kautiainen A., Vaca C.E., Granath.: Studies on the relationship between hemoglobin and DNA adducts of malondialdehyde and their stability in vivo. Carcinogenesis 14: (1993). 7 Walker V.E., ennell T.R., Upton P.B., MacNeela J.P., Swenberg J.A.: Molecular dosimetry of DNA and hemoglobin adducts in mice and rats exposed to ethylene oxide. Environ Health Perspect 99: (1993). 8 sterman-golkar S., Czene K., Lee M.S., aller T.H., Csanady G.A., Kessler W., Perez H.L., ilser J.G., Segerbäck D.: Dosimetry by means of DNA and hemoglobin adducts in propylene-oxide exposed rats. Toxicol Appl Pharmacol 191 (3): (2003). 9 Li H., Wang H., Sun H., Liu Y., Liu K., Peng S.: Binding of nitrobenzene to hepatic DNA and hemoglobin at low doses in mice. Toxicol Letters 139 (1): (2003). 10 Czene K., sterman-golkar S., Yun X., Li G., Zhao., Licea-Perez H., Li M., Natarajan A.T., Segerbäck D.: Analysis of DNA and hemoglobin adducts and sister chromatid exchange in a human

163 Literatur 152 population occupationally exposed to propylene oxide: a pilot study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 11: (2002). 1 1 Ehrenberg L., Moustacchi E., sterman-golkar S., Ekman G.: Dosimetry of genotoxic agents and dose-response relationships of their effects. Mutat Res 123: (1993). 12 Stryer L.: Biochemie. 4. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg 1991, S Protein Data Bank: Human Hemoglobin A. erhältlich unter: 14 Bishop C., Surgenor D.M.: The red blood cell. Academic Press, New York (1964). 15 Lurie S., Mamet Y.: Red blood cell survival and kinetics during pregnancy. Eur J bstet Gyn R B 93: (2000). 16 Törnqvist M., red C., Haglund J., Helleberg H., Paulsson B., Rydberg P.: Protein adducts: quantitative and qualitative aspects of their formation, analysis and applications. J Chromatogr B 778 (1-2): (2002). 17 Boogaard P.J.: Use of haemoglobin adducts in exposure monitoring and risk assessment. J Chromatogr B 778 (1-2): (2002). 1 8 Neumann H.G.: Von der Chemie zur Toxikologie ein persönlicher Rückblick. Umweltmed orsch Prax 9 (1): (2004). 1 9 Neumann H.G., Birner G., Kowallik P., Schütze D., Zwirner-Baier I.: Hemoglobin adducts of N- substituted aryl compounds in exposure control and risk assessment. Environm Health Perspect 99: (1993). 20 Törnqvist M., Mowrer J., Jensen S., Ehrenberg L.: Monitoring of environmental cancer initiators through hemoglobin adducts by a modified Edman degradation method. Anal Biochem 154: (1986). 21 Bader M., Lewalter J., Angerer J.: Analysis of N-alkylated amino acids in human hemoglobin: evidence for elevated N-Methylvaline levels in smokers. Int Arch ccup Environ Health 67: (1995).

164 Literatur Törnqvist M., Svartengren M., Ericsson C.H.: Methylation in haemoglobin from monozygotic twins discordant for cigarette smoking: hereditary and tobacco-related factors. Chem Biol Interact 82: (1992). 23 Bailey E., Brooks A.G., Dollery C.T., armer P.B., Passingham B.J., Sleightholm M.A., Yates D.W.: Hydroxyethylvaline adduct formation in haemoglobin as a biological monitor of cigarette smoke intake. Arch Toxicol 62: (1988). 24 ennell T.R., MacNeela J.P., Morris R.W., Watson M., Thompson C.L., Bell D.A.: Hemoglobin adducts from acrylonitrile and ethylene oxide in cigarette smokers: effect of glutathione-stransferase T1-Null and M1-Null genotypes. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 9: (2000). 25 Bergmark E.: Hemoglobin adducts of acrylamide and acrylonitrile in laboratory workers, smokers and non-smokers. Chem Res Toxicol 10: (1997). 26 Perez H.L., Segerbäck D., stermann-golkar S.: Adducts of acrylonitrile with haemoglobin in nonsmokers and participants in a smoking cessation program. Chem Res Toxicol 12 (10): (1999) 27 Bolt H.M.: Quantification of endogenous carcinogens the ethylene oxide paradox. Biochem Pharmacol 52: 1 5 (1996). 28 Hoffmann D., Hoffmann I., El-Bayoumy K.: The less harmful cigarette a controversial issue. Chem Res Toxicol 14 (7): (1997). 29 Tareke E., Rydberg P., Karlsson P., Eriksson S., Törnqvist M.: Acrylamide a cooking carcinogen? Chem Res Toxicol 13: (2000). 30 Tareke E., Rydberg P., Karlsson P., Eriksson S., Törnqvist M.: Analysis of acrylamide, a carcinogen formed in heated foodstuffs. J Agric ood Chem 50: (2002). 31 Neumann H. G., Ewers U.: Die Stellung des biochemischen Effektmonitorings im Konzept des Human-Biomonitorings. Bundesgesundheitsbl Gesundheitsforsch Gesundheitsschutz 46: (2003). 32 European Union Risk Assessment Report: acrylamide. ffice for fficial Publications of the European Communities, 2002, ISBN X. Erhältlich unter:

165 Literatur U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service; National Toxicology Program: 10 th report on carcinogens. erhältlich bei: iehs.nih.gov/roc/ninth/rahc/acrylamide.pdf 34 Beratergremium für umweltrelevante Altstoffe der GdCh: BUA-Stoffbericht 103: Acrylamid. S. Hirzel Verlag (1993) ISBN Godin A.C., Bengtsson B., Niskanen R., Tareke E., Törnqvist M., orslund K.: Acrylamide and N- methylolacrylamide poisoning in a herd of Charolais crossbreed cattle. Vet Rec 151 (24): (2002). 36 Acrylamidgehalte in Lebensmitteln, sortiert nach Warengruppen. Präsentation des Bundesamtes für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit vom Im Internet erhältlich unter: Materialien und Links zu Acrylamid in Lebensmitteln. 37 Madle S., Broschinski L., Mosbach-Schulz., Schöning G., Schulte A.: Zur aktuellen Risikobewertung von Acrylamid in Lebensmitteln. Bundesgesundheitsbl Gesundheitsforsch Gesundheitsschutz 46: (2003).. 38 WH (2002): Health implications of acrylamide in food. Report of a Joint A/WH consultation, WH headquaters, Geneva, Switzerland June Im Internet verfügbar unter: ide_report.pdf 39 Smith C.J., Perfetti T.A., Rumple M.A., Rodgman A., Doolittle D.J.: IARC Group 2A Carcionogens reported in cigarette mainstream smoke. ood Chem Toxicol 38: (2000). 40 Van Landingham C.B., Lawrence G.A., Shipp A.M.: Estimates of lifetime-absorbed daily doses from the use of personal-care products containing polyacrylamide: a monte-carlo analysis. Risk Anal 24 (3): (2004). 41 Mottram D.S., Wedzicha B.L., Dodson A.T.: Acrylamide is formed in the maillard reaction. Nature 419: 448 (2002). 42 Stadler R.H., Blank I., Varga H., Robert., Hau J., Guy P.A., Robert M.C., Riediker S.: Acrylamide from Maillard reaction products. Nature 419: 449 (2002). 43 BMVEL: Acrylamid wie sie sich und ihre amilie schützen können. Broschüre des Bundesministeriums für Verbraucherschutz, Ernährung und Landwirtschaft, herausgegeben vom

166 Literatur 155 aid-infodienst (Stand Dezember 2002). Im Internet erhältlich unter: unter Lebensmittelsicherheit 44 Yaylayan V.A., Wnorowski A., Perez-Locas C.: Why Asparagine needs carbohydrates to generate acrylamide. J Agric ood Chem 51: (2003). 45 Zyzak D.H., Sanders R.A., Stojanovic M., Tallmadge D.H., Eberhart B.L., Ewald D.K., Gruber D.C., Morsch T.R., Strothers M.A., Rizzi G.P., Villagran M.D.: Acrylamide formation mechanism in heated foods. J Agric ood Chem 51: (2003). 46 Granvogel M., Jezussek M., Koehler P., Schieberle P.: Quantitation of 3-aminopropionamide in potatoes a minor, but potent precursor in acrylamide formation. J Agric ood Chem 52: (2004). 47 DG (Deutsche orschungsgemeinschaft): Arbeitsmedizinisch-toxikologische Begründungen für BAT-Werte VCH, Weinheim. 48 Calleman C.J.: The metabolism and pharmacokinetics of acrylamide: implications for mechanisms of toxicity and human risk estimation. Drug Metabolism Rev 28 (4): (1996). 49 Sumner S.C.J., Selvaraj L., Nauhaus S.K., ennell T.R.: Urinary metabolites from 344 rats and B6C31 mice coadministered acrylamide and acrylonitrile for 1 or 5 days. Chem Res Tox 10: (1997). 50 Sumner S.C.J., ennell T.R., Moore T.A., Chanas B., Gonzalez., Ghanayem B.I.: Role of cytochrome P450 2E1 in the metabolism of acrylamide and acrylonitrile in mice. Chem Res Tox 12: (1999). 51 Twaddle N.C., McDaniel L. P., Gamboa DaCosta G., Churchwell M.I., Beland.A., Doerge D.R. Determination of acrylamide and glycidamide serum toxicokinetics in B6C3 1 -mice using LC/ES/MS/MS. Cancer Letters 207: 9 17 (2004). 52 Segerbäck D., Calleman C.J., Schroeder J.L., Costa L.G., austman E.M.: ormation of N 7 -(2- carbamoyl-2-hydroxyethyl)guanine in DNA of the mouse and the rat following intraperitoneal administration of 14 C-acrylamide. Carcinogenesis 16 (5): (1995). 53 Da Costa, G.G., Churchwell, M.I., Hamilton, L.P., von Tungeln, L.S., Beland,.A., Marques, M.M., Doerge, D.R.: DNA adduct formation from acrylamide via conversion to glycidamide in adult and neonatal mice. Chem Res Toxicol 16 (10): (2003).

167 Literatur Solomon J.J., edyk J., Mukai., Segal A. Direkt alkylation of 2 -deoxynucleosides and DNA following in vitro reaction with acrylamide. Cancer Res 45 (8): (1985). 55 Doerge D.R., da Costa G.G., McDaniel L.P., Churchwell M.I., Twaddle N.C., Beland.A.: DNA adducts from administration of acrylamide and glycidamide to mice and rats. Mutat Res 580 (1-2): (2005). 56 Paulsson B., Grawe J., Törnqvist M.: Hemoglobin adducts and micronucleus frequencies in mouse and rat after acrylamide of N-methylolacrylamide treatment. Mutat Res 516 (1-2): (2002). 57 ennell T.R., Snyder R.W., Krol W.L., Sumner S.C.: Comparison of the haemoglobin adducts formed by administration of N-methylolacrylamide and acrylamide to rats. Toxicol Sci 71 (2): (2003). 58 Callemann C.J., Wu Y., He., Tian G., Bergmark E., Zhang S., Deng H.: Relationship between biomarkers of exposure and neurological effects in a group of workers exposed to acrylamide. Toxicol Appl Pharmacol 126 (2): (1994). 59 Hagmar L, Törnqvist M, Nordander C, Rosen I, Bruze M, Kautiainen A, Magnusson A, Malmberg B, Aprea P, Granath, Axmon A. Health effects of occupational exposure to acrylamide using hemoglobin adducts as biomarkers of internal dose. Scand J Work Environ Health 27 (4): (2001). 60 Besaratinia A., Pfeiffer G.P.: Weak yet distinct mutagenicity of acrylamide in mammalian cells. J Natl Cancer Inst 95 (12): (2003). 61 Besaratinia A., Pfeifer G.P.: Genotoxicity of acrylamide and glycidamide. J Natl Cancer Inst 95 (13): (2004). 62 Sega G.A., Generoso E.E., Brimer P.A.: Acrylamide exposure induces a delayed unscheduled DNA synthesis in germ cells of male mice that is correlated with the temporal pattern of adduct formation in testis DNA. Env Mol Mutagen 16: (1990). 63 Holland N., Ahlborn T., Turteltaub K., Markee C., Moore D., Wyrobek A.J,. Smith M.T.: Acrylamid causes preimplantation abnormalities in embryos and induces chromatin-adducts in male germ cells of mice. Reprod Toxicol 13 (3): (1999). 64 U.S. EPA (1990): Assessment of health risks from exposure to acrylamide; ffice of Toxic Substances; Ed.: U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC.

168 Literatur Marsh G.M., Lucas L.J., Youk A.., Schall L.C.: Mortality patterns among workers exposed to acrylamide: 1994 follow up. ccup Environ Med 56: (1999). 66 Mucci L.A., Dickman P.W., Steineck G., Adami H.., Augustsson K.: Dietary acrylamide and cancer of the large bowel, kidney and bladder: absence of an association in a population-based study in Sweden. Br J Cancer 88 (1): (2003). 67 Pelucchi C., rancheschi S., Levi., Trichopoulis D., Borsetti C., Negri E., LaVecchia C.: ried potatoes and human cancer. Int J Cancer 105 (4): (2003). 68 Mucci L.A., Lindblad P., Steineck G., Adami H..: Dietary acrylamide and risk of renal cell cancer. Int J Cancer 109 (5): (2004) IARC (1994): Acrylamide. IARC Monograph Eval Carcinog Risks Hum 60, European Union Risk Assessment Report: Acrylonitrile. ffice for fficial Publications of the European Communities, Erhältlich unter: 71 Bedarfsgegenständeverordnung in der assung der Bekanntmachung vom 23.Dezember 1997 (BGBl I S. 5), zuletzt geändert durch 8. ÄndV der BedarfsgegenständeV v (BGBl. I S. 1886) 72 Leonard A., Gerber G.B., Stecca C., Rueff J., Borba H., armer P.B., Sram R.J., Czeizel A.E., Kalina I.: Mutagenicity, carcinogenicity and teratogenicity of acrylonitrile. Mutat Res 436: (1999). 73 Thier R., Lewalter J., Bolt H.M.: Species differences in acrylonitrile metabolism and toxicity between experimental animals and humans based on observations in human accidental poisonings. Arch Toxicol 74: (2000). 74 Leng G., Lewalter J.: Polymorphisms of glutathione-s-transferases and susceptibility to acrylonitrile and dimethylsulfate in cases of intoxication. Toxicol Letters 134: (2002). 75 Collins J.J., Acquavella J..: Review and meta-analysis of studies of acrylonitrile workers. Scand J Work Environ Health 24 (Suppl 2): (1998). 76 IARC: Acrylonitrile. IARC Mongraph Eval Carcinog Risks Hum 71: (1999). 77 van Sittert N.J.: N-2-cyanoethylvaline, N-2-hydroxyethylvaline, N-methylvaline. In: Angerer J., Schaller K.H., Eds.: Analyses of Hazardous Substances in Biological Materials. Wiley-VCH, Weinheim, S (1996).

169 Literatur Bunn H..: Hemoglobin. In: Haeberli, Ed.: Human Protein Data. Verlag Chemie Weinheim Schettgen T., Broding H.C., Angerer J., Drexler H.: Hemoglobin adducts of ethylene oxide, propylene oxide, acrylonitrile and acrylamide biomarkers in occupational and environmental medicine. Toxicol Letters 134: (2002). 80 Bergmark E., Calleman C.J., He., Costa L.G.: Hemoglobin adducts in humans occupationally exposed to acrylamide. Toxicol Appl Pharmacol 120: (1993). 81 WH. Guidelines for drinking-water quality, 2 nd ed., Vol. 2. Ed.: World Health rganization, Geneva, Switzerland; S Granath.N., Vaca C.E., Ehrenberg L.G., Törnqvist M.A. Cancer Risk Estimation of genotoxic chemicals based on target dose and a multiplicative model. Risk Anal 19: (1999). 83 Paulsson B., Athanassiadis I., Rydberg P., Törnqvist M.: Hemoglobin adducts from glycidamide: acetonization of hydrophilic groups for reproducible gas chromatography/tandem mass spectrometric analysis. Rapid Commun Mass Spectrom 17: (2003). 84 Rios-Blanco M.N., Ranasinghe A., Upton P., Lee M.S., ilser J.G., Swenberg J.A. Exposure dependent accumulation of N-(2-hydroxypropyl)valine in hemoglobin of 344 rats exposed to propylene oxide by the inhalation route. J Chromatogr B 2002, 778 (1-2): (2002). 85 Calleman C.J., Stern L.G., Bergmark E., Costa L.G.: Linear versus nonlinear models for haemoglobin adduct formation by acrylamide and its metabolite glycidamide: implications for risk estimation. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1: (1992). 86 Bolt, H.M., Roos, P.H., Thier, R.: The cytochrome P 450 isoenzyme CYP 2E1 in the biological processing of industrial chemicals: consequences for occupational and environmental medicine. Int Arch ccup Environ Health 76, (2003). 87 Rice, J.M.: The carcinogenicity of acrylamide. Mutat Res 580 (1-2): 3 20 (2005). 88 Ko Y., Brüning T.: Kurzvorschriften Realtime-PCR (Genotypisierungen: CYP1A1 IVA, CYP1A1 Msp I, CYP2E1 Rsa I, GSTM1 und GSTT1; GSTP1). In: J. Angerer und M. Müller (eds.) Analysen in biologischem Material, 16. Lieferung. Wiley-VCH (2004).

170 Literatur Perez H.L., Cheong H.K., Yang J.S., sterman-golkar S.: Simultaneous analysis of hemoglobin adducts of acrylamide and glycidamide by gas-chromatography mass spectrometry. Anal Biochem 274: (1999). 90 Twaddle N.C., Churchwell M.I., McDaniel P., Doerge D.R.: Autoclave sterilization produces acrylamide in rodent diets: implications for toxicity testing. J Agric ood Chem 52 (13): (2004). 91 BfR-Pressemitteilung vom 01. September 2004, im Internet erhältlich unter

171 Tabellarischer Lebenslauf Name: Thomas Schettgen Geburtsdatum: Geburtsort: Saarlouis Staatsangehörigkeit: deutsch amilienstand: ledig Schulausbildung Besuch der Prof. Ecker-Grundschule Saarlouis Besuch des Robert-Schuman-Gymnasiums Saarlouis Juni 1991 Abiturprüfung (Gesamtnote: 2,1 ) Grundwehrdienst Juli 1991 Juli 1992 LLVersKp 260, Merzig beruflicher Werdegang September 1992 ktober 1994 März 1997 ktober 1997 ktober 1998 November 1998 ebruar 1999 Seit April 2004 Immatrikulation im ach Lebensmittelchemie an der Universität Kaiserslautern Staatliche Vorprüfung 1. Staatsprüfung Lebensmittelchemie Praktikum am Chem. Untersuchungsamt Trier 2. Staatsprüfung Lebensmittelchemie (Gesamtnote: Sehr gut ) Anstellung als wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut und Poliklinik für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin der Universität Erlangen-Nürnberg und Beginn der Promotion unter der Leitung von Prof. Dr. J. Angerer (Arbeitsmedizinische Toxikologie) und Prof. Dr. M. Pischetsrieder (Lebensmittelchemie) wiss. Sekretär der Arbeitsgruppe Analysen in biologischem Material der DG-Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe