Anatomie und Morphologie der Pflanzen. 3. Kurstag. Einführung in das Mikroskopieren

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1 Anatomie und Morphologie der Pflanzen 3. Kurstag Einführung in das Mikroskopieren 1

2 - Das Mikroskop - Anfertigen von Schnitten und Färbetechniken - Zelluläre Zeichnung - Übersichtszeichnung 2

3 Zum 3. Kurstag: Bitte lesen Sie die folgenden Dateien im Internet unter: Lehrstuhl Pflanzenphysiologie / Lehre / 20102: Übung: Übungen Allgemeine Pflanzenwissenschaften (Anatomie- u. Morphologie der Pflanzen) (Passwort A-Kurs 09): Chemikalien-Datenblätter Färbungen 3. Kurstag Anleitung zum Zeichnen 3

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5 Das Mikroskop Auflösungsvermögen: das Vermögen zwei Punkte getrennt von einander wahrzunehmen Das Auflösungsvermögen des menschlichen Auges ist begrenzt auf ca µm die Dicke eines menschlichen Haares Warum? Der Sehwinkel ist zu klein! maximal 30 Um zwei dicht nebeneinanderliegenden Punkte distinkt wahrnehmen zu können, muss der Sehwinkel mindestens eine Bogenminute betragen Wenn der Winkel kleiner ist, kann zwischen den Punkten nicht unterschieden werden aus: Wanner: Mikroskopisch- Botanisches Praktikum Der Sehwinkel muss dann vergrößert werden 5

6 Beim Ausnützen des maximalen Sehwinkels ist gute Auflösung möglich Bei geringen Sehwinkeln ist die Auflösung schlechter Bei Sehwinkel < 1 keine Auflösung! Der Sehwinkel könnte vergrößert werden, wenn das Objekt näher zum Auge ist Das Auge kann aber Objekte nur bis zu einer Entfernung von ca. 25 cm akkomodieren nach: Wanner: Mikroskopisch- Botanisches Praktikum 6

7 Der Sehwinkel kann durch die Verwendung einer Lupe vergrößert werden Gesehene Größe ( eine Entfernung von 25 cm) Originalgröße nach: Wanner: Mikroskopisch-Botanisches Praktikum Vergrößerungen bis 5-10 x gebräuchlich: Sehwinkel 5-10 x vergrößert Auflösung 5-20 µm 7

8 Das Mikroskop bringt eine erhebliche Verbesserung des Sehwinkels: Multiplikation der Vergrößerungen! Gesehene Größe Originalgröße Virtuelles Zwischenbild Okular Objektiv Vergrößerungen von > 400 x möglich nach: Wanner: Mikroskopisch-Botanisches Praktikum 8

9 Das Mikroskop Vergrößerung = Okular x Objektiv Auge, sieht Bild direkt Okular Objektive Objekt Lichtstrahl Kondensor Blende Lichtquelle 9

10 Zusätzliche Möglichkeit, das Auflösungsvermögen (Sehwinkel) mit einem Mikroskop zu verbessern Das Auflösungsvermögen (d) des Objektivs hängt von der numerische Apertur ab: d = λ 2 n x sin α n = Brechungsindex des Mediums zwischen Objekt und Objektiv α = halber Öffnungswinkel des Objektivs numerische Apertur = n x sin α Die numerische Apertur ist ein Maß für den Raumwinkel, den ein Objektiv überblickt 10

11 Verwendung von Immersionsöl (hat ein Brechungsindex (n), das an den Brechungsindex von Glas angepasst ist) numerische Apertur = n x sin α n = Brechungsindex des Immersionsmittels α = halber Öffnungswinkel des Objektivs Öffnungswinkel durch Reflexionsverluste kleiner Auflösung schlechter aus: Wanner: Mikroskopisch- Botanisches Praktikum α 1 α 2 α 2 >α 1 Öffnungswinkel durch das Öl größer Auflösung besser Objektiv Luft Immersionsöl Deckglas 11

12 Achtung! Das 100x Objektiv ist ein Ölimmersionsobjektiv: Immersionsöl verwenden! (Objektiv anschließend säubern!) Alle andere Objektive sind Trockenobjektive! α 1 α 2 α 2 >α 1 Öffnungswinkel größer = Auflösung besser Objektiv Luft Immersionsöl Deckglas 12

13 Das Mikroskop Wie bekomme ich ein gutes Bild? 1. Belichtung und Aperturblende auf mittlere Einstellung 2. Präparat (Objekträger, Objekt, Deckgläschen) anfertigen und unter das Mikroskop legen 3. Objektiv mit geringster Vergrößerung wählen 4. Präparat mit dem Grobtrieb scharf stellen 5. Wechseln zu Objektiven stärkerer Vergrößerung (Abstand Präparat Objektiv!) 6. evtl. Präparat mit Feintrieb scharf stellen 7. Ggf. Optimierung des Bildes durch Variation der Lichtintensität, des Kondensors (optimale Ausleuchtung des Bildes) und der Aperturblende (Kontrast) 13

14 Die pflanzliche Zelle Mikroskop von Robert Hooke aus: Raven: Biologie der Pflanzen Zeichnung aus seinem Buch Micrographia von 1665 Korkgewebe Zelle (cellula; Kämmerchen) 14

15 Bestandteile der pflanzliche Zelle Cytosol Bestandteile der pflanzlichen Zelle Zellwand Plasmamembran Kernhülle Zellkern Nucleolus Vakuole Mitochondrien Stärkekorn Chloroplast Tonoplast aus: Raven: Biologie der Pflanzen Mittellamelle: wo zwei Zellwände aneinander grenzen 15

16 Kursprogramm Zelluläre Zeichnung der inneren Epidermis einer Zwiebelschuppe 16

17 Lichtmikroskopische Beobachtungen an der inneren Epidermis einer Zwiebelschuppe Zellen langgestreckt und parallel sehr dünne Zellwand Vakuole wandständiger Zellkern keine Interzellularen Nucleolus Zellkern in Seitenansicht Wanddurchbrechungen: Tüpfeln Cytoplasma: dünner Wandbelag aus: Wanner: Mikroskopisch-Botanisches Praktikum Cytoplasma: größere Ansammlung 17

18 Zeichnung der Epidermiszellen 1. - Feststellung der Zellumriss (Mittellamelle) - Größe und Proportionen feststellen 2. - Zellwände zeichnen - evtl. mit Tüpfel (2a) 3. - Cytoplasma - Zellkern - Strukturen beschriften a aus: Wanner: Mikroskopisch-Botanisches Praktikum 18

19 Küchenzwiebel (Allium cepa, Alliaceae) Innere Epidermis einer Zwiebelschuppe Detailzeichnung einer Epidermiszelle in einem Verband 400 x Vergrößerung Praktikumszeichnung! Benachbarte Epidermiszellen Tüpfel Epidermiszelle Vakuole Zellkern Zellwand Nucleolus aus: Wanner: Mikroskopisch- Botanisches Praktikum Mittellamelle Zellwand einer benachbarten Zelle Cytoplasma 19

20 Anfertigen eines mikroskopischen Präparats zu untersuchendes Pflanzenteil zurechtstützen der Schnitt muss möglichst dünn sein Zelle 50 µm 1 mm 20 Zellschichten immer mehrere Schnitte anfertigen aus: Wanner: Mikroskopisch-Botanisches Praktikum 20

21 Anfertigen eines mikroskopischen Präparats Achtung! der Schnitt muss exakt senkrecht zur Ausrichtung des Objektes sein Mit dem zurechtgestützen, zu schneidenden Pflanzenteil: so, nicht so! 21

22 Anfertigen eines mikroskopischen Präparats Mit dem zurechtgestützen, zu schneidenden Pflanzenteil: Färben der Schnitte 22

23 - Phloroglucin/HCl färbt verholzte Zellwände rot Lignin - Safranin färbt verholzte Zellwände rot - Astrablau Färbereagenzien Lignin färbt unverholzte Zellwände blau Cellulose (keine Einlagerungen ) - Sudan III- Glycerin färbt suberinisierte und cutinisierte Zellwände rot-orange Suberin bzw. Cutin 23

24 Färbetechniken - Phloroglucin/HCl färbt verholzte Zellwände rot Lignin Prozedere: - mehrere Schnitte anfertigen - Schnitte sofort ins Wasser - gute (dünne) Schnitte für mehrere Minuten in Phloroglucin Lösung einlegen - Schnitte in separate Schale mit HCl überführen - nach Farbreaktion kurz durch Wasser ziehen, auf Objektträger mit Wassertropfen transferieren 24

25 Färbetechniken - Safranin färbt verholzte Zellwände rot Lignin Achtung! Safranin färbt anfangs alle Zellwände rot nur durch gutes Differenzieren ist eine vernünftige Unterscheidung zwischen verholzt und unverholzt möglich Prozedere: - mehrere Schnitte anfertigen - Schnitte sofort ins Wasser - gute (dünne) Schnitte für ca. eine Minute in Safranin Lösung einlegen - Schnitte mehrmals in Ethanol waschen - nach dem Entfärben (Differenzieren) auf Objektträger mit Wassertropfen transferieren 25

26 Färbetechniken - Astrablau färbt unverholzte Zellwände blau gleichzeitige Färbung mit Safranin möglich Prozedere: - mehrere Schnitte anfertigen - Schnitte sofort ins Wasser Cellulose, ohne Einlagerungen - gute (dünne) Schnitte für mehrere Minuten in Astrablau-Lösung einlegen - Schnitte mehrmals in Ethanol waschen - nach dem Entfärben (Differenzieren) auf Objektträger mit Wassertropfen transferieren 26

27 Färbetechniken - Sudan-III-Gycerin färbt suberinisierte und cutinisierte Zellwände rot-orange Suberin oder Cutin Prozedere: - mehrere Schnitte anfertigen - Schnitte direkt in Sudan-III-Glycerin einlegen - nach Farbreaktion auf Objektträger mit Sudan-III-Glycerin-Tropfen transferieren 27

28 Kursprogramm Anfertigung von Sprossquerschnitten von Mais (Zea mays), oder von einer Grünlilie (Chlorophytum comosum; Blütentrieb) Färbung der Schnitte mit: - Phloroglucin/HCl - Safranin - Astrablau - Sudan-III-Glycerin Anfertigung einer Übersichtszeichnung des Sprossquerschnittes 28

29 Übersichtszeichnung von einem Sprossquerschnitt Mikroskopische Ansicht nach Färbung mit Safranin + Astrablau Übersichtszeichnung aus: Wanner: Mikroskopisch-Botanisches Praktikum Erkennbare Bereiche oder Strukturen; Erkennung z.t. auf Grund von Färbungen 29

30 Kriechender Hahnenfuß: Ranunculus repens (Ranunculaceae) Sprossquerschnitt Übersichtszeichnung 100X Abschlussgewebe (Zellwände färben sich orange mit Sudan III-Glycerin) Name, Datum Sub-Oberflächengewebe (Assimilationsparenchym) (Zellen enthalten Strukturen: Chloroplasten; erscheint grün ohne Färbung; Wände färben sich blau mit Safranin;) Leitbündel (Leitgewebe) Äußerer Teil des Leitbündels (Sklerenchymkappe) (Zellwände färben sich rot mit Phloroglucin/HCl, Safranin) Markhöhle Mittlerer Teil des Leitbündels (Phloem) (Zellwände färben sich blau mit Astrablau) Innerer Teil des Leitbündels (Xylem) (Zellwände färben sich rot mit Phloroglucin-HCl, Safranin,) Grundgewebe (innen: Mark, außen: Rinde) 30 (Zellwände färben sich blau mit Astrablau)

31 Mais (Zea mays, Poaceae) Sprossquerschnitt Übersichtszeichnung 100x Abschlussgewebe (Epidermis) (färbt sich orange mit Sudan-III-Gycerin Suberin) Name, Datum Leitbündel (Leitgewebe) Äußerer Ring von Leitbündelgewebe (Leitbündelscheide) (färbt sich rot mit Safranin und Phloroglucin/HCl Lignin) äußerer Teil des Leitbündels (Phloem) (färbt sich blau mit Astrablau Cellulose, keine Einlagerungen) Auf korrekte Proportionen achten! innerer Teil des Leitbündels (Xylem) (färbt sich rot mit Safranin und Phloroglucin/HCl Lignin) Grundgewebe (Mark) (färbt sich blau mit Astrablau Cellulose, keine Einlagerungen) Sub-Oberflächengewebe (Hypodermis) (färbt sich rot mit Safranin und Phloroglucin/HCl Lignin) 31

32 Grünlilie (Chlorophytum comosum, Agavaceae) Sprossquerschnitt Übersichtszeichnung 100x Sub-Oberflächengewebe (Grundgewebe: Rinde) (färbt sich blau mit Astrablau Cellulose, keine Einlagerungen) Grundgewebe (Mark) (färbt sich blau mit Astrablau Cellulose, keine Einlagerungen) Abschlussgewebe (Epidermis) (färbt sich orange mit Sudan-III-Gycerin Suberin) Leitbündel (Leitgewebe) äußerer Teil des Leitbündels (Phloem) (färbt sich blau mit Astrablau Cellulose, keine Einlagerungen) innerer Teil des Leitbündels (Xylem) (färbt sich rot mit Name, Datum Safranin und Phloroglucin/HCl Lignin) ringförmige Gewebeeinlage (Sklerenchym) (färbt sich rot mit Safranin und Phloroglucin/HCl Lignin) Auf korrekte Proportionen achten! 32

33 Viel Spaß! 33