Man definiert üblicherweise als Vergrößerung (Angular- oder Winkelvergrößerung) eines optischen Instruments das Verhältnis

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1 Versuch O1 MIKROSKOP Seite 1 von 6 Versuch: Mikroskop Anleitung für folgende Studiengänge: Physik, L3 Physik, Biophysik, Meteorologie, Chemie, Biochemie, Geowissenschaften, Informatik Raum: Physik.204 Goethe-Universität Frankfurt am Main Fachbereich Physik Physikalisches Institut Anfängerpraktikum Teil 1 (AP1) Aktualisiert: von C. Krellner 1. Thema In diesem Versuch soll die Funktionsweise eines Mikroskops verdeutlicht werden. Dazu wird die Vergrößerung verschiedener Objektive gemessen, eine Mikroskopskala geeicht und das Auflösungsvermögen des Mikroskops bestimmt. 2. Physikalische Grundlagen Das Mikroskop ist eine Kombination von zwei Linsensystemen (Objektiv und Okular), bei der das stark vergrößerte reelle Zwischenbild eines kleinen, dicht vor der Brennebene eines Objektives aufgestellten Gegenstandes mit einer Lupe, dem Okular betrachtet wird. Der Strahlengang ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 1: Optischer Strahlengang beim Mikroskop. Dabei bedeuten L 1 = Objektiv, F 1 = Brennweite Objektiv, L 2 = Okular, F 2 = Brennweite Okular, G = Gegenstand, B = Reelles Bild, B = Virtuelles Bild, A = Austrittsblende. Man definiert üblicherweise als Vergrößerung (Angular- oder Winkelvergrößerung) eines optischen Instruments das Verhältnis (1) V tanam = tana 0 wobei α der Sehwinkel mit dem optischen Instrument und m α derjenige mit unbewaffnetem Auge ist. Letzterer ist natürlich davon abhängig, aus welcher Entfernung ein Objekt 0 betrachtet wird. Man hat daher zur einheitlichen Bestimmung von α eine Entfernung Ob- 0

2 Versuch O1 MIKROSKOP Seite 2 von 6 jekt Auge von 25 cm festgelegt. Diesen Abstand nennt man Bezugssehweite s. Bei diesem Abstand vermag der Mensch in der Regel noch Gegenstände ohne große Anstrengung scharf zu erkennen. Der Winkel α m und damit die Vergrößerung werden bei einem Mikroskop durch die Brennweiten des Objektivs, des Okulars und die Bildweite des reellen Zwischenbildes festgelegt. Mikroskope sind in der Regel auf einen unendlichen Abstand zwischen Auge und virtuellem Bild des Objektes ausgelegt. Die Vergrößerung wird dadurch unabhängig vom Augenabstand zum Okular. Unter der Gesamtvergrößerung des Mikroskops versteht man das Produkt aus Abbildungsmaßstab des Objektives und Lupenvergrößerung des Okulars. V = B = V V G (2) Okular Objektiv Dabei sind B die Bildgröße, G die Gegenstansgröße, sowie V Okular/Objektiv die entsprechenden Vergrößerungen von Okular und Objektiv Auflösungsvermögen des Mikroskops Das Auflösungsvermögen eines Mikroskops wird nicht allein durch die Qualität der verwendeten Optik bestimmt. Es wird begrenzt durch die Wellenlänge des verwendeten Lichts sowie durch den Winkelbereich der Lichtabstrahlung vom Objekt, der zur Abbildung ausgenutzt wird. Letzteres ist gekennzeichnet durch die numerische Apertur, N, definiert als: (3) N = n sinφ Abbildung 2: Zur Definition der numerischen Apertur. n ist dabei der Brechungsindex des Mediums zwischen Objekt und Objektiv. (In unserem Fall kann n = 1 gesetzt werden.) Für ein Objekt in der Achse des Mikroskops ist ϕ der Winkel zwischen dieser Achse und der Richtung des äußersten Strahles, der gerade noch zur Bildentstehung beiträgt, siehe Abbildung 2. Mit einem Objektiv der numerischen Apertur N lassen sich aufgrund der Beugung des Lichtes gerade noch zwei Striche getrennt erkennen, die einen Abstand g haben, der festgelegt ist durch: (4) g λ =. N Das Auflösungsvermögen des Mikroskops kann somit definiert werden, als der Kehrwert des minimalen Strichabstandes, der gerade noch erkennbar ist: (5) 1 N sinφ g = λ = λ. Dabei ist λ die Wellenlänge des Lichtes, das zur Bildentstehung genutzt wird. Für die Beobachtung mit weißem Licht kann für λ ein mittlerer Wert von 550 nm eingesetzt werden. Vergleicht man die Formeln zum Auflösungsvermögen mit denen zur Beschreibung von Beugungsmustern, dann stellt man fest, dass man zur Auflösung eines bestimmten Abstandes g das Hauptmaximum sowie, im symmetrischen Fall, das erste Nebenmaximum links bzw. rechts vom Hauptmaximum des entsprechenden Beugungsmusters benutzt. Dies korrespondiert mit einer Weglängendifferenz von jeweils einer Wellenlänge λ.

3 Versuch O1 MIKROSKOP Seite 3 von 6 Abbe hat aber schon bemerkt, dass die Auflösung seiner Mikroskope bei schiefer Beleuchtung besser war, was daran liegt, dass das Hauptmaximum zusammen mit nur einem der beiden Nebenmaxima schon genügend Bildinformation enthält. In modernen Mikroskopen wird diese Verdopplung des Auflösungsvermögens durch die sogenannte allseitige schiefe Beleuchtung realisiert. Dementsprechend wird das Auflösungsvermögen bei schiefer Beleuchtung: (6) 1 2 N 2 sinϕ = =. g λ λ schief 3. Aufgabenstellung 1. Bestimmen Sie für die 3 verschiedenen Objektive die Gesamtvergrößerung des Mikroskops und vergleichen Sie mit der Angabe auf den Objektiven. 2. Kalibrieren Sie das Okularmikrometer für die 3 verschiedenen Objektive. Bestimmen Sie dafür die Kalibrierfaktoren für die einzelnen Objektive in µm/skt. 3. Untersuchen Sie das Auflösungsvermögen des Mikroskops für 5 Blendendurchmesser mit Hilfe einer Prüfplatte mit Strichgruppen und vergleichen Sie die mit den theoretisch berechneten Werten nach Formel (6). 4. Bestimmen Sie den Strichabstand der in Teilaufgabe 3 gefundenen Strichgruppen mit dem Okularmikrometer. Wählen Sie dafür ein geeignetes Objektiv und benutzen Sie den in Teilaufgabe 2 bestimmten Kalibrierfaktor. 5. Diskutieren Sie für alle Messungen den Messfehler. 4. Experimenteller Aufbau Bei diesem Versuch wird ein Durchlichtmikroskop mit Binokularansatz, das mit 3 Objektiven ausgestattet ist, verwendet. Abbildung 3: Aufbau des im Praktikum verwendeten Mikroskops.

4 Versuch O1 MIKROSKOP Seite 4 von Bestimmung der Vergrößerung Zur Bestimmung der Vergrößerung wird auf das rechte Okular ein teilverspiegelter Strahlteiler mit Seitenöffnung aufgesetzt. Die 10 cm-skala wird in einer Entfernung von 25 cm zum Strahlteiler neben dessen Seitenöffnung gestellt. Ein, in einem Objektträger aus Plexiglas gefasster, Mikrometer-Maßstab (1 kleiner Teilstrich entspricht 10 µm) wird unter das Objektiv gelegt, die rote Seite des Trägers muss dabei oben sein. Nach Scharfstellen mit Grob- und Feinjustierung bzw. Drehen der 10-cm Skala erscheinen beide beim Blick durch den Strahlteiler aufeinander projiziert und können verglichen werden Längenmessung mit dem Okularmikrometer Bei einem Mikroskop besteht die Möglichkeit, in der Ebene des reellen Zwischenbildes (gerade dort, weil so keine Parallaxe auftritt) ein weiteres Objekt auf einem durchsichtigen Träger aufzubringen, das so mit dem Objekt unter dem Mikroskop verglichen werden kann. Wird dort ein Maßstab angebracht, so kann dieser zur Längenmessung benutzt werden. Ein solcher Maßstab wird als Okularmikrometer bezeichnet. Er lässt sich durch Vergleich mit einem Objekt bekannter Länge unter dem Mikroskop kalibrieren. Das linke Okular im verwendeten Mikroskop enthält ein solches Okularmikrometer, welches im Zuge des Versuches mit Hilfe des Mikrometer-Maßstabs (1 kleiner Teilstrich entspricht 10 µm) geeicht werden soll Auflösungsvermögen Zur Bestimmung des Auflösungsvermögens wird das Okular mit Okularmikrometer sowie das Objektiv mit dem Blendenwechsler benutzt. Da der Abstand Objektebene Blende beim Betrachten eines Objektes konstant bleibt, wird durch eine Blendenverkleinerung der Aperturwinkel ϕ geändert und damit das Auflösungsvermögen verringert. Abbildung 4: Prüfplatte mit Mirengruppen zur Bestimmung des Auflösungsvermögens. Als Objekt wird eine Prüfplatte mit Strichgruppen (sogenannte Mirengruppen) verwendet, die rote Seite der Halterung muss wieder oben sein. Es wird zunächst ein scharfes Bild der Prüfplatte bei maximalem Blendendurchmesser einjustiert. Es soll nun bei jeder der fünf Blenden die jeweils kleinste Strichgruppe ausgewählt werden, bei der man gerade noch die einzelnen Striche getrennt erkennen kann. Die Strichgruppen sind zu diesem Zweck der Größe nach in Hauptgruppen mit jeweils 6 Untergruppen gegliedert. In Abbildung 4 ist eine vergrößerte Version dieses Musters gezeigt. Eine Hauptgruppe (z.b. die Gruppe i = 2 in Abbildung 4) fängt in einer Ecke an mit seinem ersten Element (in dem Fall i, j = 2,1 rechts unten) und geht auf der anderen Seite oben weiter (in dem Fall links oben mit i, j = 2, 2 bis 2,6 ). Die nächstkleinere Gruppe steht als Ganzes (d.h. i, j = 1,1 bis 1, 6 ) über dem Anfangselement, wonach es weiter innen genauso weiter geht. Das Muster ist ein Beispiel einer selbstähnlichen Struktur oder Fraktal.

5 Versuch O1 MIKROSKOP Seite 5 von 6 Die Strichabstände g i, j des Musters lassen sich mit der Formel z (7) gi, j= i j 1 2 a. berechnen. Dabei ist i der Hauptgruppen-Index bzw. j der Nebengruppenindex. Der Strichabstand g 0,1 ist gegeben mit g0,1 = z = 1000 μm, dieser ist auf dem vorhandenen Muster allerdings gar nicht abgebildet. Eine Änderung des Hauptgruppenindexes von gi, j g i ± 1, j bewirkt eine Abstandsänderung jeweils um einen Faktor 2. Eine sechsmalige Änderung des Nebengruppenindexes korrespondiert mit einer Änderung des Hauptgruppenindexes zu seinem nächsten Wert, d.h. gi, j± 6 = gi± 1, j. Daraus kann man a bestimmen und es folgt: 2 6 a = bzw a =. 5. Hinweise zur Auswertung Bei der Bestimmung der Vergrößerung ist es nützlich, die Lichtstärke der Mikroskop- Beleuchtung zu variieren. Dies ist der Drehknopf rechts am Standfuß vom Mikroskop (Nr. 17 in Abbildung 3). Die Objekttischverschiebung erlaubt es, ganzzählige Anfangswerte aufeinander zu legen, was die Ablesung erleichtert. Es sollen möglichst große Skalenbereiche verglichen werden. Dabei soll berücksichtigt werden, dass eine Parallaxe (eine Verschiebung der Skalenbilder relativ zueinander, wenn man das Auge gegenüber das Okular verschiebt) die Ablesung beeinträchtigt. Die Parallaxe ist minimal, wenn die Skalenbilder genau in einer Ebene liegen, bzw. wenn die Scharfstellung optimal ist. Die Genauigkeit der Ablesungen kann aus dem Vergleich zu der zu erwartenden Vergrößerungen Vgesamt = Vokular Vobjektiv mit den drei bekannten Objektiven abgeschätzt werden. Für die Eichung des Okularmikrometers wird dieses mit Hilfe des drehbaren Ringes am Okular scharf eingestellt. Anschließend wird das Bild der Objektskala (Mikrometermaßstab) mit der normalen Grob/Feinjustierung scharfgestellt, so dass beide Skalen gleichzeitig scharf zu sehen sind. Da die Bilder beider Skalen in einer Ebene liegen sollten, dürfte bei ihrem Längenvergleich kaum Parallaxe auftreten. Vergleichen Sie beide Skalen über die größtmögliche Länge, die sich in einem Blick erfassen lässt. Der Messfehler lässt sich aus einem Vergleich mit den Werten für die bekannten Objektivvergrößerungen bestimmen. Bei der Bestimmung des Auflösungsvermögens wird das Okular mit Okluarmikrometer sowie das Objektiv mit dem Blendenwechsler verwendet. Für dieses Objektiv ist dabei der Abstand Blende-Objektebene, A = 33 mm. Dieser Abstand kann mit Hilfe der Abstandshalter aus Aluminium überprüft werden. Es können Blenden mit den Durchmessern d = 8 mm; 4 mm; 2 mm; 1 mm und 0.5 mm eingesetzt werden. Für diese Anordnung kann man sinϕ aus dem Blendendurchmesser und A bestimmen (siehe Abbildung 2). Für kleine Winkel ist d sinϕ tanϕ =. Dementsprechend kann das Auflösungsvermögen nach Formel (6) bestimmt werden (inklusive Faktor 2 wegen schiefer 2A Beleuchtung): (8) 1 2 N 2 sinϕ d = =. g λ λ Aλ schief Aus den bekannten Blendendurchmessern lassen sich nun der theoretische Wert der Apertur sowie die Auflösung für jede Blende bzw. die aufzulösenden Strichabstände be-

6 Versuch O1 MIKROSKOP Seite 6 von 6 rechnen. Die theoretischen Werte für das Auflösungsvermögen können nun experimentell überprüft werden. Dazu wird der Blendendurchmesser vom maximalen Wert (bei scharfem Bild) stufenweise verringert. Man wird feststellen, dass die kleineren Strichgruppen immer schlechter aufgelöst werden. Gleichzeitig wird es immer schwerer, die Position der größten Schärfe einzustellen. Die letzte Beobachtung hängt nicht unmittelbar mit der ersten zusammen, da die Blendenöffnung neben der Auflösung auch die Tiefenschärfe beeinflusst. 6. Literatur [1] W. Walcher, Praktikum der Physik, Teubner-Verlag (1989). [2] C. Gerthsen, Physik, Springer-Verlag (2010). [3] J. Eichler, H. J. Eichler, Laser: Bauformen, Strahlführungen, Anwendungen, Springer-Verlag (2010). 7. Fragen 1) Skizzieren Sie den Strahlengang der drei Spezialstrahlen (Parallelstrahl, Brennpunktstrahl, Mittelpunktstrahl) für eine dünne Sammellinse. 2) Skizzieren Sie den Strahlengang im Mikroskop mit Objektiv und Okular. 3) Wann entsteht bei einer dünnen Sammellinse ein vergrößertes virtuelles Bild? 4) Wie ist die Vergrößerung V eines Mikroskops definiert, was ist dabei die Bezugssehweite? 5) Wie sind numerische Apertur und das Auflösungsvermögen eines Mikroskops definiert? 6) Warum hängt das Auflösungsvermögen von der Wellenlänge des verwendeten Lichts ab?