nicht festgelegt, vgl. Abschn. II b der MAK- und BAT-Werte-Liste Spitzenbegrenzung C 4 H 6 O 2

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1 g-butyrolacton g-butyrolacton 1 MAK-Wert nicht festgelegt, vgl. Abschn. II b der MAK- und BAT-Werte-Liste Spitzenbegrenzung B Hautresorption (2010) H Sensibilisierende Wirkung Krebserzeugende Wirkung Fruchtschädigende Wirkung Keimzellmutagene Wirkung BAT-Wert Synonyma 1,4-Butanolid 4-Butyrolacton 4-Hydroxybuttersäurelacton 1-Oxacyclopentan-2-on Chemische Bezeichnung Dihydro-2(3H)-furanon CAS-Nr Formel C 4 H 6 O 2 Molmasse 86,09 g/mol Schmelzpunkt 44 C (BG Chemie 2000) Siedepunkt bei 1013 hpa C (BG Chemie 2000) Dichte bei 20 C 1,128 1,129 g/cm 3 (BG Chemie 2000) Dampfdruck bei 20 C 0,34 0,42 hpa (BG Chemie 2000) log K OW 0,64 (SRC 2009) 1 ml/m 3 (ppm) B 0,280 mg/m 3 1 mg/m 3 B 3,572 ml/m 3 (ppm) Die vorliegende Begründung basiert auf der TOXIKOLOGISCHEN BEWERTUNG der BG Chemie (2000), die im Anhang beigefügt ist, ergänzt durch eine weitere Zusammenstellung toxikologischer Daten (DECOS 2008) und neue bewertungsrelevante Untersuchungen. g-butyrolacton, eine farblose, ölige Flüssigkeit, kommt natürlicherweise in bestimmten Nahrungsmitteln, z.b. Fleisch, Früchten, Kaffee und alkoholischen Getränken vor. Sie wird in geringen Mengen auch im menschlichen Körper gefunden. MAK, 51. Lieferung, 2011

2 2 g-butyrolacton Am Arbeitsplatz wird g-butyrolacton z. B. als Lösungsmittel für Polymere und in der Elektronikindustrie, als Zusatz zu Bohrölen und chemischen Farbentfernern, in der organischen Synthese als Reagenz für zahlreiche Reaktionen (z. B. Acylierungs- Reaktionen), als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Pyrrolidonen, Weichmachern, Kunstharzen, Piperidin und Methionin eingesetzt. Ferner dient es als Zwischenprodukt zur Herstellung des Herbizids g-2-methyl-4-(chlorphenoxy)buttersäure und von a-acetobuttersäurelacton, dem Vorprodukt für Vitamin B1, ferner als Nematozid, als Stabilisator für Chlorkohlenwasserstoffe und für Phosphor-basierte Pestizide. In der pharmazeutischen Industrie wird das Hydrolyseprodukt von g-butyrolacton, die g-hydroxybuttersäure, als Medikament weiterverarbeitet. Sie wird therapeutisch genutzt als Sedativum, in der Behandlung von Alkoholabhängigkeit, Opiatentzugssyndrom sowie Narkolepsie. Sowohl g-butyrolacton als auch g-hydroxybuttersäure werden wegen ihrer euphorisierenden und sedativen Eigenschaften als Partydrogen missbraucht (BG Chemie 2000; DECOS 2008). Eine ausführliche Darstellung der Einsatzbereiche von g-butyrolacton findet sich im Anhang. 1 Allgemeiner Wirkungscharakter g-butyrolacton ist eine neuroaktive Substanz, die auf die Katecholamin-Rezeptoren des Gehirns wirkt. Seine in hohen Dosen sedative bzw. narkotische Wirkung wird auf den Hauptmetaboliten g-hydroxybuttersäure zurückgeführt. Zusätzlich haben sich in weiteren Untersuchungen analgetische, antikonvulsive, reizleitungshemmende und motilitätsreduzierende Effekte sowie Wirkungen auf das dopaminerge System gezeigt. Erste Vergiftungszeichen werden bei Erwachsenen nach mg g-butyrolacton/ kg KG berichtet. Bei ca mg g-butyrolacton/kg KG tritt Koma ein, eine Dosis von 60 mg g-butyrolacton/kg KG wird zur Einleitung einer Anästhesie für chirurgische Eingriffe verwendet. Eine fast tödlich verlaufende Vergiftung ist nach einer oralen Dosis von ca. 570 mg g-butyrolacton/kg KG berichtet worden. Eine wiederholte Aufnahme von g-butyrolacton bewirkt Ängstlichkeit, Depressionen, Tremor und Schläfrigkeit. Diese neuroaktive Wirkung zeigt sich auch bei Ratten nach oraler Verabreichung von g-butyrolacton über einen Zeitraum von 90 Tagen. Ab 225 mg/kg KG und Tag sind vorübergehend sedative Effekte beobachtet worden, bei 900 mg/kg und Tag sind alle männlichen und eine weibliche Ratte verendet. Die 90-tägige orale Applikation führt bei Mäusen ab 262 mg/kg KG und Tag vorübergehend zu sedativen Effekten. g-butyrolacton wird in Versuchen an der Ratte nach oraler Gabe schnell und vollständig aus dem Gastrointestinaltrakt resorbiert. Es haben sich keine Hinweise auf eine genotoxische Wirkung von g-butyrolacton ergeben. Die Ergebnisse der Langzeitstudien zeigen insgesamt kein kanzerogenes Potenzial von g-butyrolacton. Beim Menschen besitzt g-butyrolacton an der Haut keine reizende Wirkung. g-butyrolacton ist an der Kaninchenhaut nicht bis leicht reizend und am Kaninchenauge mäßig bis stark reizend. g-butyrolacton wirkt weder beim Menschen noch beim Meerschweinchen sensibilisierend.

3 g-butyrolacton 3 g-butyrolacton zeigt bei Ratten nach oraler Gabe von Dosen bis zu 500 mg/kg KG und Tag und bei Kaninchen nach inhalativer Exposition von bis zu 5000 mg/m 3 keine maternaltoxische, keine embryo- oder fetotoxische und keine teratogene Wirkung. Die wiederholte Verabreichung von g-butyrolacton mit dem Trinkwasser (1 bzw. 2%) hat bei noch nicht geschlechtsreifen männlichen Ratten zu erniedrigten Testesgewichten geführt. B 2 Wirkungsmechanismus g-butyrolacton ist eine neuroaktive Substanz (Neurotransmitter), die auf die Katecholamin-Rezeptoren des Gehirns wirkt. Die in hohen Dosen sedative bzw. narkotische Wirkung von g-butyrolacton, die in einer Vielzahl von neuropharmakologischen Studien untersucht worden ist, wird auf den Hauptmetaboliten g-hydroxybuttersäure zurückgeführt, der rasch durch Laktonasen gebildet wird. Zusätzlich haben sich in weiteren Untersuchungen analgetische, antikonvulsive, reizleitungshemmende und motilitätsreduzierende Effekte sowie Wirkungen auf das dopaminerge System gezeigt. Als Ursache der neurotoxischen Wirkung wird auch g-aminobuttersäure (GABA) diskutiert, die im Gehirn endogen aus g-hydroxybuttersäure gebildet werden kann (DECOS 2008). Es wird vermutet, dass g-hydroxybuttersäure bei der Reizweiterleitung an der Synapse beteiligt ist, da es eine geringe und heterogene Verteilung und eine extrem schnelle Umsetzung im Gehirn aufweist. Die immunzytochemische Lokalisierung der g-hydroxybuttersäure-synthetisierenden Enzyme im Gehirn und die mit hoher Affinität erfolgende Bindung und Freisetzung unterstützen diese Vermutung. g-hydroxybuttersäure bindet an spezifische Rezeptoren im Gehirn, wo es GABA-ähnliche Aktivitäten verursacht, z. B. die Hemmung der Dopaminausschüttung. Die Affinität zum spezifischen g-hydroxybuttersäure-rezeptor ist ca mal so hoch wie die zum GABA-B-Rezeptor. Bei physiologischen Konzentrationen scheint g-hydroxybuttersäure nicht den vollen agonistischen Effekt auf den GABA-B-Rezeptor zu haben. Da g-butyrolacton nicht an den GABA-A-Rezeptor bindet, wird angenommen, dass die pharmakologischen und systemisch-toxischen Effekte des g-butyrolactons direkt über den GABA-B-Rezeptor vermittelt werden (Carai et al. 2008; DECOS 2008; Sherry et al. 2009). Anästhetische Dosen (k. w.a.) von g-butyrolacton oder g-hydroxybuttersäure führen in dem dopaminergen nigro-striatalen Pfad zu einer akuten Blockade der zellulären Impulsübertragung für mindestens eine Stunde. Die Symptome der g-hydroxybuttersäure-wirkungen auf das ZNS könnten durch eine anfängliche Hemmung der Dopamin- Ausschüttung, gefolgt von einer erhöhten Dopamin-Freisetzung erklärt werden. Es ist diskutiert worden, dass g-butyrolacton die Erhöhung der Dopaminkonzentration im Gehirn durch antagonistische Effekte auf die Transmitterfreisetzung (k. w.a.) verursacht. Die Mechanismen, durch die g-hydroxybuttersäure ihre Wirkungen im Gehirn entfaltet, sind allerdings noch nicht vollständig untersucht (DECOS 2008). Der anabole Charakter von g-hydroxybuttersäure korreliert zwar mit einem erhöhten Prolaktin-Spiegel, ist aber nicht kausal damit verknüpft. Der anabole Effekt von g-butyrolacton hingegen scheint auf einer erhöhten Sekretion von Wachstumshormon zu beruhen. So verursachte g-butyrolacton bei gesunden jungen Männern gleichzeitig MAK, 51. Lieferung, 2011

4 4 g-butyrolacton einen langsamwelligen Schlaf und die Sekretion von Wachstumshormon. Es wurde diskutiert, dass die verminderte Alkoholaufnahme von Ratten, bei denen man eine Präferenz für Alkohol entwickelt hatte, nach Exposition gegenüber g-butyrolacton über eine Hemmung der Aktivität dopaminerger Neuronen vermittelt war (DECOS 2008). Beim Menschen wirken geringe Dosen g-butyrolacton stimulierend, höhere Dosen sedierend. g-butyrolacton wird zu g-hydroxybuttersäure metabolisiert, die den g-hydroxybuttersäure-rezeptor aktiviert, wodurch Glutamat freigesetzt wird, ein erregender Neurotransmitter. In größeren Mengen bewirkt g-hydroxybuttersäure eine Aktivierung des GABA-B-Rezeptors, der zu einer sedierenden Wirkung führt. Niedrige Konzentrationen von g-hydroxybuttersäure stimulieren die Dopaminfreisetzung über den g-hydroxybuttersäure-rezeptor, höhere Konzentrationen hemmen die Freisetzung über den GABA-B-Rezeptor (Forth et al. 1992; Horlitz 2007). Aus Tierversuchen gibt es Hinweise, dass g-butyrolacton die Reproduktionsfähigkeit beeinflusst. Es wurde diskutiert, dass der hemmende Effekt von g-butyrolacton auf die Ovulation bei Ratten durch hormonelle Einflüsse auf das Gehirn verursacht wird, die in verminderten Spiegeln des luteinisierenden Hormons (LH) sowie des Follikel-stimulierenden Hormons (FSH) resultieren, nicht aber durch einen direkten Effekt von g-butyrolacton oder g-hydroxybuttersäure auf die Reproduktionsorgane (BG Chemie 2000). Als Mechanismus für die Reizwirkung von g-butyrolacton auf das Auge wird die schnelle Biotransformation von g-butyrolacton zu g-hydroxybuttersäure und das daraus resultierende Gleichgewicht zwischen Säure und Anion diskutiert (DECOS 2008). 3 Toxikokinetik und Metabolismus Im Anhang (BG Chemie 2000) sind die Daten zur Toxikokinetik und zum Metabolismus ausführlich dargestellt. In den folgenden Abschnitten werden die wichtigsten Daten zusammengefasst. 3.1 Aufnahme, Verteilung, Ausscheidung Zahlreiche Versuche mit Ratten zeigen, dass g-butyrolacton sehr rasch und vollständig aus dem Gastrointestinaltrakt resorbiert und zu g-hydroxybuttersäure metabolisiert wird. Die Resorption nach 8 Stunden lag, bezogen auf den Wert nach intravenöser Applikation, zwischen 85 und 98% nach oraler und bei 7 bzw. 11% nach dermaler Applikation auf die mechanisch bzw. mechanisch und chemisch enthaarte Haut. Die Resorption von dermal appliziertem g-butyrolacton war abhängig von der Vorbehandlung der Rattenhaut (langsam nach mechanischer Enthaarung, schnell nach mechanischer und anschließender chemischer Enthaarung; Applikationsdauer 4 Stunden, vermutlich okklusiv) (BG Chemie 2000). Im Gehirn von unbehandelten Ratten konnte für g-butyrolacton und g-hydroxybuttersäure zusammen eine Konzentration von etwa 1 2 mmol/kg Frischgewebe (ca mg/kg, bezogen auf g-butyrolacton) nachgewiesen werden. Im Gehirngewebe eines verstorbenen Patienten (multiple Myelome, Nierenversagen und Pneumonie) wurden 3 Stunden nach Todeseintritt 0,2 0,3 mmol/kg Frischgewebe (ca mg/ kg, bezogen auf g-butyrolacton) analysiert (BG Chemie 2000).

5 g-butyrolacton 5 In vitro wurde die Resorption von g-butyrolacton an Dünndarmproben von Sprague- Dawley-Ratten geprüft. Darmstücke mit der Mucosa nach außen wurden Konzentrationen von 0,4; 0,8 oder 1,2 M (ca. 34, 69 bzw. 103 mg/ml) ausgesetzt und der Transport der Verbindung von der mucosen auf die seröse Seite der Darmproben über einen Zeitraum von 25 Minuten gemessen. Die Flussraten betrugen ca. 30, 60 bzw. 70 μmol g-butyrolacton/minute (ca. 2,6; 5,2 bzw. 6 mg/minute). Bei der Konzentration von 0,4 M wurden mit konstanten Flussraten innerhalb von 25 Minuten ca. 780 μmol (ca. 67 mg) auf der serösen Seite analysiert (BG Chemie 2000). Anlässlich plastischer Brustoperationen angefallene Humanhautstücke gesunder weiblicher Patientinnen wurden in einer Franz-Diffusionszelle auf ihre Permeabilität für verschiedene Lösungsmittel untersucht. Bei einer Nachweisgrenze von 0,2 mg/l betrug die Permeabilitätsrate der Hautproben für g-butyrolacton 1,1 ± 0,1 g/m 2 und Stunde (Ursin et al. 1995). Daraus berechnet sich bei einer einstündigen Exposition von 2000 cm 2 Hautoberfläche gegen eine gesättigte wässrige Lösung eine Aufnahmemenge von 200 mg Gesamtmenge oder 2,9 mg/kg KG. Nach den Modellen von Guy und Potts (1993) und Wilschut et al. (1995) ergeben sich bei einstündiger Exposition von 2000 cm 2 Hautoberfläche gegen eine gesättigte wässrige Lösung (= unverdünnt, weil mischbar) Aufnahmemengen von 378 bzw. 878 mg. Die Verteilung von g-butyrolacton im Körper erfolgt aufgrund der raschen Metabolisierung überwiegend als g-hydroxybuttersäure. Beide Substanzen können die Blut- Hirn-Schranke überwinden, weshalb auch höhere Konzentrationen in verschiedenen Teilen des Gehirns nachweisbar sind. Daneben finden sich g-butyrolacton und g-hydroxybuttersäure vorwiegend in Nieren, Herz, Muskeln sowie Körperfett. Die Ausscheidung der Zwischen- und Endprodukte von g-butyrolacton erfolgt überwiegend in Form von abgeatmetem CO 2, eine geringe Menge wird mit dem Urin ausgeschieden. Nach oraler Gabe von g-butyrolacton wird beim Menschen im Harn vermehrt S-3,4- Dihydroxybuttersäure, g-hydroxybuttersäure und Glykolsäure ausgeschieden. Beim Menschen beträgt die Plasma-Halbwertszeit von g-butyrolacton zwischen 30 und 60 Minuten (DECOS 2008). B 3.2 Metabolismus g-butyrolacton wird durch Laktonasen rasch und quantitativ in g-hydroxybuttersäure umgesetzt. Letztere entsteht jedoch im Intestinaltrakt auch nicht enzymatisch durch Hydrolyse. Laktonasen wurden im Humanblut und bei Ratten in Blut und Leber, nicht aber in Gehirn, Milz, Niere, Herz, Zwerchfell, Lunge, Skelettmuskel und Gastrointestinaltrakt nachgewiesen. Das aus Humanplasma gewonnene Enzym war deutlich aktiver als das aus Rattenlebermikrosomen isolierte Enzym. Auch die Umsetzung im Humanserum war effektiver als im Rattenserum. In In-vitro-Versuchen mit Rattenblut betrug die Halbwertszeit für die Umsetzung von g-butyrolacton in g-hydroxybuttersäure weniger als eine Minute. Die Hydrolyse erfolgte im Serum und im Plasma, jedoch nicht im Erythrozytenhämolysat. Im Rattenplasma waren nach 15 Minuten 92% und nach 30 Minuten 100%, im Erythrozytenhämolysat nach 30 Minuten nur 3% hydrolysiert. Die Hydrolyserate im Rattenleberhomogenat betrug nach 15 Minuten 87% und nach 60 Minuten 94%. In Katzenblut wurde g-butyrolacton langsamer als in Rattenblut hy- MAK, 51. Lieferung, 2011

6 6 g-butyrolacton drolysiert. Auch in Serumproben von Kaninchen und Meerschweinchen erfolgte eine Hydrolyse von g-butyrolacton (k. w.a.; BG Chemie 2000). 4 gesunde Probanden (2 Männer, 2 Frauen) erhielten je 1ginWasser gelöstes g-butyrolacton zu trinken. Anschließend wurden stündlich 4 Stunden lang Urinproben analysiert. Es wurde eine vermehrte Ausscheidung von S-3,4-Dihydroxybuttersäure sowie von Glykolsäure und g-hydroxybuttersäure festgestellt. Ein weiterer Metabolit war vermutlich das Hydroxyepoxid-Tautomer von 4-Hydroxy-3-oxobuttersäure. Nach Ansicht des Autors weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass g-hydroxybuttersäure durch b-oxidation metabolisiert wird (BG Chemie 2000). Es wurde postuliert, dass die g-hydroxybuttersäure nach einer Oxidation zu Butandisäure (Bernsteinsäure oder Succinylsäure) im Zitronensäure-Zyklus oder über eine b-oxidation zu CO 2 abgebaut wird (BG Chemie 2000). Ferner kann der Neurotransmitter g-aminobuttersäure (GABA) aus g-hydroxybuttersäure gebildet werden (DECOS 2008). In vivo wurden 14 C-markiertes g-butyrolacton und 14 C-markierte g-hydroxybuttersäure schnell zu 14 CO 2 metabolisiert. Nach einer einmaligen intravenösen Applikation einer Dosis von 2 mci 14 C-g-Hydroxybuttersäure (spezifische Aktivität 5,478 mci/ mmol) waren bei Ratten die ersten 14 CO 2 -Spuren bereits nach weniger als 4 Minuten in der Atemluft nachweisbar. Das Maximum der 14 CO 2 -Ausscheidung wurde nach 15 Minuten erreicht. 60% der gesamten 14 C-Radioaktivität wurden innerhalb von 2,5 Stunden als 14 CO 2 mit der Atemluft ausgeschieden. Nach Applikation der gleichen Dosis von 14 C-g-Butyrolacton (2 μci) trat nach knapp 20 Minuten das Maximum der 14 C-Konzentration in der Atemluft auf. Die Exspiration von 14 CO 2 verlief in ähnlicher Weise wie bei 14 C-g-Hydroxybuttersäure. Die Zeitdifferenz zwischen dem Auftreten der 14 CO 2 -Maxima nach der g-hydroxybuttersäure- und der g-butyrolacton-applikation war nach Diskussion der Autoren vermutlich in der Zeitdauer begründet, die für die Metabolisierung von g-butyrolacton zu g-hydroxybuttersäure vom Organismus benötigt wurde. Angaben zu einer 14 C-Ausscheidung mit dem Urin oder den Faeces und der Restaktivität im Körper fehlen (BG Chemie 2000). 4 Erfahrungen beim Menschen 4.1 Einmalige Exposition Inhalative Aufnahme Hierzu liegen keine Daten vor Orale Aufnahme Fünf gesunde freiwillige Versuchspersonen erhielten oral 2,5 g g-butyrolacton. Nach etwa 20 Minuten schliefen die Versuchspersonen eine Stunde lang. Die Elektroenzephalogramm-Veränderungen während des Schlafes und beim Aufwachen ähnelten denen durch Pentobarbital verursachten, waren jedoch von kürzerer Dauer (k. w.a.; Jenney et al. 1962). Weitere Effekte werden nicht berichtet. In einem Doppel-Blind-Versuch bewirkten 66 mg g-butyrolacton/kg KG bei Kindern in 34% der Fälle tiefen Schlaf, verglichen mit 17% bei den mit Chloralhydrat (44 mg/

7 g-butyrolacton 7 kg KG) behandelten Kindern. Atemdepression und verlängerter postoperativer Schlaf waren selten (k.w.a.; BG Chemie 2000). Es liegen zahlreiche Berichte über akzidentelle Vergiftungsfälle durch g-butyrolacton bzw. g-butyrolacton-haltige Publikumsprodukte, wie Nagellackentferner, vor. Die orale Aufnahme größerer Mengen von g-butyrolacton führte zu Effekten auf das ZNS, wie Bewusstlosigkeit und Koma, Verwirrtheit, Euphorie und Halluzinationen, Agressivität, Schmerzunempfindlichkeit, unkontrollierte Bewegungen, Bradykardie und Tachykardie sowie Atemdepression. Erste Vergiftungsanzeichen bei Erwachsenen wurden bei Dosierungen zwischen 20 und 30 mg g-butyrolacton/kg KG oder 10 mg g-hydroxybuttersäure/ kg KG beobachtet. In einem Fallbericht kam es zum Koma nach Einnahme von umgerechnet mg g-hydroxybuttersäure/kg KG. Eine Dosis von 60 mg g-butyrolacton/ kg KG wird für eine chirurgische Anästhesie benötigt (k.w.a.). Nach oraler Aufnahme von umgerechnet 570 mg g-butyrolacton/kg KG in Form eines Gesundheitsdrinks (8 g g-butyrolacton/100 ml) kam es bei einem 44-jährigen Mann zu einer fast tödlich verlaufenden Vergiftung (DECOS 2008). Die detaillierte Darstellung der Vergiftungsfälle findet sich im Anhang und in einer weiteren Zusammenstellung toxikologischer Daten (BG Chemie 2000; DECOS 2008). In einem Fallbericht wurden bei einem 24-jährigen Mann mit bekanntem g-butyrolacton-missbrauch (2 ml alle 30 Minuten), der anscheinend einen Selbstentzug versuchte, neben Benommenheit eine schwere Rhabdomyolyse sowie Nierenversagen und erhöhte Entzündungsmarker beobachtet (Supady et al. 2009). Ein 25-jähriger Mann mit bekanntem Drogenkonsum starb an einem kräftigen Schluck reinen g-butyrolactons. Der Tod wurde ca. 11 Stunden nach der Einnahme von einem Notarzt festgestellt. Bei der Obduktion traten für Vergiftungen typische, aber auch unspezifische Befunde auf, wie massive Hirn- und Lungenödeme und Blutfülle in allen Organen. Die Konzentration von g-hydroxybuttersäure im Herzblut betrug 541 mg/l, die im Oberschenkelvenenblut 671 mg/l (Fieguth et al. 2009). B Intravenöse oder intramuskuläre Aufnahme g-butyrolacton wurde mehr als 50 Patienten intravenös (15 20 mg/kg KG), intramuskulär (20 30 mg/kg KG) oder oral (k.^a. zur Dosis) verabreicht. An welchen Krankheiten die Patienten litten, wurde nicht mitgeteilt. An Nebenwirkungen traten vor allem nach intravenöser Injektion Übelkeit und Erbrechen auf. Die narkotische Wirkung von g-butyrolacton dauerte eine halbe Stunde bis drei Stunden an. Das Muster des Schlafes, das bei 25 Patienten untersucht wurde, unterschied sich im Elektroenzephalogramm vom physiologischen oder durch Barbiturate bewirkten Schlaf (Benda et al. 1960). 4.2 Wiederholte Exposition Auch die chronische orale Einnahme von g-butyrolacton kann zu zahlreichen neurotoxischen Effekten wie Ängstlichkeit, Depression, Tremor und Schlafstörung führen (k.^w.^a.; DECOS 2008). Die schmerzstillende Wirkung einer 10%igen Lotion von g-butyrolacton in Ethanol/ Wasser wurde an 6 Probanden (Alter 35 bis 67 Jahre) mit Sportverletzungen (Distorsionen, Verstauchungen, Zerrungen oder Prellungen an den Extremitäten, der Wirbelsäule oder am Brustkorb) geprüft, indem täglich 2 5 ml der Lotion in die Haut über den MAK, 51. Lieferung, 2011

8 8 g-butyrolacton schmerzenden Stellen eingerieben wurden. Die Schmerzen ließen innerhalb von Minuten deutlich nach und verschwanden gewöhnlich innerhalb von 1 2 Stunden. Bei rheumatischen Leiden (Selbstversuche von 14 Probanden) wurden 2 5 ml derselben Lotion täglich 2- bis 3-mal eingerieben. Eine Schmerzlinderung trat innerhalb von 1 3 Stunden bei allen Probanden ein. Nach 5-tägiger Behandlung waren Druck-, Bewegungs- und Ruheschmerzen sowie eingeschränkte Beweglichkeit deutlich geringer ausgeprägt als ohne Behandlung oder Verwendung von bekannten handelsüblichen Einreibemitteln. Bei Migräne (4 Probanden) verschwanden die Schmerzen innerhalb von 40 Minuten und kehrten nicht wieder, wenn 3 5 ml der Lotion innerhalb von 10 Minuten auf Stirn und Schläfen eingerieben wurden. Bei den Probanden traten nach dem Einreiben von 5 10 ml o.g. Lotion täglich weder Müdigkeit oder Schläfrigkeit noch sonstige unangenehme Zustände auf (Szirmai et al. 1989). 4.3 Wirkung auf Haut und Schleimhäute Unverdünntes g-butyrolacton bewirkte an der Haut des Oberarmes beim Menschen nach 24-stündiger Einwirkung keine Reizerscheinungen (BG Chemie 2000). Angaben über die Art der Applikation liegen nicht vor. Bei Arbeiten im Labor übergoss sich eine Person beim Kühlen eines Reaktionskolbens mit heißem g-butyrolacton. Im Gegensatz zu Wasser, das die Hand verbrüht hätte, geschah nichts dergleichen. Es bildeten sich keine Brandblasen, die Schmerzen waren nicht so stark wie erwartet und hielten nur ein bis zwei Stunden an. Das Arbeiten mit der Hand wurde in keiner Weise eingeschränkt. Daraus wurde eine schmerzstillende Wirkung von g-butyrolacton abgeleitet und an Probanden mit Sportverletzungen geprüft (siehe Abschnitt 4.2) (Szirmai et al. 1989). Wurde im Selbstversuch auf Schleimhautverträglichkeit 0,1 ml g-butyrolacton auf die Zunge gebracht, so trat keine Reizung auf, nur ein kurzes Brennen von 5 10 Sekunden, dann ein intensiver bitterer Geschmack (k.^w.^a.; Szirmai et al. 1989). 4.4 Allergene Wirkung An je 100 männlichen und weiblichen freiwilligen Testpersonen wurde eine mögliche hautsensibilisierende Wirkung von g-butyrolacton geprüft. Ein mit unverdünntem g- Butyrolacton getränktes Testläppchen wurde für fünf Tage okklusiv auf die Haut appliziert. Danach wurde die Haut auf Rötungen und Ödeme untersucht. Drei Wochen später wurde die Applikation mit 48-stündiger Expositionszeit wiederholt. Weder nach der ersten noch nach der zweiten Applikation fanden sich Hautreaktionen. g-butyrolacton zeigte in diesen Versuchen keine hautreizende Wirkung und kein hautsensibilisierendes Potenzial (BG Chemie 2000). Angaben, ob die Probanden bereits vor dem Versuch Kontakt zu g-butyrolacton hatten, fehlen. 1 2 ml einer 10%igen Lotion von g-butyrolacton in Ethanol/Wasser wurde täglich vier Wochen lang auf die Haut (k.^w.^a.) von fünf Probanden aufgebracht. Die Lotion wurde gut vertragen. Es traten keine Rötungen und kein Juckreiz, keine allergischen Hautreaktionen und keine Überempfindlichkeitsreaktionen auf (Szirmai et al. 1989).

9 g-butyrolacton Reproduktionstoxizität Hierzu liegen keine Daten vor. 4.6 Genotoxizität B Hierzu liegen keine Daten vor. 4.7 Kanzerogenität In zwei eingebetteten Fall-Kontroll-Studien an Arbeitern, die gegen Phenoxy-Herbizide, chlorierte Phenole und Dioxine exponiert waren, wurde die Inzidenz von Non- Hodgkin-Lymphomen und Weichteilsarkomen untersucht. g-butyrolacton war eine der zahlreichen untersuchten Substanzen. Die zwei Studien wurden innerhalb einer internationalen Kohorte von Arbeitern durchgeführt. Odd Ratios wurden für vier kumulative Expositions-Kategorien (nicht, niedrig, mittel oder hoch exponiert) ermittelt. Bei den hauptsächlich gegen g-butyrolacton exponierten Personen wurden keine erhöhten Inzidenzen für Non-Hodgkin-Lymphome und Weichteilsarkome beobachtet. Die Ergebnisse basieren auf nur wenigen Fällen, und die Expositionen gegen viele der untersuchten Substanzen korrellierten hoch miteinander, so dass die Effekte keiner einzelnen Substanz zugeordnet werden konnten. Diese Studie ist für eine Beurteilung der kanzerogenen Wirkung von g-butyrolacton nicht geeignet (DECOS 2008; Kogevinas et al. 1995). 5 Tierexperimentelle Befunde und In-vitro-Untersuchungen 5.1 Akute Toxizität In Tabelle 1 des Anhangs sind die Untersuchungen zur akuten Toxizität ausführlich dargestellt. In den folgenden Abschnitten sind die wichtigsten Daten zusammengefasst. Unabhängig vom Zufuhrweg wurde eine narkotische Wirkung beobachtet. Für Ratten war die Sektion nach oraler, inhalativer oder intraperitonealer Applikation ohne auffälligen Befund (BG Chemie 2000) Inhalative Aufnahme Die akute Toxizität nach einmaliger inhalativer Applikation ist mit 4-Stunden-LC 50 - Werten für Ratten von mehr als 2680 bzw. mehr als 5100 mg/m 3 gering (BG Chemie 2000) Orale Aufnahme Die oralen LD 50 -Werte lagen zwischen 500 und 1800 mg/kg KG bei Ratten, Mäusen und Meerschweinchen. An Symptomen wurden nach oraler Gabe neben narkotischer Wirkung u. a. Salivation, Bauch- und Seitenlage, Apathie, Atonie und Atemnot beobachtet (BG Chemie 2000). MAK, 51. Lieferung, 2011

10 10 g-butyrolacton Dermale Aufnahme 5640 mg g-butyrolacton/kg KG waren nicht letal für Kaninchen bei dermaler Applikation (BG Chemie 2000) Intraperitoneale, intravenöse, intracerebrale, subkutane Aufnahme Nach intraperitonealer Applikation sind für Ratten LD 50 -Werte von mg/kg KG und für Mäuse von mg/kg KG ermittelt worden. Bei Mäusen traten ab einer Dosierung von 56 mg/kg KG nach 15 Minuten kataleptische Effekte auf, die nach fünf Stunden verschwunden waren. Nach intravenöser Gabe ist ein LD 50 -Wert von 880 mg/kg KG für Mäuse mitgeteilt worden. Die ausführliche Darstellung dieser Studien sowie weitere Daten zur akuten Toxizität nach intracerebraler und subkutaner Applikation finden sich im Anhang (BG Chemie 2000; DECOS 2008). 5.2 Subakute, subchronische und chronische Toxizität Im Anhang sind die Daten zur wiederholten Toxizität ausführlich dargestellt (BG Chemie 2000). In den folgenden Abschnitten werden die wichtigsten Daten zusammengefasst Inhalative Aufnahme In orientierenden Untersuchungen wurde die fünfmalige jeweils 6-stündige Exposition gegenüber g-butyrolacton in einer Nominalkonzentration von ca. 760 ml/m 3 (entsprechend ca mg/m 3 ) von Ratten (n = 4), Kaninchen (n = 2) und Meerschweinchen (n = 2) symptomlos vertragen, während bei Katzen (n = 2) hechelnde Atmung, Taumeln und Erbrechen und bei Mäusen (n = 10) Taumeln und Seitenlage auftraten (BG Chemie 2000). Zwei der Mäuse starben nach vier bis fünf Expositionen, zwei weitere Mäuse innerhalb der 14-tägigen Nachbeobachtungszeit. Da in einer unbehandelten Kontrollgruppe die Mortalität ebenfalls 4 von 10 Mäusen betrug, waren die Todesfälle durch g-butyrolacton dem Autor nach nicht mit Sicherheit auf die Substanz zurückzuführen. Die Sektion der verendeten Mäuse war ohne auffälligen Befund (k. w.a.; BG Chemie 2000) Orale Aufnahme Mäuse Bei männlichen und weiblichen B6C3F1-Mäusen führte die zwölfmalige orale Verabreichung von bis zu 1400 mg/kg KG und Tag in der hohen Dosis zu Todesfällen. Ab einer Dosis von 350 mg/kg KG und Tag wurden sedative Wirkungen und Atmungsstörungen beobachtet. Bis in den letalen Dosisbereich bewirkte g-butyrolacton keine wesentlichen makroskopischen Veränderungen (BG Chemie 2000). In einem Versuch zur subchronischen Toxizität wurden je 10 männlichen und weiblichen B6C3F1-Mäusen 13 Wochen lang 0, 65, 131, 262, 525 bzw mg g-butyrolacton/kg KG und Tag (Lösungsmittel Maiskeimöl) fünfmal wöchentlich mittels Schlundsonde verabreicht. In der Hochdosisgruppe starben drei männliche und eine weibliche

11 g-butyrolacton 11 Maus. Das Körpergewicht der männlichen Tiere lag bei Versuchsende ca. 11% unter dem der Kontrolltiere. Die Gabe von 1050 und 525 mg/kg KG und Tag bewirkte einige Minuten nach der Applikation Seitenlage, die nach einigen Stunden reversibel war. Nach Verabreichung von 262 mg/kg KG und Tag wurde eine verminderte Aktivität beobachtet. Nach Dosen von 525 mg/kg KG und Tag oder weniger verringerten sich diese Symptome nach drei bis vier Wochen. Die Organgewichte glichen in allen Dosisgruppen denen der Kontrollen. Die makroskopische und histopathologische Untersuchung ergab keine substanzbedingten Befunde. Hämatologische und klinisch-chemische Parameter wurden nicht untersucht (BG Chemie 2000). Der systemische NOAEL beträgt 131 mg/kg KG und Tag, bedingt durch sedative Effekte bei 262 mg/kg KG und Tag. In der in Abschnitt 5.7 detailliert beschriebenen 2-Jahres-Kanzerogenitätsstudie an B6C3F1-Mäusen mit Dosierungen von 262 oder 525 mg/kg KG und Tag wurde kein NOAEL erhalten. In beiden Dosisgruppen war die Körpergewichtsentwicklung verzögert. In der Hochdosisgruppe der männlichen Tiere kam es aufgrund von Kämpfen und Bissverletzungen zu einer erhöhten Mortalität. Sekundäreffekte durch Kämpfe und Infektionen wurden an der Haut (Acanthose, Entzündung, Pigmentierung), am Thymus (Depletion, Hyperplasie), an der Lunge (Hämorrhagien) und der Prostata (Entzündung) beobachtet (NTP 1992). B Ratten Bei fünf- oder zwölfmaliger oraler Gabe von g-butyrolacton an Ratten wurden ab einer Dosis von 600 mg/kg KG und Tag Todesfälle, sedative und narkotische Wirkungen sowie eine retardierte Körpergewichtsentwicklung festgestellt (BG Chemie 2000). Je 20 männliche und weibliche Ratten (Food-and-Drug-Research-Laboratories-Stamm) erhielten 90 Tage lang g-butyrolacton mit dem Futter in Dosen von 0, 100, 200 oder 400 mg/kg KG und Tag. Todesfälle traten nicht auf. Die Behandlung wurde ohne klinische Symptome, ohne Veränderungen der hämatologischen, klinisch-chemischen oder Urinparameter (jeweils 5 Tiere/Gruppe befundet) und ohne substanzbedingte Organgewichtsveränderungen oder histopathologische Befunde vertragen (BG Chemie 2000). In einem Versuch zur subchronischen Toxizität wurden je 10 männlichen und weiblichen F344/N-Ratten 13 Wochen lang 0, 56, 112, 225, 450 bzw. 900 mg g-butyrolacton/ kg KG und Tag in Maiskeimöl fünfmal wöchentlich mittels Schlundsonde verabreicht. In der Hochdosisgruppe verendeten alle männlichen und eine weibliche Ratte bis zur achten Versuchswoche. Die Tiere der höchsten Dosisgruppe zeigten an klinischen Symptomen innerhalb einiger Minuten nach der Applikation Seitenlage, waren jedoch einige Stunden später äußerlich wieder normal. Die Dosis von 450 mg/kg KG und Tag bewirkte bei den männlichen Tieren eine signifikante Retardierung der Körpergewichtsentwicklung. Bei den Ratten der 225- und 450-mg/kg-Gruppen trat nach der Dosierung Inaktivität auf. Nach zwei bis drei Wochen hatten sich die Tiere sichtbar an die sedative Wirkung von g-butyrolacton gewöhnt. In keiner Dosisgruppe unterschieden sich die Organgewichte von Gehirn, Herz, Niere, Leber, Lunge und Thymus von denen der Kontrolltiere. Makroskopisch wurden keine Veränderungen festgestellt. Nach umfassender histopathologischer Befundung wurden in allen Dosisgruppen bei den meisten Ratten Entzündungen der Nasenschleimhaut beobachtet. Diese Veränderungen waren fokal oder multifokal und bestanden aus kleinen Ansammlungen von Neutrophilen oder Makrophagen im Lumen oder in der Mucosa. Nach den Autoren sind MAK, 51. Lieferung, 2011

12 12 g-butyrolacton ähnliche Veränderungen auch in anderen Schlundsondenversuchen beobachtet worden und möglicherweise auf den Rückfluss der sondierten Lösung in den Nasopharynx zurückzuführen. Weitere histopathologische Veränderungen ergaben sich nicht. Hämatologische und klinisch-chemische Untersuchungen wurden nicht durchgeführt (NTP 1992; SRI 1981). Der systemische NOAEL liegt bei 112 mg/kg KG und Tag, bedingt durch sedative Effekte bei 225 mg/kg KG und Tag. In der in Abschnitt 5.7 detailliert beschriebenen 2-Jahres-Kanzerogenitätsstudie an F344/N-Ratten mit Dosierungen von 112 oder 225 mg/kg KG und Tag für die männlichen Tiere und 225 oder 450 mg/kg KG und Tag für die weiblichen Tiere wurde ein NOAEL von 225 mg/kg KG und Tag erhalten. In der Hochdosisgruppe der weiblichen Tiere wurde eine verzögerte Körpergewichtsentwicklung beobachtet (NTP 1992). Hunde Je drei männliche und weibliche Beagle-Hunde bekamen mit dem Futter g-butyrolacton 90 Tage lang für eine Stunde pro Tag an sechs Tagen pro Woche verabreicht. Bei einem durchschnittlichen Futterverbrauch von ca. 370 g pro Tag und einem durchschnittlichen Körpergewicht von ca. 11 kg erhielten die Tiere 0, ca. 70, 140 bzw. 280 mg g-butyrolacton/kg KG und Tag. Die Körpergewichtsentwicklung war nicht beeinträchtigt. Die Bestimmung der Organgewichte, der hämatologischen, klinisch-chemischen und Urin-Parameter sowie die makroskopischen und umfassenden histopathologischen Untersuchungen am Versuchsende waren ohne auffälligen Befund (BG Chemie 2000) Dermale Aufnahme Hierzu liegen keine Angaben vor Intraperitoneale Aufnahme Je Ratten erhielten g-butyrolacton dreimal wöchentlich insgesamt fünfmal intraperitoneal in Dosen von 452, 904 bzw mg/kg KG und Tag verabreicht. Bis zum 14. Versuchstag starben in der oberen Dosisgruppe 2 von 10 und in der mittleren 2 von 15 Tieren. An klinischen Symptomen trat ca. 20 Minuten nach jeder Applikation eine meist fünf Stunden anhaltende Narkose auf (k. wa.; BG Chemie 2000). 5.3 Wirkung auf Haut und Schleimhäute Haut Reines g-butyrolacton wirkt an der Kaninchenhaut nicht bis leicht reizend (BG Chemie 2000). Die detaillierte Darstellung der Untersuchungen findet sich im Anhang Auge Reines g-butyrolacton wirkt am Kaninchenauge mäßig bis stark reizend. Diese Wirkung wurde in vitro anhand der Opazität der Cornea aus Rinderaugen bestätigt (BG Chemie 2000). Die detaillierte Darstellung der Untersuchungen findet sich im Anhang.

13 g-butyrolacton Allergene Wirkung Es wurde berichtet, dass g-butyrolacton an der Meerschweinchenhaut nicht sensibilisierend wirkte (k.^w.^a.; BG Chemie 2000). 5.5 Reproduktionstoxizität B Im Anhang sind die Daten zur Reproduktionstoxizität ausführlich dargestellt. In den folgenden Abschnitten werden die Ergebnisse der einzelnen Studien daher nur kurz zusammengefasst Fertilität Weibliche Fertilität Die ovulationshemmende Wirkung von g-butyrolacton wurde an adulten weiblichen Sprague-Dawley-Ratten untersucht. Fünf bis elf Tiere pro Gruppe erhielten die Testsubstanz in physiologischer Kochsalzlösung in Dosen von 0; 62,5; 125, 250, 500 oder 750 mg/kg KG im Proöstrus einmalig intraperitoneal appliziert. Die Gewichte der Ovarien waren nicht verändert. Ab 250 mg/kg KG wurden dosisabhängig eine Hemmung der Ovulation (um %) und erhöhte Uterusgewichte zusammen mit einer erhöhten Inzidenz an vergrößerten Uteri festgestellt. Ferner kam es ab dieser Dosierung über den gesamten vierstündigen Untersuchungszeitraum zu einem signifikanten, dosisabhängigen Abfall des luteinisierenden Hormons (LH) im Serum. Drei Stunden nach der Behandlung waren auch die Spiegel des follikelstimulierenden Hormons (FSH) ab einer Dosis von 500 mg/kg KG signifikant erniedrigt. Nach Aussage der Autoren könnte die Beeinflussung der untersuchten Hormone auf Effekten von g-butyrolacton auf den zentralen dopaminergen Impulsfluss beruhen (Beattie et al. 1976). Männliche Fertilität Die wiederholte orale Verabreichung von g-butyrolacton an noch nicht geschlechtsreife, 21 Tage alte männliche Ratten (10 14 Tiere pro Gruppe) in Konzentrationen von 1 bzw. 2% im Trinkwasser (bei 20 ml Wasser pro Tag und Ratten mit einem Gewicht von 200 g entsprechen die Dosen 1000 oder 2000 mg/kg KG und Tag) führte im Vergleich zu den Kontrolltieren zu erniedrigten Körper- und Testesgewichten. Der Serumprolactin-Spiegel der behandelten Tiere unterschied sich nicht von dem der Kontrolltiere. Da in dieser Studie eine signifikante Körpergewichtsretardierung aufgetreten war, wurde der Versuch wiederholt, wobei eine genauere Kontrolle des Futterverbrauchs erfolgte. In der Wiederholungsstudie glichen die Körpergewichte denen der mitgeführten Kontrollgruppe, die Testesgewichte waren jedoch auch hier erniedrigt. Die Gewichte der Samenbläschen und der Prolactin-Spiegel im Serum unterschieden sich nicht von denen der Kontrollen (k.w.a.; BG Chemie 2000). Je fünf männliche (CBAxBALB/c)F1-Mäuse erhielten an fünf aufeinander folgenden Tagen 0,1; 0,25; 0,5 bzw. 1 ml g-butyrolacton/kg KG und Tag (entsprechend ca. 113, 282, 564 bzw μg/kg KG und Tag) in physiologischer Kochsalzlösung intraperitoneal injiziert. In der höchsten Dosisgruppe verendete ein Teil der Tiere (k. w.a.). Fünf MAK, 51. Lieferung, 2011

14 14 g-butyrolacton Wochen nach der letzten Behandlung wurden keine Spermienkopfanomalien beobachtet (BG Chemie 2000) Entwicklungstoxizität Je zehn weibliche Sprague-Dawley-Ratten erhielten vom Tag der Trächtigkeit 10, 50, 125, 250 oder 500 mg g-butyrolacton/kg KG und Tag oral per Schlundsonde. Neun mit dem Lösungsmittel behandelte Tiere dienten als Kontrollen. Als Lösungsmittel wurde Sojabohnenöl verwendet, wobei die Löslichkeit von g-butyrolacton bei 500 mg/kg KG und Tag ungenügend war, sodass höhere Dosen nicht geprüft wurden. Die Schnittentbindung der Feten erfolgte am 21. Tag der Trächtigkeit. Es wurden keine maternaltoxischen, feto- oder embryotoxischen und keine teratogenen Effekte beobachtet (BG Chemie 2000). In einer Entwicklungtoxizitätsstudie wurden je 15 Himalaja-Kaninchen vom Tag der Trächtigkeit täglich 6 Stunden lang gegenüber 0, 500, 1400 bzw mg g-butyrolacton/m 3 als Dampf bzw. Dampf-Aerosol-Mischung exponiert (Kopf-Nasen- Exposition). g-butyrolacton wirkte in dieser Studie bis zur höchsten geprüften Konzentration von 5000 mg/m 3 weder maternal-, embryo- oder fetotoxisch noch teratogen (BG Chemie 2000). 5.6 Genotoxizität In den Tabellen 2 bis 5 des Anhangs sind die Daten zur Genotoxizität in vitro und in vivo ausführlich dargestellt (BG Chemie 2000). In den folgenden Abschnitten werden die Ergebnisse der einzelnen Studien zusammengefasst In vitro Mutagene Wirkung in Bakterien, Hefen und Säugetierzellen Mit durchweg negativem Ergebnis wurde die mutagene Wirkung von g-butyrolacton in zahlreichen bakteriellen Mutagenitätstests mit den Salmonella-Stämmen TA98, TA100, TA102, TA1535, TA1537 und TA1538, durchgeführt in An- und in Abwesenheit metabolischer Aktivierung als Standard-Platteninkorporationstest, Präinkubationstest oder als Fluktuationstest, untersucht. Weitere negative Befunde hinsichtlich einer mutagenen Wirkung von g-butyrolacton wurden in An- und in Abwesenheit metabolischer Aktivierung im 8-Azaguanin-Resistenztest an Salmonella typhimurium TM677, in mehreren Tests hinsichtlich einer Tryptophanreversion an Escherichia-coli-WP2- Stämmen und im Vorwärtsmutationstest an Schizosaccharomyces pombe P1 erhoben. Im Reversionstest an Saccharomyces cerevisiae XV185-14C war der Befund ohne metabolische Aktivierung negativ. Mit metabolischer Aktivierung wurde das Ergebnis von den Autoren als fraglich bewertet, da eine geringgradige Erhöhung der Reversionsrate in der unteren geprüften Konzentration festgestellt wurde (BG Chemie 2000). g-butyrolacton induzierte weder in An- noch in Abwesenheit metabolischer Aktivierung bei Saccharomyces cerevisiae D6 eine mitotische Aneuploidie (BG Chemie 2000). Auch in Säugetierzellen wurde keine mutagene Wirkung von g-butyrolacton beobachtet: Ein HPRT-Test an V79-Zellen verlief negativ (BG Chemie 2000).

15 g-butyrolacton 15 Indikatortests und Tests auf DNA-schädigende Wirkung In der Mehrzahl der folgenden Untersuchungen ergaben sich keine Hinweise auf ein DNA-schädigendes Potenzial von g-butyrolacton: an Polymerase- (pola) oder rekombinationsprofizienten und -defizienten (reca) Escherichia-coli-Stämmen, an Escherichia coli, in denen die Induktion einer SOS-Antwort als Parameter für eine DNA-schädigende Wirkung diente, an reparaturprofizienten und -defizienten Saccharomyces-cerevisiae-Stämmen in An- und in Abwesenheit metabolischer Aktivierung (siehe Tabellen 2 und 3 im Anhang; BG Chemie 2000). Das Ergebnis eines als Suspensionstest, jedoch ohne metabolische Aktivierung durchgeführten Tests auf differenzielle Abtötung mit Escherichia coli wurde als fraglich bewertet, da es zwar zu einer stärkeren Inhibierung des pola -Stammes im Vergleich zu den pola + -Stämmen kam, aber nicht in dem Ausmaß, das von den Autoren als eindeutig positiver Befund gewertet wurde. Ein Test auf differentielle Abtötung an Bacillus-subtilis-rec-Stämmen war sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit metabolischer Aktivierung mit dem ungeläufigen Metabolisierungssystem S9-Mix aus Japanischen Muscheln negativ und ergab mit dem ebenfalls ungeläufigen Metabolisierungssystem S9-Mix aus Gelbschwanzfischleber einen positiven Befund (siehe Tabelle 2 im Anhang; BG Chemie 2000). Die an Säugerzellen durchgeführten Studien erbrachten ebenfalls keinen relevanten Hinweis auf ein DNA-schädigendes Potenzial von g-butyrolacton. Ein UDS-Test an HeLa-S3-Zellen und ein DNA-Reparatur-Test an reparaturprofizienten und -defizienten CHO-Zellen waren sowohl in An- als auch in Abwesenheit metabolischer Aktivierung negativ. Eine an CHO-Zellen durchgeführte Prüfung zur Induktion von Schwesterchromatid- Austauschen (SCE-Test) war ohne metabolische Aktivierung negativ und mit metabolischer Aktivierung erst in den ungewöhnlich hohen geprüften Konzentrationen von mehr als 3010 μg/ml positiv. In einem Testsystem, durchgeführt an einer aus Human- Amnionflüssigkeit isolierten Permanent-Zelllinie (FL-Zellen), in dem aus einer Erhöhung der Aktivität der Adenosindiphosphat-Ribosyltransferase (ADPRT) und der damit verbundenen Senkung des Gehaltes an Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) auf eine DNA-schädigende Wirkung geschlossen wird, war g-butyrolacton negativ (siehe Tabelle 4 im Anhang; BG Chemie 2000). B Chromosomenschädigende Wirkung Eine chromosomenschädigende Wirkung von g-butyrolacton wurde im Chromosomenaberrations-Test an CHO-Zellen mit metabolischer Aktivierung nur bei Prüfung sehr hoher Konzentrationen (mehr als 2580 μg/ml) festgestellt. Ohne metabolische Aktivierung war der Test negativ. Ein Chromosomenaberrations-Test an metabolisch kompetenten Rattenleberepithelzellen (RL1) war negativ (siehe Tabelle 4 im Anhang; BG Chemie 2000). Sonstiges g-butyrolacton induzierte weder in An- noch in Abwesenheit metabolischer Aktivierung in Humanlungenfibroblasten (HSC 172) eine Resistenz gegen Diphtherietoxin (siehe Tabelle 4 im Anhang; BG Chemie 2000). MAK, 51. Lieferung, 2011

16 16 g-butyrolacton Ferner wurde in vitro die Reaktivität von je 50 mm b-propiolacton, b-butyrolacton oder g-butyrolacton mit Guanosin, Ribonukleinsäure, Desoxyribonukleinsäure, denaturierter Desoxyribonukleinsäure oder 4-(p-Nitrobenzyl)pyridin untersucht. b-propiolacton erwies sich gegenüber den oben genannten Stoffen als 50- bis 100-mal aktiver als b-butyrolacton, während g-butyrolacton vollkommen unwirksam war. Der Autor diskutierte, dass dies mit der kanzerogenen Wirkung der Laktone korreliere (BG Chemie 2000) In vivo In keiner In-vivo-Untersuchung zeigte g-butyrolacton ein genotoxisches Potenzial. Es wurde in Mikronukleustests an der B6C3F1- bzw. CD1-Maus mit einmaliger und wiederholter intraperitonealer Applikation maximal verträglicher Dosen, im geschlechtsgebundenen rezessiven Dominant-Letal-Test und im Augen-Mosaik-Test an Drosophila melanogaster sowie hinsichtlich der Induktion diploider Spermien an der NMRI-Maus geprüft (siehe Tabelle 5 im Anhang; BG Chemie 2000). Zusammenfassung: Nach dem Gesamtergebnis der vorliegenden Genotoxizitätsuntersuchungen in vitro und in vivo kann davon ausgegangen werden, dass g-butyrolacton keine genotoxische Wirkung besitzt. 5.7 Kanzerogenität Kurzzeitstudien g-butyrolacton wurde in vitro im Zelltransformationstest an BHK-Zellen mit metabolischer Aktivierung (S9-Mix, k. w.a.) geprüft. Die Konzentrationen betrugen 0,025; 0,25; 2,5; 25 bzw. 250 μg/ml. Ab 25 mg/ml kam es zu einer konzentrationsabhängigen Erhöhung der Transformationsrate. g-butyrolacton wurde in diesem Test als positiv bewertet (BG Chemie 2000). 34 XVII/G-Mäusen (k.a. zum Geschlecht) wurde 1 mg g-butyrolacton am 1., 4. und 8. Lebenstag subkutan injiziert. Dieser Mäusestamm weist eine hohe Spontan-Inzidenz für Lungentumoren auf. Die Inzidenz für Lungentumoren wurde durch die Applikation von g-butyrolacton nicht erhöht (BG Chemie 2000). 16 weiblichen Swiss-Webster-Mäusen wurden 4 Wochen lang dreimal wöchentlich 0,005 mg g-butyrolacton in 0,1 ml Tricaprylin subkutan injiziert (12 Injektionen). 11 Mäuse überlebten 18 Monate lang. Es wurden weder lokale noch andere Tumoren festgestellt (BG Chemie 2000) Langzeitstudien Die im Folgenden ausführlich beschriebene valide 2-Jahre-Studie an Ratten und Mäusen (NTP 1992) wurde im Original geprüft, die Beschreibung der übrigen Langzeitstudien stützt sich auf die Darstellung im Anhang (BG Chemie 2000). Mäuse Je 50 männliche und weibliche B6C3F1-Mäuse erhielten fünfmal wöchentlich 0, 262 bzw. 525 mg g-butyrolacton/kg KG und Tag als Lösung in Maiskeimöl mit der

17 g-butyrolacton 17 Tab. 1. Veränderungen im Nebennierenmark bei männlichen B6C3F1-Mäusen nach 2-jähriger oraler Applikation von g-butyrolacton (NTP 1992) g-butyrolacton-dosis (mg/kg KG und Tag) B Hyperplasie 2/48 (4%) 9/50 (18%)* 4/50 (8%) benigne Phäochromozytome 1) 1/48 (2%) 5/50 (10%) 1/50 (2%) maligne Phäochromozytome 2) 1/48 (2%) 1/50 ( 2%) 0/50 (0%) benigne oder maligne Phäochromozytome 2/48 (2%) 6/50 (12%) 1/50 (2%) gesamt 3) erstes Auftreten der Tumoren (Tage) * signifikant unterschiedlich zu den Kontrollen 1) historische Kontrolle: 2,7±1,6%; 0 4 2) historische Kontrolle: 3,4±0,8%; 0 2 3) historische Kontrolle: 3,1±1,8%; 0 6 Schlundsonde während eines Zeitraumes von zwei Jahren. Die Körpergewichtsentwicklung der männlichen Mäuse beider Dosisgruppen war anfänglich retardiert. Am Versuchsende lagen die Körpergewichte um 6% unter denen der Kontrollen. Ähnlich verhielt sich die Körpergewichtsentwicklung der weiblichen Mäuse beider Dosisgruppen. Die Körpergewichte lagen am Versuchsende in der hohen Dosisgruppe um 14% und in der unteren Dosisgruppe um 17% unter denen der Kontrollen. In der oberen Dosisgruppe zeigten die Tiere beider Geschlechter kurz nach der Sondierung teilweise Sedierung oder Lethargie. Die Überlebenszeit der männlichen Mäuse war in der hohen Dosisgruppe erniedrigt (Kontrolle: 674 Tage, Hochdosisgruppe: 481 Tage). Am Versuchsende hatten von den männlichen Mäusen in der Kontrollgruppe 70%, in der unteren Dosisgruppe 60% und in der oberen Dosisgruppe 25% überlebt. Die entsprechenden Werte betrugen bei den weiblichen Tieren 76, 68 bzw. 76%. Die hohe Mortalität bei den männlichen Mäusen der oberen Dosisgruppe wurde auf Kämpfe und Bissverletzungen und deren Folgen während des ersten Studienjahres zurückgeführt. Danach wurden die Tiere einzeln gehalten. Die makroskopische und umfangreiche histopathologische Untersuchung ergab bei den weiblichen Mäusen keine substanzbedingten Veränderungen. Bei den männlichen Mäusen kam es in der niedrigen Dosisgruppe im Nebennierenmark zu einer gering erhöhten Inzidenz an benignen oder malignen Phäochromozytomen, die jedoch über der Inzidenz bei den historischen Kontrollen lag (3,1%; Streubreite 0 6%), und zu einer statistisch signifikant erhöhten Inzidenz an fokaler Hyperplasie (siehe Tabelle 1). Die fehlende Dosisabhängigkeit führten die Autoren auf die hohe Mortalität in der hohen Dosisgruppe zurück. Für weibliche Mäuse ergaben sich somit keine Hinweise auf ein kanzerogenes Potenzial von g-butyrolacton. Die bei den männlichen Mäusen aufgetretenen Befunde wurden vom NTP mit equivocal evidence of carcinogenic activity bewertet (NTP 1992). Die Phäochromozytome lassen sich mechanistisch durch Interaktion von Dopaminrezeptor und g-hydroxybuttersäure gut erklären. g-butyrolacton wird schnell durch Laktonasen zur g-hydroxybuttersäure um- MAK, 51. Lieferung, 2011

18 18 g-butyrolacton gesetzt, die im Körper wahrscheinlich zu der verwandten g-aminobuttersäure metabolisiert wird. Diese beeinflusst als solche indirekt den Dopamin-Haushalt, wie in einer Studie an Hunden gezeigt werden konnte: Die akute Gabe von g-butyrolacton führt zur Hemmung der dopaminergen neurophysiologischen Aktivität (NTP 1992), so dass die Bildung von Phäochromozytomen auf einer Beeinflussung des Dopamin-Haushaltes beruhen könnte. Da zudem ausschließlich gutartige Phäochromozytome und diese nur bei einer Spezies und einem Geschlecht beobachtet wurden, werden die Phäochromozytome bei der männlichen Maus von der Kommission als nicht einstufungsrelevant bewertet. Acht Wochen alte, männliche NMRI-Mäuse (n = 95) erhielten 78 Wochen lang einmal wöchentlich 750 mg g-butyrolacton/kg KG in Sojabohnenöl oral mittels Schlundsonde. Eine Kontrollgruppe bestand aus 45 männlichen Mäusen. Nach 26 Wochen wurden 17 Tiere der Behandlungsgruppe und 10 Tiere der Kontrollgruppe und nach 52 Wochen 14 Tiere der Behandlungsgruppe und 10 Tiere der Kontrollgruppe getötet und histopathologisch untersucht. Die restlichen Tiere wurden bis zur 123. Woche beobachtet. Die Körpergewichtsentwicklung der Mäuse, die g-butyrolacton erhielten, glich bis zur 48. Versuchswoche der der Kontrolltiere. Danach wurden erniedrigte durchschnittliche Körpergewichte beobachtet. Die Überlebensrate war nicht beeinträchtigt. Bei der histopathologischen Untersuchung fanden sich im Vergleich zu den Kontrolltieren keine erhöhten Tumorinzidenzen (BG Chemie 2000). Einer Gruppe von 36 männlichen und weiblichen XVII/G-Mäusen (ein Mäusestamm mit einer spontanen Inzidenz für Lungentumoren von 50%) wurde zweimal wöchentlich 2 mg g-butyrolacton in 0,1 ml Wasser/Tier mit der Schlundsonde über die gesamte Lebensdauer appliziert. Eine Kontrollgruppe, die Wasser erhielt, bestand aus 33 Tieren. Die Tumorrate für Lungentumoren wurde durch die Applikation von g-butyrolacton nicht erhöht. Auch in anderen Organen wurden keine erhöhten Tumorinzidenzen beobachtet (k.w.a.; BG Chemie 2000). Je 30 männliche und weibliche C3H-Mäuse (ein Mäusestamm mit spontanen Inzidenzen für Mamma- bzw. Lebertumoren von 60 bzw. 15%) erhielten vom 24. Lebenstag an während der gesamten Lebenszeit 1000 mg g-butyrolacton/kg Futter (entsprechend ca. 143 mg/kg KG und Tag). 54 männliche und 61 weibliche Mäuse wurden als Kontrolltiere mitgeführt. Bei 19 von 30 behandelten weiblichen Mäusen (63,3%) und bei 43 von 61 unbehandelten Kontrolltieren (70,5%) entwickelten sich Mammatumoren. Die mittlere Latenzzeit für die Tumorentstehung betrug bei den behandelten Mäusen 315±63 Tage und bei den Kontrollen 327 ± 59 Tage. Bei 5 von 30 behandelten männlichen Mäusen (16,6%) und bei 6 von 54 Mäusen in der Kontrollgruppe (10,9%) wurden Hepatome beobachtet. Dieser Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant. Die Tumorhäufigkeiten wurden durch Applikation von g-butyrolacton somit nicht erhöht (BG Chemie 2000). Einer Gruppe von 30 XVII/G-Mäusen (k.^a. zum Geschlecht) wurde während der gesamten Lebenszeit zweimal wöchentlich ein Tropfen einer 1%igen g-butyrolacton- Lösung in Aceton auf die Nackenhaut appliziert. 17 Kontrolltiere erhielten das Lösungsmittel Aceton. Bei einer mittleren Überlebenszeit von 601 Tagen hatten 21 von 30 behandelten Mäusen (70%) und in der Kontrollgruppe bei einer mittleren Überlebenszeit von 499 Tagen 9 von 17 Mäusen (52,9%) Lungentumoren entwickelt. Erhöhte Tumorinzidenzen in anderen Organen wurden nicht festgestellt (BG Chemie 2000). Die Erhöhung der Lungentumorinzidenzen in der Behandlungsgruppe ist vermutlich durch die