Vergleichende Identifizierung von Bakterienstämmen mittels analytischem Profilindex (VITEK 2 Compact) und Massenspektrometrie (MALDI- TOF)

Transkript

1 Besondere Lernleistung Vergleichende Identifizierung von Bakterienstämmen mittels analytischem Profilindex (VITEK 2 Compact) und Massenspektrometrie (MALDI- TOF) Bearbeiter: Theresa Mühle Betreuer: Frau Gostomski und Frau Dr. med. Fichtner

2 Gliederung Einführung Materialien und Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Ausblick

3 1. Einführung

4 1. Einführung Zielstellung Bakterien = ubiquitär Unter bestimmten Bedingungen Entstehung von Infektionen Korrekte Erregeridentifizierung für erfolgreiche Therapie notwendig Für Identifizierung Bau der Bakterienzelle entscheidend

5 1. Einführung Bakterienzellen (1) (2) (1) (2) (3) (3) w830-h830/kokken.jpg /3/3b/Leptospira_scanning_micrograph.jpg/300px- Leptospira_scanning_micrograph.jpg

6 1. Einführung Zellaufbau

7 1. Einführung Erregeridentifizierung Verschiedene Methoden: - Mikroskopie - Biochemische Verfahren - Massenspektrometrie

8 1. Einführung Erregeridentifizierung Massenspektrometrie: neues Verfahren im Labor - Verifizierung notwendig (Überprüfung der Leistungsfähigkeit, Überprüfung der richtigen Arbeitsweise) - gefordert: Überprüfung an 100 Bakterienstämmen

9 1. Einführung Erregeridentifizierung Aufgabe: Untersuchung von 100 Stämmen mittels VITEK 2 Compact (biochemische Identifizierung) und MALDI- TOF (Massenspektrometrie)

10 2. Materialien und Methoden

11 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels VITEK 2 Compact Verschiedene Karten für unterschiedliche Bakteriengruppen (z.b. grampositive Kokken, gramnegative Stäbchen) Untersuchung 63 verschiedener Reaktionen pro Karte Erstellung eines biochemischen Profils

12 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels VITEK 2 Compact

13 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels VITEK 2 Compact Herstellung Bakteriensuspension Glasstäbchen Bakterienprobe von Agarplatte in Reagenzglas Trübung Röhrchen der Karte in Keimsuspension Carriernummer in Computer; Barcodenummern scannen; Probennummer eingeben

14 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels VITEK 2 Compact 2 Fächer = Fülleinheiten Vakuum-Pumpe saugt Luft aus Kammer Proben über Transferröhrchen in Testkarten gepresst 3 4 min Signalton; Carrier in Belade- und Entladeeinheit umsetzen

15 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels VITEK 2 Compact Gerät liest Barcodes; sendet Daten + Carriernummer an Computer; Vergleich zu manuell eingegebenen Daten Transferröhrchen von Testkarten abgetrennt und versiegelt Identifizierungskarten in Halterungen der Leseeinheit eingesetzt Alle 15 min: Transmissionsoptik misst Stoffwechselaktivität der Bakterien mit sichtbarem Licht

16 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels VITEK 2 Compact

17 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDI- TOF MALDI-TOF: Matrix-assistierte-Laser-Desorption/Ionisation Time-of-Flight Massenspektrometrie

18 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDI- TOF Proben mit UV-Laser bestrahlt positiv geladene Proteine werden freigesetzt Ionen elektrostatisch beschleunigt; gelangen in Flugrohr Unterschiedliche Massen Ionen treffen nicht zum selben Zeitpunkt auf Detektor Messung der Flugzeit in molare Masse umgerechnet Summe der Proteinmassen ergibt typische Massenverteilung der Proteine

19 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDI- TOF

20 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDI- TOF

21 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDI- TOF

22 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDITOF Sehr wahrscheinliche Speziesidentifikation ; Sichere Gattungsidentifikatio n, wahrscheinliche Speziesidentifikation Wahrscheinliche Gattungsidentifikati on Unzuverlässige Identifikation

23 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDI- TOF Belegungsplan beschriften zeigt alle Positionen auf Targetplatte Holzspießer kleine Menge der Kolonie auf Targetposition Lufttrocknung Pipette 1 µl einer Matrix auf Target Lufttrocknung Matrix kristallisiert Computer: Durchgang benennen; virtuelle Targetplatte Positionen der Präparate kennzeichnen

24 3. Ergebnisse

25 3. Ergebnisse Streptococcus Name Anzahl der Stämme Identifizierun g durch VITEK 2 Compact Identifizierun g durch MALDI-TOF Streptococcus agalactiae 5 Streptococcus pyogenes 3 Streptococcus dysgalactiae ssp equismilis 6 Streptococcus anginosus 1 Streptococcus constellatus ssp pharyngis 1 Streptococcus mitis 2 x Streptococcus parasanguinis 1

26 3. Ergebnisse Enterococcus Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDI- TOF Enterococcus faecium 4 Enterococcus gallinarum 1 Enterococcus faecalis 1

27 3. Ergebnisse Staphylococcus Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDI-TOF Staphylococcus aureus 7 Staphylococcus auricularis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus x Staphylococcus hominis 1 x Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus saprophyticus 1 1

28 3. Ergebnisse Micrococcus Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDI- TOF Micrococcus luteus 1

29 3. Ergebnisse Coryneforme grampositive Stäbchen Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDI- TOF Arthrobacter cumminsii Corynebacterium amycolatum Corynebacterium aurimucosum Corynebacterium striatum x 1 x Rothia mucilaginosa 1 x

30 Fakultativ bis obligat anaerobe, 3. Ergebnisse grampositive, sporenlose Stäbchenbakterien Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDI- TOF Actinobaculum schaalii 1 x Actinomyces neuii ssp neuii 1 x Actinomyces turicensis 1 x Actinomyces urogenitalis 1 x

31 3. Ergebnisse Bacillaceae Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDI- TOF Bacillus cereus 1 x

32 3. Ergebnisse Haemophilus Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDI- TOF Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae 3 1

33 3. Ergebnisse Enterobacteriaceae Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDI-TOF Citrobacter freundii 1 Enterobacter cloacae 1 Escherichia coli 10 Escherichia vulneris 1 Klebsiella oxytoca 1 Morganella morganii ssp morganii 1 Pantoea agglomerans 1 Providencia rettgeri 1 Serratia marcescens 2

34 Pseudomonas und andere 3. Ergebnisse anspruchslose nichtfermentierende gramnegative Stäbchen Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDI-TOF Acinetobacter baumannii 1 x Acinetobacter ursingii 1 Aeromonas hydrophila ssp anaerogenes 1 x Pseudomonas stutzeri 1 Pseudomonas aeruginosa 6

35 4. Diskussion

36 4. Diskussion Identifizierung mittels VITEK 2 Compact VITEK 2 Compact erkennt Bakterien anhand von biochemischen Prozessen häufige Überschneidung von Merkmalen

37 4. Diskussion Identifizierung mittels VITEK 2 Compact VITEK 2 Compact nicht identifiziert: - 2 Staphylococcus: ähnliche Stoffwechselprofile - 5 Corynebakterien: sehr langsames Wachstum - 5 grampositive Stäbchen: sehr langsames Wachstum - 1 Aeromonas: zu wenig Stoffwechselleistung

38 4. Diskussion Identifizierung mittels MALDI-TOF MALDI-TOF erkennt Bakterien anhand ihrer Massenspektren ähnliche Spektren bei nah verwandten Bakterien

39 4. Diskussion Identifizierung mittels MALDI-TOF MALDI- TOF nicht identifiziert: - 3 Streptococcus: Massenspektren zu ähnlich

40 4. Diskussion Identifizierung mittels MALDI-TOF MALDI- TOF nicht identifiziert: -1 Acinetobacter: Massenspektren zu ähnlich

41 4. Diskussion Vergleich zusätzlicher Faktoren MALDI-TOF: hohe Anschaffungskosten; arbeitet kostengünstiger und schneller VITEK 2 Compact: geringere Anschaffungskosten, höhere Verbrauchskosten; längere Analysendauer Moderne Technik + persönliche Erfahrungen + aktueller Wissensstand = Erfolg der Keimidentifizierung

42 5. Zusammenfassung

43 5. Zusammenfassung Beide nicht 100% fehlerfrei MALDI-TOF: 4 Fehler; geringer Zeitaufwand VITEK 2 Compact: 13 Fehler; lange Analysedauer Fazit: Verifizierung des MALDI-TOF erfolgreich

44 6. Ausblick

45 6. Ausblick Erweiterung der Datenbank beider Systeme Verbesserung der Identifizierungsmöglichkeiten Massenspektrometrie: sinnvolle Ergänzung zur biochemischen Identifizierung, aber momentan noch hohe Anschaffungskosten

46 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!