Vermehrung oder Eliminierung antibiotikaresistenter Bakterien in Biogasanlagen?

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1 Vermehrung oder Eliminierung antibiotikaresistenter Bakterien in Biogasanlagen? Prof. Dr. Dr.-Ing. Peter Kämpfer Dr. rer. nat. Stefanie P. Glaeser Msc. Thorsten Schauss Institut für Angewandte Mikrobiologie Justus-Liebig-Universität Gießen

2 Potentieller Transfer antibiotikaresistenter Bakterien aus der Landwirtschaft Eingangsproben: Gülle und Festmist aus intensiver Tierhaltung Biogasanlagen als technologische Barriere für pathogene und antibiotikaresistente Bakterien?? Ausgangsproben: Fermentierter Rückstand aus Biogasanlagen Pharmazeutika (Antibiotika) Futtermittelrückstände (Cu, Zn) Pathogene Bakterien Bakterielle Sporen Antibiotiaresistente Bakterien Resistenzgene Viren Pharmazeutika (Antibiotika) Futtermittelrückstände (Cu, Zn) Pathogene Bakterien Bakterielle Sporen Antibiotiaresistente Bakterien Resistenzgene Viren

3 Dargestellte Ergebnisse aus Untersuchungen von: 15 Biogasanlagen (BGA001-BGA015) Eingangsproben/Gärsubstrat (nur Gülle/Festmistanteil) Ausgangsproben/Gärrest

4 Vorkommen potentiell humanpathogener antibiotikaresistenter Bakterien in der Großtierhaltung Extended-Spectrum- Beta- Lactamase (ESBL)-tragende Enterobacteriaceae > Gram-negative Gammaproteobacteria > Klinisch relevant: Klebsiella pneumoniae und Escherichia coli Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) > Gram-positive Firmicutes > Klinisch relevant: Staphylococcus aureus Vancomycin-resistente Enterococcus spp. (VRE) saureus.mlst.ne t > Gram-positive Firmicutes > Klinisch relevant: Enterocccus faecalis, Enterococcus faecium efaecalis.mlst.net

5 ESBL Extended-Spectrum-Beta-Lactamasen Beta-Laktamasen: bakterielle Enzyme, hydrolysieren Laktam-Ringstrukturen der Antibiotika Punktmutationen in den enzymcodierenden Genen können Effektivität der Enzyme erhöhen (=Extended-Spectrum Beta-Laktamasen; ESBL) -> Hydrolysieren Cephalosporine (1. 4. Generation) Erstes ESBL Auftreten: SHV-2 in 1983 Klebsiella ozeanae Bisher 9 Familien an Beta-Laktamasen bekannt: TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB, GES, TLA, BES, OXA SHV-2 CTX-M CTX-M Dominierend nach TEM und SHV Zum ersten Mal beschrieben in 1992 Erfolgreiche/schnelle Verbreitung ->110 CTX-M Typen sind bekannt Paterson and Bonomo (2005) Clin. Microbiol. Rev. 218(4):

6 ESBL E. coli Populationen bei Mensch, domestizierten Tieren und Wildtieren ESBL tragende E. coli gleicher Sequenztypen wurden bei Menschen, Wildtieren und domestizierten Tieren detektiert Möglicher Transmission: Großtierhaltung Mensch Genomische DNA Plasmid mit ESBL Gen 1. E. coli Stamm 1 E. coli Stamm 1 2. Gunther et al. (2011) Frontiers in Microbiology 2(246): 1-13 E. coli Stamm 1 E. coli Stamm 2

7 ESBL tragende Enterobacteriaceae CHROMagar ESBL (MastDiagonistica) Genomische DNA Plasmid mit ESBL Gen Multiplex-PCR (Parallele Detektion verschiedener Gene) blashv (747 bp) blactx-m (593 bp) blatem (445 bp) Monstein et al. (2007) APMIS 115,

8 Detektionprinzip - ESBL, MRSA, VRE Detektion Direktplattierung vs. spezifischer Voranreicherung 10 g 1x Eingangs/Ausgangsproben 10 g 10 g 1x 1 g 2x 0.1 g 3x Serielle Verdünnung in 0.9% NaCl 1. Selektive Voranreicherung (Selektivmedium mit Antibiotika) 24 Stunden, 37 C Plattierung auf CHROMAgar TM ESBL, VRE, MRSA 24 Stunden, 37 C 2. Vereinzelungsausstrich CHROMAgar TM ESBL, VRE, MRSA 24 Stunden, 37 C 3. Screening einzelner Kolonien Nachweis von Resistenzgenen (Multiplex-PCRs) Phylogenetische Identifizierung: 16S rrna Gen

9 Ergebnisse der Direktplattierung auf CHROMAgar ESBL E. coli Direktplattierung auf CHROMAgar ESBL Erfassung koloniebildender Einheiten (KBE) Ergebnisse von 5 BGAs Beprobt 2012 Konzentration auf CHROMAgar ESBL kultivierbare Bakterien waren in Eingangsproben deutlich höher als im Gärrest. ESBL-E. coli (pink-gefärbte Kolonien) wurden nur in Eingangsproben detektiert. Phylogenetische Identifizierung: Pink gefärbte Kolonien: Spezifisch ESBL-E. coli Blaue Kolonien: Citrobacter, Enterobacter, aber auch Aeromonas (unspezifisch) Braun/Beige Kolonien: Größtenteils Pseudomonaden, Acinetobacter FAZIT: Spezifischer Nachweis, aber geringe Detektionseffizienz bei der Direktplattierung

10 Phylogenetische Identifizierung nach der Direktplattierung n=6 n=3 n=5 n=7 n=5 n=1 n=4 n=6 n=4 n=3 n: Anzahl analysierter unterschiedlicher Koloniemorphologien In schwarz dargestellt sind E. coli, alle E. coli trugen ein ESBL Gen Neben E. coli wurde nur ein Morganella sp. Isolat mit einem ESBL Gen detektiert.

11 Vergleich Direktplattierung Voranreicherung zur Detektion von ESBL E. coli auf CHROMAgar ESBL Pinke Kolonien repräsentieren ESBL-E. coli -> Obwohl der Nachweis bei der Direktplattierung nicht möglich war waren fast alle Proben nach Voranreicherung positiv.

12 ESBL E. coli Nachweis Vergleich der Direktplattierung und nach Voranreicherung February 2013/2014 April July/ August October BGA 001 BGA 015 CTX-M+TEM CTX-M TEM SHV SHV+TEM CTX-M+TEM CTX-M DP 1 10 g g g 4 DP 3 10 g g g 6 DP 3 10 g g g 1 2 DP 3 10 g g g 4 TX-M+TEM TX-M Input Input EM HV HV+TEM TX-M+TEM TX-M Output TEM EM SHV Output HV SHV+TEM HV+TEM Untersuchung von zwei BGAs (BGA001 und 015) zwischen Februar 2013 und Februar 2014 (4 Probenahmen) DP: Direktplatterung (aus 10 g) 10 g, 1g, 0.1 g = Mengen an Ausgangsmaterial das in den die Voranreicherung eingesetzt wurde Nummern in den Kästchen repräsentieren die Anzahlen von E. coli Kolonien die die oben genannten ESBL Gene trugen. Den Hauptanteil machten CTX-M Gene aus, zusätzlich detektierten TEM Gene sind vermutlich keine ESBL sondern chromosomal codierte TEM-1 Gene (vereinzelt bestätigt mit Sequenzdaten)

13 Abundanz verschiedener ESBL Gentypen bei E. coli Isolaten (BGA001 und BGA015) Fraction of E. coli with respective ESBL genes (%) n=72 n=40 n=57 n=8 100% 2 3 SHV+TEM 90% 4 SHV 80% 25 TEM 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 44 Input BGA Output BGA Input BGA Output BGA015 CTX-M Zusammenfassung aller isolierten und gescreenten E. coli Isolate aus BGA001 und BGA015 der Untersuchungen zwischen Februar 2013 und Februar 2014 Total: 176 Isolate

14 Auftreten verschiedener CTX-M Gruppen Zusammenfassung der Daten von BGA001 und BGA015 Analyse basiert auf 66 sequenzierten CTX-M Genen CTX-M-2 2% CTX-M-9 15% Input CTX-M-9 6% CTX-M-2 5% Output CTX-M-9 12% CTX-M-2 3% Total CTX-M-1 83% CTX-M-1 89% CTX-M-1 85% n = 48 CTX-M Gene n = 18 CTX-M Gene n = 66 CTX-M Gene CTX-M Gene der isolierten E. coli wurden waren aus der CTX-M-1 Gruppe (>80%), CTX-M-9 und 2 wurden mit geringer Abundanz nachgewiesen.

15 Nachweis Methicillin resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) CHROMagar MRSA (Mast Diagnostica) Multiplex-PCR Poulsen et al. (2003)

16 Nachweis Vancomycin resistenter Enterokokken (VRE) CHROMagar VRE (Mast Diagnostica) Multiplex-PCR 1: E. faecalis mit vana 4: E. faecium mit vanb Kariyama et al. (2008)

17 MRSA and VRE Screening nach Voranreicherung Feb April July MRSA BGA-1 BGA-15 Input x x Output Not investigated Input x x Output Input x x Output Multiplex-PCR Screening: meca positive (Methicillin-resistance), Kein Nachweis von MRSA Phyl. Identifikation (partielle 16S rrna Gensequenzierung): >99% Staphylococcus haemolyticus 100% Staphylococcus sciuri subsp. sciuri 100% Staphylococcus lentum VRE BGA-1 BGA-15 vana vanb vanc1 vana vanb vanc1 Input x x Feb Output Not investigated April July Input x x x Output x x x Input Output x Multiplex-PCR screening: vana, vanb, vanc1 Kein Nachweis von E. faecalis, E. faecium-vre Phyl. Identifikation (partielle 16S rrna Gensequenzierung) E. vikkiensis/e.pseudoavium/e.devriessei (vana) E. casseliflavus/e.gallinarum (vanb and/or vanc1) E. lemanii (vana)

18 Ergebniszusammenfassung Biogasanlagen eliminieren ESBL und VRE nicht vollständig Probenabhängig wurden ESBL-tragende E. coli und VRE in Eingangs- und Ausgangsproben von Biogasanlagen detektiert ESBL Gene wurden in Eingangs- und Ausgangsproben auch kultivierungsunabhängig detektiert MRSA konnten nicht nachgewiesen werden: meca tragende Staphylokokken wurden kultivierungsabhängig nur in zwei Eingangsproben nachgewiesen; kultivierungsunabhängig wurden meca Gene in Eingangs- und Ausgangsproben detektiert Eingangsprobe Ausgangsprobe

19 Ergebniszusammenfassung Input sample ESBL Output sample ESBL MRS VRE Potentielle Pathogene Bakterien VRE Pot. pathogeniebakteria