Seminar. Umweltforschung im Brennpunkt - Behandlung von Teeröl-Standorten. 8. Mai - 9. Mai 2014 Redoutensäle, Promenade 39, 4021 Linz

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1 Seminar Umweltforschung im Brennpunkt - Behandlung von Teeröl-Standorten 8. Mai - 9. Mai 2014 Redoutensäle, Promenade 39, 4021 Linz Thema: Erfassung des mikrobiellen Abbaus von PAK in einem kontaminierten Grundwasserleiter mittels Isotopen- und Laboruntersuchungen an BATRAPS Referentin: Dr. in Petra Bombach

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3 Erfassung des mikrobiellen Abbaus von PAK in einem kontaminierten Grundwasserleiter mittels Isotopen- und Laboruntersuchungen an BATRAPs Dr. Petra Bombach Fachtagung: Umweltforschung im Brennpunkt Behandlung von Teeröl-Standorten Linz, Standortsituation Gaswerksgelände (DE) Betrieb des Gaswerkes PAK: bis 36 mg/l Sauerstoffkonzentrationen: 3,6 9,9 mg/l Relevanz biologischer Schadstoffminderungsprozesse? SEITE 2

4 Mehrstufiges Untersuchungskonzept BATRAP s Labormikrokosmen Foto: A. Künzelmann Erkundung des mikrobiellen in situ-schadstoffabbaus für hthalin und Fluoren Quantifizierung der mikrobiellen Mineralisierung für hthalin, Fluoren, Phenanthren und Acenaphthen SEITE 3 BATRAP s B.Schmidt-Brücken 2006 Trägermaterial mikrobielle Besiedlung Träger von Tracersubstanz Geyer et al. (2005) Environ Sci Techn 39: Stelzer et al. (2006) Org Geochem 37: Bombach et al. (2010) Appl Microbiol Biotechnol 86: SEITE 4

5 Nutzung stabiler Isotope als Tracer -markierte Schadstoffe Natürliches Kohlenstoff- Isotopenverhältnis : 12 = 1:99 -O 2 -Biomasse SEITE 5 Konzept BATRAP s + -Substrat 1. Beladung mit isotopischmarkiertem Substrat ( ) 2. Exposition im Grundwasser Burkhard Schmidt-Brücken 3. Einbau des -Kohlenstoffes in die Biomasse O OOH OOH OOH H2N OH Fettsäuren Aminosäuren RNA DNA Bombach et al. (2010) Appl Microbiol Biotechnol 86: SEITE 6

6 Flu Flu/Phe/Ace GWM GWM F GWM B GWM D GWM E GWM G GWM A GWM H Flu Flu/Phe/Ace Flu Flu/Phe/Ace Flu Flu/Phe/Ace BATRAPs & Labormikrokosmen, zentraler Fahnenbereich BATRAPs & Labormikrokosmen, Fahnenrandbereich Einbau der BATRAPs SEITE 8

7 Analytik der BATRAPs Ausbau der BATRAPs nach 68 bzw. 100-tägiger Inkubation Extraktion der Biomasse: Aminosäuren G-MSD G IRMS SEITE 9 Identifizierung und Quantifizierung der Aminosäuren Analyse der -Anreicherung in den Aminosäuren Mikrobielle Besiedlung der BATRAPs Gaschromatographie-Massenspektrometrie der mikrobiellen Aminosäuren Abundance Abundanz TI: A65.D\data.ms 4e e+07 3e e+07 2e e+07 1e Time--> Retentionszeit [min] SEITE 10

8 Einheiten von Isotopenanalysen Isotopenverhältnisse werden in angegeben Probe x 1000 Standard 1 (Unterschied gegenüber einem internationalen Standard; in Tausendstel) 0 =1,11% (Standard) 1000 = 2,20 % SEITE 11 Nachweis des in situ-abbaus von hthalin Gaschromatographie-Isotopen-Massenspektrometrie -Gehalt der Aminosäuren in der aufgewachsenen Biomasse SEITE 12 AS ( ) Zentraler Fahnenbereich Fahnenrandbereich GWM UA A GWM UA B UA GWM 92009E RKB GWM 127F Alanin Glycin Threonin Serin Valin Leucin Isoleucin Prolin Asparagin Methionin Glutamin Phenylalanin Natürliche Kohlenstoffisotopensignaturen von Aminosäuren: 0 bis -74 Maximale Isotopenanreicherung: (entspricht 30 % -Gehalt) Tyrosin Lysin

9 Nachweis des in situ-abbaus von Fluoren Gaschromatographie-Isotopen-Massenspektrometrie -Gehalt der Aminosäuren in der aufgewachsenen Biomasse Zentraler Fahnenbereich Fahnenrandbereich Alanin Glycin Threonin Serin AS ( ) Valin Leucin Isoleucin Prolin Asparagin 900 Glutamin Phenylalanin 400 Tyrosin Lysin Natürliche Kohlenstoffisotopensignaturen von Aminosäuren: 0 bis -74 Maximale Isotopenanreicherung: (entspricht 4 % -Gehalt) SEITE -100 GWM 3 RKB 9 RKB 222 RKB 229 GWM GWM D GWM G GWM H Vergleichende Betrachtung der Abbauaktivität -Kohlenstoffgehalt extrahierter Aminosäuren (µg /BATRAP) Zentraler Fahnenbereich Fahnenrandbereich A B D E F G H hthalin- BATRAPs Fluoren- BATRAPs * 0,5 0,9 0,8 deutlich höherer Abbau von hthalin im Vergleich zu Fluoren SEITE 14

10 Mehrstufiges Untersuchungskonzept BATRAP s Labormikrokosmen Foto: A. Künzelmann Erkundung des mikrobiellen in situ-schadstoffabbaus für hthalin und Fluoren Quantifizierung der mikrobiellen Mineralisierung für hthalin, Fluoren, Phenanthren und Acenaphthen SEITE 15 Konzept Labormikrokosmen-Untersuchungen 1 Mikrobielle Besiedlung der BATRAPs Einbringung von BATRAPs beladen mit 12 -PAK Kultivierung der Mikroorganismen mit -markierten PAK O 2 sensitive Erfassung des Abbaus Bilanzierung der mikrobiellen Mineralisierung SEITE 16

11 Flu Flu/Phe/Ace GWM GWM F GWM B GWM D GWM E GWM G GWM A GWM H Flu Flu/Phe/Ace Flu Flu/Phe/Ace Flu Flu/Phe/Ace BATRAPs & Labormikrokosmen, zentraler Fahnenbereich BATRAPs & Labormikrokosmen, Fahnenrandbereich Umsetzung der Labormikrokosmen-Untersuchungen -hthalin -Fluoren -Phenanthren -Acenaphthen Grundwasser regelmäßiges Monitoring der Sauerstoffkonzentration regelmäßiges Monitoring der Entwicklung an O2 Inkubation bei 14 im Dunklen 2 Lebendansätze, 1 Totkontrolle in situ-nahe Bedingungen SEITE 18

12 Mineralisierung von hthalin kontinuierlich belastete Messstellen Zentraler Fahnenbereich O2 ( ) Inkubationszeit (d) intermittierend belastete Messstellen Fahnenrandbereich UA GWM A Kontrolle UA GWM B Kontrolle hohe Mineralisierung von hthalin SEITE 19 O2 ( ) UA GWM E Kontrolle RKB GWM 127F Kontrolle Inkubationszeit (d) Mineralisierung von Fluoren kontinuierlich belastete Messstellen Zentraler Fahnenbereich O2 ( ) O2 ( ) Inkubationszeit (d) intermittierend belastete Messstellen Fahnenrandbereich Inkubationszeit (d) GWM GWM 3 Kontrolle RKB GWM 9D Kontrolle RKB GWM 222G Kontrolle RKB GWM 229H Kontrolle generell hohe Mineralisierung von Fluoren Indizien für höhere Mineralisierung im Fahnenrandbereich SEITE 20

13 Bilanzierung der Mineralisierung PAK Herkunft BATRAP harakteristik Messstelle O2 (mg/(l*62d)) PAK- Umsatz (µg/(l*62d)) MW PAK- Umsatz (µg/(l*62d)) PAK- Mineralisierung (µg/(l*d)) MW PAK- Mineralisierung (µg/(l*d)) UA GWM A kont. bel. 6,8 3,4 3, ,0 3,5 328 Mineralisierung: UA GWM B kont. bel. 9,3 4,6 3, ,4 3, UA GWM E int. bel. 7,4 3,7 3, ,0 3,0 156 RKB GWM 127 F int. bel. 7,5 3,7 3, ,2 3,6 242 Flu GWM 3 GWM kont. bel. 1,1 0,7 0, ,3 0,9 21 RKB GWM 9 D kont. bel. 2,4 1,7 1, ,7 1,9 55 RKB GWM 222 G int. bel. 3,6 2,5 2, ,8 1,9 67 RKB GWM 229 H int. bel. 3,3 2,3 2, ,5 1,7 75 Phe GWM 3 kont. bel. 0,6 2,3 2, ,4 1,8 45 RKB GWM 9 D kont. bel. 0,4 1,8 2, ,6 2,4 30 RKB GWM 222 G int. bel. 0,7 2,7 2, ,5 2,0 39 RKB GWM 229 H int. bel. 1,0 4,1 3, ,9 3,7 120 Ace GWM 3 kont. bel. 0,5 1,6 1, ,4 1,4 20 RKB GWM 9 D kont. bel. 1,3 4,4 3, ,9 3,0 68 RKB GWM 222 G int. bel. 0,9 3,0 2, ,7 2,6 62 RKB GWM 229 H int. bel. 0,8 2,9 3, ,2 4,2 104 SEITE 21 -PAK + O 2 O 2 + H 2 O Mineralisierung: µg PAK l -1 d -1 + Protein-Stable Isotope Probing (SIP) zur Identifizierung der hthalinabbauer Extraction & Separation gel-based gel-free 1D 2-DE L-MS MALDI-MS pi 12 Time IPP SMM Int. Int MW MW large scale m/z low scale m/z m/z Int. Data analysis 98% 12 modifiziert nach Jehmlich et al. (2010) Nature Protocols 5(12): SEITE 22

14 harakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaften Metaproteomanalyse Dominanz von Burkholderiales, Actinomycetales und Rhizobiales SEITE 23 Herbst et al. (2012) Proteomics (18-19): * * Nachweis des aeroben PAK-Abbaus * * * * Burkholderiales als Keyplayer des aeroben hthalinabbaus identifiziert * * * -Einbau Herbst et al. (2012) Proteomics (18-19): SEITE 24

15 Zusammenfassung Wirksamkeit der biologischen Schadstoffminderung wurde am Standort qualitativ und quantitativ erfasst intensive biologische Abbauprozesse sowohl in den Fahnenrandbereichen als auch im Schadensherdbereich zum Teil höhere Abbauaktivitäten in den Fahnenrandbereichen als im Schadenherdbereich der hthalinabbau erfolgt schneller als der Abbau anderer PAKs SEITE 25 Zusammenfassung hohe Sauerstoffkonzentrationen begünstigen den mikrobiellen Schadstoffabbau Dominanz aerober Abbauprozesse Relevanz von Burkholderiales für hthalin-abbau nachgewiesen Mineralisierungsraten: µg PAK l -1 d -1 Auf Grundlage der nachgewiesenen mikrobiellen Abbauprozesse ist bei gleichbleibend hohen Sauerstoffkonzentrationen von einer kontinuierlichen, deutlichen Reduzierung der Schadstofffracht auszugehen. SEITE 26

16 Danksagung Thomas Brunner Hans H. Richnow arsten Vogt Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! SEITE 27