5. Auswertung. 6) SGSTGQWHSES Fibrin(ogen)α Faktor XIII. 7) IGEGQQHHLGG Fibrin(ogen)χ Faktor XIII

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1 5. Auswertung In diesem Teil der Diplomarbeit werden die Strukturen der Substrate des Faktors XIII und der Gewebetransglutaminasen mit Hilfe der Programme, die im Kapitel vier beschrieben wurden, ausgewertet. Dies gilt sowohl für die Primär-, die Sekundär- als auch für die Tertiärstrukturen. Dabei wird sich auf die Umgebungen der reaktiven Glutaminreste beschränkt. Bei den Primär- und Sekundärstrukturen bedeutet dies eine Anzahl von fünf Aminosäuren sowohl auf der C-terminalen als auch auf der N-terminalen Seite von dem reaktiven Glutaminrest (siehetabelle 5-1). 1) ATVHEQVGGPS Vitronectin Faktor XIII 2) LTSDLQAQSKG Vitronectin Faktor XIII 3) SDLQAQSKGNP Vitronectin Faktor XIII 4) KGNPEQTPVLK Vitronectin Faktor XIII 5) GSTGNQNPGSP Fibrin(ogen)α Faktor XIII 6) SGSTGQWHSES Fibrin(ogen)α Faktor XIII 7) IGEGQQHHLGG Fibrin(ogen)χ Faktor XIII 8)...EAQQIVQP Fibronectin Faktor XIII 9)...NQEQVSP α2-plasmininhibitor Faktor XIII 10)..ALWQFRSMI Phospholipase A2 Faktor XIII 11) VLSLSQSKVLP β-casein Faktor XIII 1) HQGLPQEVLNE α S1 -Casein Gewebetransglutaminase 2) KYKVPQLEIVP α S1 -Casein Gewebetransglutaminase 3) EGIHAQQKEPM α S1 -Casein Gewebetransglutaminase 4) MIGVNQELAYF α S1 -Casein Gewebetransglutaminase 5) DDKHYQKALNE α S2 -Casein Gewebetransglutaminase 6) LKKISQRYQKF α S2 -Casein Gewebetransglutaminase 7) LKTVYQHQKAM α S2 -Casein Gewebetransglutaminase 8) TVYQHQKAMKP α S2 -Casein Gewebetransglutaminase 9) KYIPIQYVLSR κ-casein Gewebetransglutaminase 10) LNYYQQKPVAL κ-casein Gewebetransglutaminase 11) PPKKNQDKTEI κ-casein Gewebetransglutaminase 12) EINTVQVTSTA κ-casein Gewebetransglutaminase 13) SFNPTQLEEQC β-lactoglobulin Gewebetransglutaminase 14) TQLEEQCHV++ β-lactoglobulin Gewebetransglutaminase 15) SNFNSQATNRN Lysozym Gewebetransglutaminase

2 16) DYGVLQINSRW Lysozym Gewebetransglutaminase 17) KGTDVQAWIRG Lysozym Gewebetransglutaminase 18) KPDPSQKQTFL Osteopontin Gewebetransglutaminase 19) DPSQKQTFLTP Osteopontin Gewebetransglutaminase 20) SCGFMQQIQKG Plasminogen Aktivator Gewebetransglutaminase Inhibitor-2 21) CGFMQQIQKGS Plasminogen Aktivator Gewebetransglutaminase Inhibitor-2 22) FMQQIQKGSYP Plasminogen Aktivator Gewebetransglutaminase Inhibitor-2 23) CSHLGQSYADR Procollagen III Gewebetransglutaminase 24) RSRFAQDVLN+ SecretoryVesicle-IV Gewebetransglutaminase 25) VAAEDQRPINY Nidogen Gewebetransglutaminase 26) GRPRHQGVMVG Actin Gewebetransglutaminase 27) IENEEQEYVQT LipocortinI Gewebetransglutaminase 28)...APQQEALP Osteonectin Gewebetransglutaminase 29)..APQQEALPD Osteonectin Gewebetransglutaminase 30) HTTNSQVRWEY Plasminogen Gewebetransglutaminase Tab. 5-1: Bekannte Reaktionsstellen mit Faktor XIII und Gewebetransglutaminasen Bei den Tertiärstrukturen wird die Größe der Umgebung durch den Radius, ausgehend vom reaktiven Glutamin, definiert. Dieser ist auf eine Länge von acht Ångstrom festgelegt. Eine Gegenüberstellung der Auswertungen von Substraten und der Transglutaminasen Faktor XIII und Gewebetransglutaminasen wird vorgenommen. 2

3 5.1. Die theoretische Ausgangslage Die Auswertungen der Primärstrukturen basieren auf der Nomenklatur von Schechter und Berger [1967] und auf einer Publikation von Coussons et al. [1992]. Die Nomenklatur von Schechter und Berger beschreibt die Wechselwirkungen zwischen einer Protease und ihrem Substrat. Bei diesen Wechselwirkungen wird in Betracht gezogen, daß die Aminosäuren des Substrats sich mit den umgebenden Aminosäuren des aktiven Zentrums der Protease in Wechselwirkung treten. Die Aminosäuren des Substrates werden mit dem Buchstaben P (P = Peptid) gekennzeichnet. Die umgebenden Bindungstaschen des Aktivzentrums werden mit dem Buchstaben S (S = Subsite) beschriftet. Die Numerierung erfolgt auf der N-terminalen Seite absteigend von maximal 8 bis 1 und auf der C-terminalen Seite von 1' bis maximal 8'. Die Position Null ist die Bindung, die von der Protease gespalten wird (siehe Abbildung 5-1). Abb. 5-1: Nomenklatur Schematische Darstellung der Schechter und Berger Coussons übernimmt die Struktur der Nomenklatur für die Substrate von Berger und Schechter für Substrate von Transglutaminasen. Aufbauend aber abweichend von der Nomenklatur werden die Aminosäuren bei Coussons um die reaktive Stelle (d.h. um den Glutaminrest) im Substrat ohne Buchstaben gekennzeichnet. 3

4 Sie werden von -5 bis +5 um den Glutaminrest durchnumeriert, wobei die Aminosäuren von -5 bis -1 auf der N-terminalen Seite des Glutamins liegen, die Aminosäuren von 1 bis 5 auf der C-terminalen Seite. Position 0 nimmt das Glutamin inne (siehe Abbildung 5-2). Abb. 5-2: Schematische Darstellung der Coussons Nomenklatur In den folgenden Auswertungen wird die Nomenklatur von Coussons verwendet. In einer Publikation aus dem Jahre 1992, in der er über Eigenschaften von Substraten der Gewebetransglutaminasen schrieb, machte Coussons folgende Feststellungen: 1. Es gibt keine offensichtliche Konsensussequenz bei den Sequenzen um die Reaktionsstellen. 2. Es gibt keine zuverlässige Methode um den Zugang einer Seitenkette zu einem Reaktionspartner aus den Sequenzdaten vorherzusagen. 3. Sterische Faktoren könnten entscheidend für die Reaktionsfähigkeit sein. 4. Ein Kriterium für die Reaktionsfähigkeit ist die Stellung des Glutaminrestes in einer sehr flexiblen Region des Proteins oder in einer strukturierten Region, in der der Glutaminrest dem Lösungsmittel ausgesetzt ist. 5. Eine wichtige Rolle bei der Reaktion eines Substrates mit Transglutaminase spielen positive Ladungen auf der C-terminalen Seite des Glutaminrestes. Die Aussagen eins, drei, vier und fünf sollen entweder verifiziert oder falsifiziert bzw. erweitert werden. 4

5 5.2. Auswertung der Literatur- und Datenbankrecherche In die Auswertung werden nur Substrate des Faktors XIII und der Gewebetransglutaminasen aufgenommen. Diese Transglutaminasen und deren Substrate sind am eingehendsten untersucht worden. Von diesen Enzymen sind auch die meisten Substrate bekannt. Im ersten Schritt werden die Informationen zu den Substraten, die als Glutamindonoren reagieren, aus der Literatur und aus der Datenbank Medline extrahiert. Dann wird in den Datenbanken SwissProt, PIR, PRF und PDB überprüft, von welchen dieser Substrate Primär- und / oder Tertiärstrukturen bekannt sind. Zwei Bedingungen müssen erfüllt sein, um ein Substrat auswerten zu können: 1. Es muß die Primärstruktur bekannt sein. 2. Es muß mindestens eine Position der Wechselwirkung des reaktiven Glutamins mit einer Transglutaminase bekannt sein. Viele Substrate können mit beiden Transglutaminasen reagieren. Da meistens nur bei einer Transglutaminase bekannt ist, an welcher Position des Substrates die Reaktion stattfindet, sind alle Transglutaminasen in Tabelle 5-3 eingeklammert, bei denen die Reaktionsstellen mit den Substraten nicht identifiziert sind. Eine Aufstellung über die Anzahl der gefundenen Strukturen der Substrate befinden sich in Tabelle 5-2a und Tabelle 5-2b, eine Übersicht der Substrate befindet sich in Tabelle 5-3. Die Substrate des Faktors XIII und der Gewebetransglutaminasen sind mit einer doppelten Linie in der Umrandung in Tabelle 5-3 voneinander abgegrenzt. 5

6 Bei den Transglutaminasen sind bei beiden die Primärstrukturen bekannt, aber nur bei Faktor XIII ist die Tertiärstruktur aufgeklärt. Für die Substrate ergeben sich folgende Werte: Korrespondierende Transglutaminasen Anzahl Primärstrukturen Anzahl Reaktionsstellen Faktor XIII Gewebetransglutaminasen = Faktor XIII + Gewebetransglutaminasen Tab. 5-2a: Aufstellung der Primärstrukturen der Substrate der Transglutaminasen Faktor XIII und der Gewebetransglutaminasen Korrespondierende Transglutaminasen Anzahl Tertiärstrukturen Anzahl Reaktionsstellen Faktor XIII Gewebetransglutaminasen 3 6 = Faktor XIII + Gewebetransglutaminasen 4 7 Tab. 5-2b: Aufstellung der Tertiärstrukturen der Substrate der Transglutaminasen Faktor XIII und der Gewebetransglutaminasen 6

7 Substrat Transglutaminase Aminosäurepositionen der Reaktionsstellen Tertiär- Struktur α2-antiplasmin Faktor XIII 2 Fibronectin Faktor XIII 3 Fragment β-casein Faktor XIII, 167 (Gewebetransglutaminase) Fibrinogen α Faktor XIII, 347, 385 Fragment (Gewebetransglutaminase) Fibrinogen χ Faktor XIII, 424 Fragment (Gewebetransglutaminase) Phospholipase A2 Faktor XIII, 4 bekannt (Gewebetransglutaminase) Vitronectin Faktor XIII, 73, 84, (Gewebetransglutaminase) α S1 -Casein Gewebetransglutaminase 13, 108, 130, 140 α S2 -Casein Gewebetransglutaminase 79, 169, 185, 187 κ-casein Gewebetransglutaminase 29, 45, 114, 163 β-lactoglobulin Gewebetransglutaminase 155, 159 bekannt Lysozym Gewebetransglutaminase 41, 57, 121 bekannt Osteopontin Gewebetransglutaminase 34, 36 Plasminogen Aktivator Gewebetransglutaminase 83, 84, 86 Inhibitor-2 Procollagen III Gewebetransglutaminase 14 Secretory Vesicle IV Gewebetransglutaminase 86 Lipocortin I Gewebetransglutaminase 18 Nidogen Gewebetransglutaminase 726 Osteonectin Gewebetransglutaminase 3, 4 Fragment Actin Gewebetransglutaminase, 41 bekannt (Faktor XIII) Plasminogen Gewebetransglutaminase, (Faktor XIII) 322 Tab. 5-3: Aufstellung aller Substrate die mit Faktor XIII oder die mit Gewebetransglutaminasen reagieren und deren Reaktionsstellen bekannt sind 7

8 In der Spalte Tertiärstruktur der Tabelle 5-3 bedeutet der Eintrag Fragment, daß die bekannte Reaktionsstelle außerhalb der aufgeklärten Teilstruktur des Moleküles ist. Die Substrate von Faktor XIII und von den Gewebetransglutaminasen werden auch separat betrachtet. 1. Faktor XIII (Tabelle 5-9) 2. Gewebetransglutaminasen (Tabelle 5-12) Bei den Auswertungen werden nicht nur die einzelnen Aminosäuren betrachtet, sondern auch Gruppierungen von Aminosäuren. Diese Gruppierungen sind: 1. hydrophil 2. hydrophob 3. ohne Vorzugsstellung 4. negativ geladen 5. positiv geladen 6. stark hydrophob Die Einordnung der Aminosäuren nach hydrophil, hydrophob und ohne Vorzugsstellung befindet sich in Tabelle 5-4. Die Beschreibung für die Einteilungen negativ geladen, positiv geladen und stark hydrophob befinden sich im anschließenden Text. 8

9 Aminosäure hydrophil hydrophob ohne Vorzugsstellung Alanin x Arginin x Asparagin x Asparaginsäure x Cystein x Glutamin x Glutaminsäure x Glycin x Histidin x Isoleucin x Leucin x Lysin x Methionin x Phenylalanin x Prolin x Serin x Threonin x Tryptophan x Tyrosin x Valin x Tab. 5-4: Zuordnungstabelle der Aminosäuren nach hydrophob, hydrophil und ohne Vorzugsrichtung [Fuchsbauer, 1998] Negativ geladen sind die Aminosäuren Asparaginsäure (Asp, D) und Glutaminsäure (Glu, E). Positiv geladen sind die Aminosäuren Arginin (Arg, R) und Lysin (Lys, K). Stark hydrophob sind die Aminosäuren Phenylalanin (Phe, F) und Tryptophan (Trp, W). 9

10 5.3. Gegenüberstellung der Aminosäureverteilung aller Proteine mit den Substraten In diesem Kapitel werden die ermittelten Werte für die Aminosäurenverteilung der Substrate mit der Aminosäurenverteilung aller Proteine (siehe Tabelle 5-5) verglichen. Durch diesen Vergleich wird ermittelt, ob es in den Umgebungen des reaktiven Glutamins signifikante Abweichungen gibt, die über bzw. unter der Häufigkeit der Aminosäureverteilung aller Proteine liegen. Diese Aminosäuren haben möglicherweise Einfluß auf die Reaktion. Die Prozentangaben der Verteilung der Tabelle 5-5 sollen als Referenzwerte fungieren. Aminosäure Pro zent Aminosäure Pro zent Alanin 9.0 Phenylalanin 3.5 Arginin 4.7 Prolin 4.6 Asparagin 4.4 Serin 7.1 Asparaginsäure 5.5 Threonin 6.0 Cystein 2.8 Tryptophan 1.1 Glutamin 3.9 Tyrosin 3.5 Glutaminsäure 6.2 Valin 6.9 Glycin 7.5 hydrophil 45.3 Histidin 2.1 hydrophob 38.9 Isoleucin 4.6 ohne 15.8 Vorzugsstell ung Leucin 7.5 negativ 11.7 geladen Lysin 7.0 positiv 11.7 geladen Methionin 1.7 stark hydrophob 4.6 Tab. 5-5: Abschätzung der Häufigkeit der Aminosäuren aus den Zusammensetzungen von 207 nicht verwandten Proteinen [Klapper, 1977] 10

11 Farbschemata der Tabellen: Gelb werden alle Tabellenpositionen bei den Aminosäuren gefärbt die eine Abweichung von 30% oder mehr unter dem Durchschnitt aufweisen. Gelb werden auch alle Positionen in den Zeilen hydrophil, hydrophob, ohne Vorzugsposition, negativ geladen, positiv geladen und stark hydrophob gefärbt, wenn eine Abweichung von mindestens 15% unter dem Durchschnitt vorliegt. Rot werden alle Tabellenpositionen der Aminosäuren gefärbt die eine Abweichung von 30% oder mehr über dem Durchschnitt aufweisen. Rot hervorgehoben werden die Zeilen hydrophil, hydrophob, ohne Vorzugsposition, negativ geladen, positiv geladen und stark hydrophob bei einer Abweichung von mindestens 15% über dem Durchschnitt. Tab. 5-6: Farbschema für die Tabellen 5-7, 5-10,

12 AS-Verteilung AS-Verteilung AS-Verteilung AS-Verteilung aller aller aller aller Proteine Umgebungen Differenz Verhältnis Umgebungen links Differenz Verhältnis Umgebungen rechts Differenz Verhältnis Aminosäure in Prozent in Prozent absolut in Prozent in Prozent absolut in Prozent in Prozent absolut in Prozent Alanin Arginin Aspargin Asparginsäure Cystein Glutamin Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Threonin Tryptophan Tyrosin Valin hydrophil hydrophob ohne Vorzugsstellung negativ geladen positiv geladen stark hydrophob Tab. 5-7: Aminosäureverteilung in allen Proteinen im Vergleich mit den Umgebungen aller Substrate von Faktor XIII und Gewebetransglutaminasen 12

13 Aminosäure Gesamt links rechts Alanin Arginin Asparaginsäure Cystein Tryptophan negativ geladen positiv geladen stark hydrophob Tab. 5-8a: Einträge bei Abweichungen von mindestens 30 Prozent unter dem Prozentsatz der Referenztabelle bei den einzelnen Aminosäuren bzw. bei deren Gruppierungen Aminosäure Gesamt links rechts Asparagin Glutamin Histidin Methionin Prolin Tryptophan Aminosäuren ohne Vorzugsstellung Tab. 5-8b: Einträge bei Abweichungen von mindestens 30 Prozent über dem Prozentsatz der Referenztabelle bei den einzelnen Aminosäuren bzw. bei deren Gruppierungen 13

14 Die wichtigsten Ergebnisse aus den Tabellen 5-8a und 5-8b des Vergleiches der Aminosäureverteilung in allen Proteinen mit der Verteilung der Aminosäuren der Substrate der Transglutaminasen lassen sich wie folgt zusammenfassen: 1. Arginin, eine Aminosäure mit positiver Ladung, tritt auf der N-terminalen Seite des reaktiven Glutamins in einer geringeren Anzahl auf. Diese Abweichung ist so stark, daß auch über den Gesamtbereich der Umgebung ein vermindertes Auftreten dieser Aminosäure berechnet wird. 2. Vermindert tritt Asparaginsäure auf, die eine negative Ladung besitzt. 3. Cystein, die einzige Aminosäure mit einer Thiolgruppe, ist in den Umgebungen seltener vorzufinden als in der Gesamtsequenz eines Proteins. Dies ist ein Hinweis dafür, daß keine Cystinbindungen in der Nähe des reaktiven Glutaminrestes vorkommen. 4. Die hydrophobe Aminosäure Tryptophan ist vermindert auf der linken Seite, sie ist aber auf der rechten Seite verstärkt präsent. 5. Durch die geringe Häufigkeit der Asparaginsäure auf der rechten Seite ergibt sich für die negative Ladung insgesamt eine Abweichung nach unten. 6. Die positive Ladung ist durch die geringe Anzahl von Arginin auf der linken Seite vermindert. 7. Die stark hydrophoben Gruppen sind durch den geringen Wert des Tryptophans auf der linken Seite vermindert. 8. Ein vermehrtes Auftreten von Glutamin in den Umgebungen ist erkennbar. Dies wird auch in von Aeschlimann und Paulsson [1994] beschrieben. 9. Histidin, das innerhalb des physiologischen ph-bereiches die Ladung wechseln kann, kommt häufiger in den Umgebungen vor. 10. Eine weitere Aminosäure die verstärkt in den Umgebungen auftritt ist Prolin. Sie erzwingt im Protein einen Wechsel der Sekundärstruktur. 14

15 Hier werden die Substrate des Faktors XIII betrachtet, deren Reaktionsstellen bekannt sind. Substrat Transglutaminase Aminosäurepositionen der Reaktionsstellen Tertiärstruktur α2-antiplasmin Faktor XIII 2 Fibronectin Faktor XIII 3 Fragment β-casein Faktor XIII, 167 (Gewebetransglutaminase) Fibrinogen α Faktor XIII, 347, 385 Fragment (Gewebetransglutaminase) Fibrinogen χ Faktor XIII, 424 Fragment (Gewebetransglutaminase) Phospholipase A2 Faktor XIII, 4 bekannt (Gewebetransglutaminase) Vitronectin Faktor XIII, (Gewebetransglutaminase) 73, 84, Tab. 5-9: Aufstellung aller Substrate die mit Faktor XIII reagieren und deren Reaktionsstellen bekannt sind 15

16 AS-Verteilung AS-Verteilung AS-Verteilung AS-Verteilung aller aller aller aller Proteine Umgebungen Differenz Verhältnis Umgebungen links Differenz Verhältnis Umgebungen rechts Differenz Verhältnis Aminosäure in Prozent in Prozent absolut in Prozent in Prozent absolut in Prozent in Prozent absolut in Prozent Alanin Arginin Aspargin Asparginsäure Cystein Glutamin Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Threonin Tryptophan Tyrosin Valin hydrophil hydrophob ohne Vorzugsstellung negativ geladen positiv geladen stark hydrophob Tab. 5-10: Aminosäureverteilung in allen Proteinen im Vergleich mit den Umgebungen aller Substrate von Faktor XIII 16

17 Aminosäure Gesamt links rechts Alanin Arginin Asparaginsäure Cystein Glutaminsäure Isoleucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Threonin Tyrosin Valin hydrophil hydrophob negativ geladen positv geladen stark hydrophob Tab. 5-11a: Einträge bei Abweichungen von mindestens 30 Prozent unter dem Prozentsatz der Referenztabelle bei den einzelnen Aminosäuren bzw. bei deren Gruppierungen 17

18 Aminosäure Gesamt links rechts Asparagin Glutamin Glutaminsäure Glycin Histidin Leucin Prolin Serin Threonin Tryptophan Aminosäuren ohne Vorzugsstellung Tab. 5-11b: Einträge bei Abweichungen von mindestens 30 Prozent über dem Prozentsatz der Referenztabelle bei den einzelnen Aminosäuren bzw. bei deren Gruppierungen Beim Faktor XIII werden nur elf Umgebungen betrachtet. Diese niedrige Anzahl an Umgebungen führt zu stärkeren Differenzen beim Vergleich. Eine statistische Signifikanz ist bei den wenigen Umgebungen nicht gewährleistet. Die Auswertung muß daher kritisch betrachtet werden. 18

19 Die Auswertungen im Einzelnen des Vergleiches zwischen der Aminosäureverteilung in allen Proteinen mit der Verteilung der Aminosäuren in den Substraten des Faktors XIII: 1. Sowohl Arginin als auch Lysin - die Aminosäuren mit positiven Ladungen - sind in der Umgebung des reaktiven Glutamins weniger häufig vertreten. Dies hat zur Folge, daß positive Ladungen weniger häufig in den Umgebungen vorkommen. 2. Tryptophan, eine stark hydrophobe Aminosäure, kommt fast doppelt so oft in den Umgebungen vor 3. Phenylalanin, eine stark hydrophobe Aminosäure, befindet sich vermindert in den Umgebungen. Damit ist auch der Anteil der stark hydrophoben Aminosäuren kleiner, obwohl Tryptophan in den Umgebungen häufiger vorkommt. 4. Die negativen Ladungen in den Umgebungen kommen seltener vor. Dies ist bedingt durch die geringe Anzahl an Asparaginsäure, aber auch durch Glutaminsäure auf der rechten Seite der Umgebung. Durch das verstärkte Auftreten der Glutaminsäure auf der linken Seite ist dort das Verhältnis der negativen Ladung ausgeglichen. 5. Die hydrophoben Aminosäuren sind auf der linken Seite weniger häufig. Dies wird durch die geringe Anzahl von Methionin und Isoleucin an dieser Stelle bewirkt. 6. Die hydrophilen Aminosäuren treten auf der rechten Seite in verminderter Anzahl auf. Dies wird hervorgerufen durch das geringere Auftreten der Aminosäuren Asparaginsäure, Glutaminsäure und Threonin auf dieser Seite. 7. Glutamin ist häufiger in den Umgebungen vertreten. 8. Histidin, das innerhalb des physiologischen ph-bereiches die Ladung wechseln kann, kommt häufiger in den Umgebungen vor. 9. Eine weitere Aminosäure die verstärkt in den Umgebungen auftritt ist Prolin. Sie erzwingt im Protein einen Wechsel der Sekundärstruktur. Obwohl sie auf der linken Seite eine geringere Anzahl hat, wird durch die hohe Anzahl auf der rechten Seite insgesamt eine vermehrtes Auftreten von Prolin in den Umgebungen festgestellt. 10. Sowohl Cystein als auch Tyrosin kommen in keiner Umgebung vor. 19

20 Substrat Transglutaminase Aminosäurepositionen der Tertiärstruktur Reaktionsstellen α S1 -Casein Gewebetransglutaminase 13, 108, 130, 140 α S2 -Casein Gewebetransglutaminase 79, 169, 185, 187 κ-casein Gewebetransglutaminase 29, 45, 114, 163 β-lactoglobulin Gewebetransglutaminase 155, 159 bekannt Lysozym Gewebetransglutaminase 41, 57, 121 bekannt Osteopontin Gewebetransglutaminase 34, 36 Plasminogen Aktivator Gewebetransglutaminase 83, 84, 86 Inhibitor-2 Procollagen III Gewebetransglutaminase 14 Secretory Vesicle IV Gewebetransglutaminase 86 Lipocortin I Gewebetransglutaminase 18 Nidogen Gewebetransglutaminase 726 Osteonectin Gewebetransglutaminase 3, 4 Fragment Actin Gewebetransglutaminase, 41 bekannt (Faktor XIII) Plasminogen Gewebetransglutaminase, (Faktor XIII, Plant Tgase) 322 Tab. 5-12: Aufstellung aller Substrate die mit Gewebetransglutaminasen reagieren und deren Reaktionsstellen bekannt sind 20

21 AS-Verteilung AS-Verteilung AS-Verteilung AS-Verteilung aller aller aller aller Proteine Umgebungen Differenz Verhältnis Umgebungen links Differenz Verhältnis Umgebungen rechts Differenz Verhältnis Aminosäure in Prozent in Prozent absolut in Prozent in Prozent absolut in Prozent in Prozent absolut in Prozent Alanin 9 5,8 3,2 64,7 4,1 4,9 46,0 7,5 1,5 83,1 Arginin 4,7 4,1 0,6 87,4 2,8 1,9 58,7 5,4 0,7 115,7 Aspargin 4,4 5,5 1,1 124,5 6,2 1,8 141,1 4,8 0,4 108,2 Asparginsäure 5,5 3,8 1,7 68,5 4,8 0,7 87,8 2,7 2,8 49,5 Cystein 2,8 1,7 1,1 61,1 2,1 0,7 73,9 1,4 1,4 48,6 Glutamin 3,9 6,5 2,6 166,9 6,2 2,3 159,2 6,8 2,9 174,4 Glutaminsäure 6,2 7,2 1,0 116,0 5,5 0,7 89,0 8,8 2,6 142,6 Glycin 7,5 5,1 2,4 68,5 6,2 1,3 82,8 4,1 3,4 54,4 Histidin 2,1 3,1 1,0 146,7 4,8 2,7 230,0 1,4 0,7 64,8 Isoleucin 4,6 5,1 0,5 111,7 5,5 0,9 120,0 4,8 0,2 103,5 Leucin 7,5 6,5 1,0 86,8 4,8 2,7 64,4 8,2 0,7 108,8 Lysin 7 8,2 1,2 117,4 8,3 1,3 118,3 8,2 1,2 116,6 Methionin 1,7 2,7 1,0 161,2 2,8 1,1 162,4 2,7 1,0 160,0 Phenylalanin 3,5 3,4 0,1 97,7 4,1 0,6 118,3 2,7 0,8 77,7 Prolin 4,6 7,2 2,6 156,3 8,3 3,7 180,0 6,1 1,5 133,0 Serin 7,1 5,5 1,6 77,2 6,9 0,2 97,2 4,1 3,0 57,5 Threonin 6 5,5 0,5 91,3 5,5 0,5 92,0 5,4 0,6 90,7 Tryptophan 1,1 1,0 0,1 93,6 0,0 1,1 0,0 2,0 0,9 185,5 Tyrosin 3,5 5,5 2,0 156,6 5,5 2,0 157,7 5,4 1,9 155,4 Valin 6,9 6,5 0,4 94,2 5,5 1,4 79,7 7,5 0,6 108,7 hydrophil 44,9 44,5 0,4 99,2 46,2 1,3 103,0 42,8 2,1 95,4 hydrophob 38,9 38,4 0,5 98,6 35,2 3,7 90,4 41,5 2,6 106,7 ohne Vorzugsstellung 15,8 17,1 1,3 108,4 18,6 2,8 117,9 15,6 0,2 99,0 negativ geladen 11,7 11,0 0,7 93,7 10,4 1,4 88,5 11,6 0,1 98,8 positiv geladen 11,7 12,3 0,6 105,4 11,0 0,7 94,4 13,6 1,9 116,2 stark hydrophob 4,6 4,5 0,1 96,7 4,1 0,5 90,0 4,8 0,2 103,5 Tab. 5-13: Aminosäureverteilung in allen Proteinen im Vergleich mit den Umgebungen aller Substrate von Gewebetransglutaminasen 21

22 Aminosäure Gesamt links rechts Alanin Arginin Asparaginsäure Cystein Glycin Histidin Leucin Serin Tryptophan Tab. 5-14a: Einträge bei Abweichungen von mindestens 30 Prozent unter dem Prozentsatz der Referenztabelle bei den einzelnen Aminosäuren bzw. bei deren Gruppierungen Aminosäure Gesamt links rechts Asparagin Glutamin Glutaminsäure Histidin Methionin Prolin Tryptophan Tyrosin ohne Vorzugsstellung positiv geladen Tab. 5-14b: Einträge bei Abweichungen von mindestens 30 Prozent über dem Prozentsatz der Referenztabelle bei den einzelnen Aminosäuren bzw. bei deren Gruppierungen 22

23 Aus den Tabellen 5-14a und 5-14b wird folgendes ersichtlich: 1. Arginin, eine Aminosäure mit positiver Ladung, ist auf der linken Seite der Umgebungen weniger häufig als in der Aminosäureverteilung aller Proteine. Diese geringe Häufigkeit kann aber durch die höhere Anzahl von Lysin kompensiert werden, so daß insgesamt ein ausgeglichenes Verhältnis bei den positiven Ladungen vorherrscht. Auf der rechten Seite ist sogar ein höherer Anteil an positiver Ladung zu verzeichnen, bewirkt durch den hohen Anteil an Glutaminsäure. 2. Vermindert tritt Asparaginsäure auf, die eine negative Ladung besitzt. Diese Verminderung negativer Ladung wird aber durch die erhöhte Anwesenheit der anderen Aminosäure mit negativer Ladung (Glutaminsäure) kompensiert. 3. Die stark hydrophobe Aminosäure Tryptophan ist nicht auf N-terminalen Seite vorhanden, sie ist aber auf der C-terminalen Seite fast doppelt so stark präsent wie in der Verteilung in allen Proteinen. 4. Ein verminderten Anteil hat auch Cystein. Damit sind auch Cystinbrücken in den Umgebungen unwahrscheinlicher. 5. Ein vermehrtes Auftreten von Glutamin in den Umgebungen ist erkennbar. Dies wird auch von Aeschlimann und Paulsson [1994] beschrieben. 6. Eine weitere Aminosäure, die verstärkt in den Umgebungen auftritt, ist Prolin. Sie erzwingt im Protein einen Wechsel der Sekundärstruktur. 7. Histidin, das innerhalb des physiologischen ph-bereiches die Ladung wechseln kann, kommt häufiger in den Umgebungen vor., dabei ist sie auf der rechten Seite in geringer Anzahl vorhanden. Durch den stark erhöhten Anteil auf der linken Seite wird dies aber überkompensiert. 23

24 5.4. Sequenzvergleich mit ClustalX Ein Vergleich der beiden Umgebungen des reaktiven Cysteins der beiden Transglutaminasen erbringt folgendes Ergebnis: Zu erkennen sind auf Abbildung 5-3 Identität der Aminosäuren der beiden Umgebungen auf fast allen Positionen. Die einzigen Ausnahmen sind Position zwei (entspricht Position minus vier nach der Coussons-Nomenklatur) und Position elf (entspricht Position plus fünf nach der Coussons-Nomenklatur). Auf Position zwei sind die Aminosäuren homolog. Ähnliche Umgebungen bei den Enzymen lassen ähnliche Umgebungen in der Primärstruktur bei den reaktiven Stellen der Substrate vermuten. Abb. 5-3: Sequenzvergleich der Umgebungen des reaktiven Cysteinrestes der Meerschweinchenlebertransglutaminase (MTG) und des Faktors XIII (FXIII) mit dem Programm ClustalX Die Farbgebungen der Positionen sind der Beschreibung des Programmes im Kapitel zu entnehmen. Beim Vergleich der Umgebungen der reaktiven Glutaminreste der Substrate von Faktor XIII sind keine Gemeinsamkeiten zu erkennen. Als weitere Gruppe werden die Umgebungen der reaktiven Glutaminreste der Substrate der Gewebetransglutaminasen miteinander verglichen. Hier kann ein verstärktes Auftreten hydrophober Aminosäuren an den Positionen 2, +3 und +5 vom reaktiven Glutaminrest beobachtet werden (siehe Abbildung 5-4). Auch in der gemeinsamen Gruppe von Substraten des Faktors XIII und der Gewebetransglutaminasen sind keine Übereinstimmungen festgestellt worden. 24

25 Abb. 5-4: Sequenzvergleich der Umgebungen der Substrate der Gewebetransglutaminasen mit dem Programm ClustalX 25

26 5.5. Anzahl und Anteil der Aminosäuren auf den Positionen der Umgebungen In Abweichung zum vorherigen Kapitel werden in diesem Abschnitt keine Vergleiche in den Aminosäurenverteilungen interpretiert, vielmehr wird die Anzahl der Aminosäuren auf den einzelnen Positionen betrachtet. Gesondert von den Umgebungen der Substrate werden die Umgebungen der Transglutaminasen betrachtet C Σ Meerschweinchenlebertransglutaminase V K Y G Q C W V F A A Faktor XIII V R Y G Q C W V F A G hydrophil hydrophob ohne Vorzugsstellung negativ geladen positiv geladen 2 2 stark hydrophob Tab. 5-15: Auswertung der Umgebungen der reaktiven Stellen der Transglutaminasen Durch die Summierung ist der hydrophobe Charakter der Umgebungen deutlich zu erkennen. Die hydrophoben Aminosäuren machen über 50 Prozent aller Aminosäuren aus. Besonders die C-terminale Seite hat sehr viele hydrophobe und stark hydrophobe Aminosäuren. Hier beträgt der Anteil der hydrophoben Aminosäuren 90 Prozent. Die N-terminale Seite hingegen hat ein schwach hydrophilen Charakter. Hervorzuheben ist noch die positive Ladung an Position minus vier. Sollten Ladungen bei den Wechselwirkungen zwischen Enzym und Substrat eine wichtige Rolle spielen, so wäre auf der Position minus vier bzw. vier bei den Umgebungen der Substrate eine negative Ladung zu vermuten. 26

27 Vor der Auswertung werden die Umgebungen der Substrate in tabellarischer Form aufgeführt. Die Auswertungen der Substrate sind wiederum in Tabellenform zusammengefaßt. Dabei gilt folgendes Farbschema (Tabelle 5-16): Gelb werden alle Tabellenpositionen gefärbt, die den Wert Null haben. Dies gilt nicht für Tabelle In den Spalten Summe und deren prozentualer Anteil werden alle Positionen gelb markiert, die 75 oder mehr Prozent vom Maximalwert in diesen Spalten abweichen. Rot werden alle Tabellenpositionen gefärbt, die einen prozentualen Wert größer gleich zehn haben. Bei Tabelle 5-19 muß dieser Wert größer gleich fünfzehn sein. In den Spalten Summe und deren prozentualer Anteil werden alle Positionen rot markiert, die 25 oder weniger Prozent vom Maximalwert in diesen Spalten abweichen. Blau werden alle Tabellenpositionen in den Zeilen hydrophob, hydrophil gefärbt, wenn die Differenz zwischen hydrophil und hydrophob größer 25 % ist. Hellblau werden alle Tabellenpositionen in den Zeilen hydrophob, hydrophil gefärbt, wenn die Differenz zwischen hydrophil und hydrophob größer zehn Prozent ist. Bei der Tabelle 5-19 muß dieser Wert größer 15 % sein. Grün werden alle Tabellenpositionen in den Zeilen negativ, positiv geladen gefärbt, wenn die Differenz zwischen negativer und positiver Ladung größer zehn Prozent ist. Bei der Tabelle 5-19 muß dieser Wert größer 25 % sein. Hellgrün werden alle Tabellenpositionen in den Zeilen negativ, positiv geladen gefärbt, wenn die Differenz zwischen negativer und positiver Ladung größer fünf Prozent ist. Bei der Tabelle 5-19 muß dieser Wert größer 15 % sein. Grau werden alle Tabellenpositionen in den Zeilen hydrophob, hydrophil, negativ und positiv geladen gefärbt, wenn die Werte identisch sind. Hellgrau werden alle Tabellenpositionen in den Zeilen hydrophob, hydrophil, negativ und positiv geladen gefärbt, wenn die Werte fast identisch sind, d.h. wenn eine Abweichung zwischen hydrophob und hydrophil bzw. zwischen positiv und negativ geladen kleiner gleich drei Prozent besteht. Bei der Tabelle 5-19 kann dieser Wert kleiner gleich zehn Prozent sein. Tab. 5-16: Farbschema für die Tabellen 5-17, 5-19 und 5-21 Umgebungen der Reaktionsstellen der Substrate des Faktors XIII und der Gewebetransglutaminasen (siehe Tabelle 5-1) 27

28 Position -5 % -4 % -3 % -2 % -1 % Q +1 % +2 % +3 % +4 % +5 % Σ % Aminosäure Alanin (A) Arginin (R) Asparagin (N) Asparaginsäure (D) Cystein (C) Glutamin (Q) Glutaminsäure (E) Glycin (G) Histidin (H) Isoleucin (I) Leucin (L) Lysin (K) Methionin (M) Phenylalanin (F) Prolin (P) Serin (S) Threonin (T) Tryptophan (W) Tyrosin (Y) Valin (V) Summe AS hydrophil hydrophob ohne Vorzugsstellung negativ geladen positiv geladen stark hydrophob Tab. 5-17: Anzahl und Anteil der Aminosäuren auf den Positionen (Umgebungen der Substrate des Faktors XIII und der Gewebetransglutaminasen) 28

29 Bei der Auswertung der Tabelle werden die einzelnen Positionen betrachtet. Spezielle Aminosäuren werden gesondert bewertet. Diese Vorgehensweise gilt auch für die Auswertungen der Tabellen 5-19 und Position minus fünf ist deutlich hydrophil. Geladene Aminosäuren sind stark vertreten, aber in fast gleicher Anzahl. Nicht vertreten auf dieser Position sind Asparagin, Glutamin, Tryptophan und Tyrosin. 2. Position minus vier ist hydrophil, aber nicht so stark ausgeprägt wie Position minus fünf. Die Ladungen treten hier auch weniger stark auf als auf Position minus fünf. Sie gleichen sich auf dieser Position vollständig aus. Hier sind weder Histidin noch Tryptophan vorhanden. 3. Position minus drei ist wiederum hydrophil, hier dominiert die positive Ladung. Auf dieser Position gibt es weder Cystein noch Methionin noch Tryptophan. 4. Position minus zwei ist hydrophob geprägt. Der hydrophobe Anteil stammt überwiegend von den aliphatischen Aminosäuren Leucin und Valin sowie vom Prolin. Die Aminosäuren mit negativer Ladungen sind auf dieser Position in der Überzahl. Nicht vertreten auf dieser Position sind Cystein, Serin und Tryptophan. 5. Position minus eins wird durch die überwiegende negative Ladung geprägt. Hydrophilie und Hydrophobie sind an dieser Stelle fast ausgeglichen. Auf dieser Position gibt es weder Arginin noch Cystein noch Phenylalanin. 6. Position plus eins ist mit Position minus fünf vergleichbar. Auch hier dominieren die hydrophilen Aminosäuren und das Verhältnis der Ladungen ist auf hohem Niveau ausgeglichen. Im Gegensatz dazu fehlen auf dieser Position Methionin und Prolin. 7. Position plus zwei ist durch die überwiegende positive Ladung geprägt. Hydrophile und hydrophobe Aminosäuren sind in fast gleicher Anzahl auf dieser Position vorhanden. Hier sind weder Asparaginsäure noch Cystein noch Methionin vorhanden. 8. Position plus drei ist stark hydrophob dominiert. Ladungen spielen hier keine Rolle. Auf dieser Position fehlen Arginin, Asparaginsäure, Cystein, Histidin, Phenylalanin, Prolin und Tyrosin. 29

30 9. Position plus vier ist hydrophil geprägt. Die Aminosäuren mit positiven Ladungen überwiegen. Auf dieser Position gibt es weder Cystein, Histidin, Isoleucin noch Tryptophan. 10. Position plus fünf ist Position plus drei ähnlich, nur ist hier der hydrophobe Anteil nicht so stark ausgeprägt. Der hydrophobe Anteil stammt größtenteils vom Prolin, welches auf dieser Position über einen Viertel der Aminosäuren stellt. Nicht vertreten auf dieser Position sind Glutamin, Histidin und Valin. 11. Die negativen Ladungen stammen zum überwiegenden Teil von Glutaminsäure. 12. Die positiven Ladungen stammen zum überwiegenden Teil vom Lysin. 13. Die stark hydrophoben Gruppen sind in geringer Anzahl in den Umgebungen vorhanden. 14. Auf den Positionen minus drei bis plus vier sind keine Cysteinreste zu finden, die Cystinbrücken bilden können. 15. Glutamin und Glutaminsäure treten verstärkt in der direkten Umgebung des reaktiven Glutaminrestes auf. 16. Der Anteil an Lysin ist gehäuft auf den Positionen minus fünf, minus drei, plus eins, plus zwei und plus vier. Auf den Positionen minus drei, plus zwei und plus vier führt dies zu einer Dominanz positiver Ladung. 17. Prolin hat einen hohen Anteil an den Positionen minus zwei und plus zwei sowie einen sehr hohen Anteil an der Position plus fünf. Prolin ist durch seine Struktur häufig für einen Wechsel der Sekundärstruktur verantwortlich. 30

31 Umgebungen der Reaktionsstellen der Substrate des Faktors XIII 1) ATVHEQVGGPS Vitronectin Faktor XIII 2) LTSDLQAQSKG Vitronectin Faktor XIII 3) SDLQAQSKGNP Vitronectin Faktor XIII 4) KGNPEQTPVLK Vitronectin Faktor XIII 5) GSTGNQNPGSP Fibrin(ogen)α Faktor XIII 6) SGSTGQWHSES Fibrin(ogen)α Faktor XIII 7) IGEGQQHHLGG Fibrin(ogen)χ Faktor XIII 8)...EAQQIVQP Fibronectin Faktor XIII 9)...NQEQVSP α2-plasmininhibitor Faktor XIII 10)..ALWQFRSMI Phospholipase A2 Faktor XIII 11) VLSLSQSKVLP β-casein Faktor XIII Tab. 5-18: Bekannte Reaktionsstellen der Substrate des Faktors XIII 31

32 Position -5 % -4 % -3 % -2 % -1 % Q +1 % +2 % +3 % +4 % +5 % Σ % Aminosäure Alanin (A) Arginin (R) Asparagin (N) Asparaginsäure (D) Cystein (C) Glutamin (Q) Glutaminsäure (E) Glycin (G) Histidin (H) Isoleucin (I) Leucin (L) Lysin (K) Methionin (M) Phenylalanin (F) Prolin (P) Serin (S) Threonin (T) Tryptophan (W) Tyrosin (Y) Valin (V) Summe AS hydrophil hydrophob ohne Vorzugsstellung negativ geladen positiv geladen stark hydrophob Tab. 5-19: Anzahl und Anteil der Aminosäuren auf den Positionen (Umgebungen der Substrate des Faktors XIII) 32

33 Die Auswertung dieser Tabelle weicht durch die geringe Anzahl an Umgebungen und der damit verbundenen geringen Anzahl an Aminosäuren von den Auswertungen der Tabellen 5-17 und 5-21 ab. Da nur 101 Aminosäuren zur Auswertung zur Verfügung stehen, müssen selbst bei einer vollkommenen Gleichverteilung der Aminosäuren 99 der 200 möglichen Positionen (zwanzig Aminosäuren mit jeweils zehn Positionen) unbesetzt bleiben. Eine Gelbfärbung und eine Beschreibung der unbesetzten Positionen wird deshalb unterlassen. Weiterhin macht eine Abweichung von nur einer Aminosäure zwischen den Positionen eine prozentuale Abweichung von mindestens neun Prozent aus. Die statistische Signifikanz dieser Auswertung ist damit nicht gegeben. 1. Position minus fünf hat weder einen überwiegend hydrophoben oder hydrophilen Anteil noch ist die Anzahl der Aminosäuren mit Ladungen stärker ausgeprägt. 2. Position minus vier ist stark hydrophil ausgeprägt. Auch hier ist keine Ausprägung der Ladung zu erkennen. 3. Position minus drei ist wiederum hydrophil, wenn auch nicht so stark wie Position minus vier. Auch hier sind Ladungen in geringer Anzahl vertreten. 4. Position minus zwei ist fast ausgeglichen in den hydrophilen und hydrophoben Anteilen. Die Aminosäuren mit negativer Ladungen sind auf dieser Position in der Überzahl. 5. Position minus eins hat dieselben Charakteristika wie Position minus vier. 6. Position plus eins ist sowohl bei den Anteilen der hydrophilen und hydrophoben Aminosäuren als auch bei den Anteilen der Aminosäuren mit negativer bzw. positiver Ladung fast ausgeglichen. 7. Position plus zwei ist durch die überwiegende positive Ladung geprägt. Hydrophile Aminosäuren sind in höherer Anzahl auf dieser Position vorhanden. 8. Position plus drei ist hydrophob dominiert. Ladungen sind auf dieser Position nicht vorhanden. 9. Position plus vier hat sowohl bei den den hydrophilen und hydrophoben Aminosäuren als auch bei den den Aminosäuren mit negativer bzw. positiver Ladung identische Anteile. 33

34 10. Position plus fünf ist Position plus drei ähnlich, nur ist hier der hydrophobe Anteil stärker ausgeprägt. Der hydrophobe Anteil stammt größtenteils vom Prolin, welches auf dieser Position fast die Hälfte der Aminosäuren stellt. 11. Die negativen Ladungen auf allen Positionen stammen zum überwiegenden Teil von Glutaminsäure. 12. Die positiven Ladungen stammen zum überwiegenden Teil vom Lysin. 13. Die stark hydrophoben Gruppen sind in geringer Anzahl in den Umgebungen vorhanden. 14. Cystein und Tyrosin sind nicht in den Umgebungen vorzufinden. 15. Glutamin und Glutaminsäure treten etwas verstärkter in der direkten Umgebung des reaktiven Glutaminrestes auf. 16. Der Anteil an Lysin ist gehäuft auf der Position plus zwei. Auf dieser Position führt dies zu einer Dominanz positiver Ladung. 17. Prolin hat einen hohen Anteil an der Position plus zwei sowie einen sehr hohen Anteil an der Position plus fünf. Prolin ist durch seine Struktur häufig für einen Wechsel der Sekundärstruktur verantwortlich. 34

35 Umgebungen der Reaktionsstellen der Substrate der Gewebetransglutaminasen 1) HQGLPQEVLNE α S1 -Casein Gewebetransglutaminase 2) KYKVPQLEIVP α S1 -Casein Gewebetransglutaminase 3) EGIHAQQKEPM α S1 -Casein Gewebetransglutaminase 4) MIGVNQELAYF α S1 -Casein Gewebetransglutaminase 5) DDKHYQKALNE α S2 -Casein Gewebetransglutaminase 6) LKKISQRYQKF α S2 -Casein Gewebetransglutaminase 7) LKTVYQHQKAM α S2 -Casein Gewebetransglutaminase 8) TVYQHQKAMKP α S2 -Casein Gewebetransglutaminase 9) KYIPIQYVLSR κ-casein Gewebetransglutaminase 10) LNYYQQKPVAL κ-casein Gewebetransglutaminase 11) PPKKNQDKTEI κ-casein Gewebetransglutaminase 12) EINTVQVTSTA κ-casein Gewebetransglutaminase 13) SFNPTQLEEQC β-lactoglobulin Gewebetransglutaminase 14) TQLEEQCHV++ β-lactoglobulin Gewebetransglutaminase 15) SNFNSQATNRN Lysozym Gewebetransglutaminase 16) DYGVLQINSRW Lysozym Gewebetransglutaminase 17) KGTDVQAWIRG Lysozym Gewebetransglutaminase 18) KPDPSQKQTFL Osteopontin Gewebetransglutaminase 19) DPSQKQTFLTP Osteopontin Gewebetransglutaminase 20) SCGFMQQIQKG Plasminogen Aktivator Gewebetransglutaminase Inhibitor-2 21) CGFMQQIQKGS Plasminogen Aktivator Gewebetransglutaminase Inhibitor-2 22) FMQQIQKGSYP Plasminogen Aktivator Gewebetransglutaminase Inhibitor-2 23) CSHLGQSYADR Procollagen III Gewebetransglutaminase 24) RSRFAQDVLN+ SecretoryVesicle-IV Gewebetransglutaminase 25) VAAEDQRPINY Nidogen Gewebetransglutaminase 26) GRPRHQGVMVG Actin Gewebetransglutaminase 27) IENEEQEYVQT LipocortinI Gewebetransglutaminase 28)...APQQEALP Osteonectin Gewebetransglutaminase 29)..APQQEALPD Osteonectin Gewebetransglutaminase 30) HTTNSQVRWEY Plasminogen Gewebetransglutaminase Tab. 5-20: Bekannte Reaktionsstellen der Substrate der Gewebetransglutaminasen 35

36 Position -5 % -4 % -3 % -2 % -1 % Q +1 % +2 % +3 % +4 % +5 % Σ % Aminosäure Alanin (A) Arginin (R) Asparagin (N) Asparaginsäure (D) Cystein (C) Glutamin (Q) Glutaminsäure (E) Glycin (G) Histidin (H) Isoleucin (I) Leucin (L) Lysin (K) Methionin (M) Phenylalanin (F) Prolin (P) Serin (S) Threonin (T) Tryptophan (W) Tyrosin (Y) Valin (V) Summe AS hydrophil hydrophob ohne Vorzugsstellung negativ geladen positiv geladen stark hydrophob Tab. 5-21: Anzahl und Anteil der Aminosäuren auf den Positionen (Umgebungen der Substrate der Gewebetransglutaminasen) 36

37 Die Auswertungen der Tabelle 5-17 und der Tabelle 5-21 sind fast identisch. Dies gilt nicht für Position plus zwei und die Anzahl der unbesetzten Positionen. Auf Position plus zwei sind die Ladungen in den Umgebungen des reaktiven Glutaminrests der Substrate der Gewebetransglutaminasen gleich stark vorhanden. Weiterhin fehlt zusätzlich auf dieser Position Serin. Die weiteren unbesetzten Positionen werden in der untenstehenden Liste aufgeführt. 1. Position minus fünf ist deutlich hydrophil. Geladene Aminosäuren sind stark vertreten, aber in fast gleicher Anzahl. Nicht vertreten auf dieser Position sind Alanin, Asparagin, Glutamin, Tryptophan und Tyrosin. 2. Position minus vier ist hydrophil, aber nicht so stark ausgeprägt wie Position minus fünf. Die Ladungen treten hier auch weniger stark auf als auf Position minus fünf. Sie gleichen sich auf dieser Position vollständig aus. Hier sind weder Histidin noch Tryptophan vorhanden. 3. Position minus drei ist wiederum hydrophil, hier dominiert die positive Ladung. Auf dieser Position gibt es weder Cystein noch Glutaminsäure noch Methionin noch Tryptophan. 4. Position minus zwei ist hydrophob geprägt. Der hydrophobe Anteil stammt überwiegend von den aliphatischen Aminosäuren Leucin und Valin sowie vom Prolin. Die Aminosäuren mit negativer Ladungen sind auf dieser Position in der Überzahl. Nicht vertreten auf dieser Position sind Cystein, Glycin, Serin und Tryptophan. 5. Position minus eins wird durch die überwiegende negative Ladung geprägt. Hydrophilie und Hydrophobie sind an dieser Stelle fast ausgeglichen. Auf dieser Position gibt es weder Arginin noch Cystein noch Phenylalanin noch Tryptophan. 6. Position plus eins ist mit Position minus fünf vergleichbar. Auch hier dominieren die hydrophilen Aminosäuren und das Verhältnis der Ladungen ist auf hohem Niveau ausgeglichen. Im Gegensatz dazu fehlen auf dieser Position Asparagin, Methionin, Phenylalanin, Prolin und Tryptophan. 7. Position plus drei ist stark hydrophob dominiert. Ladungen spielen hier keine Rolle. Auf dieser Position fehlen Arginin, Asparaginsäure, Cystein, Glycin, Histidin, Phenylalnin, Prolin und Tyrosin. 37

38 8. Position plus vier ist hydrophil geprägt. Die Aminosäuren mit positiven Ladungen überwiegen. Auf dieser Position gibt es weder Cystein, Histidin, Isoleucin, Methionin noch Tryptophan. 9. Position plus fünf ist Position plus drei ähnlich, nur ist hier der hydrophobe Anteil nicht so stark ausgeprägt. Der hydrophobe Anteil stammt größtenteils vom Prolin, welches auf dieser Position über einen Viertel der Aminosäuren stellt. Nicht vertreten auf dieser Position sind Glutamin, Histidin, Lysin und Valin. 10. Die negativen Ladungen stammen zum überwiegenden Teil von Glutaminsäure. 11. Die positiven Ladungen stammen zum überwiegenden Teil vom Lysin. 12. Die stark hydrophoben Gruppen sind in geringer Anzahl in den Umgebungen vorhanden. 13. Auf den Positionen minus drei bis plus vier sind keine Cysteinreste zu finden, die Cystinbrücken bilden können. 14. Glutamin und Glutaminsäure treten verstärkt in der direkten Umgebung des reaktiven Glutaminrestes auf. 15. Der Anteil an Lysin ist gehäuft auf den Positionen minus fünf, minus drei, plus eins, plus und plus vier. Auf den Positionen minus drei, plus zwei und plus vier führt dies zu einer Dominanz positiver Ladung. 16. Prolin hat einen hohen Anteil an den Positionen minus zwei und plus zwei sowie einen sehr hohen Anteil an der Position plus fünf. Prolin ist durch seine Struktur häufig für einen Wechsel der Sekundärstruktur verantwortlich. 38