.2 Zellpolarität in der Frühentwicklung 441 Abb..1 Lebenszyklus von C. elegans. a Die Entwicklung vom befruchteten Ei bis zum adulten Wurm ist bei 25 C nach knapp zwei Tagen abgeschlossen. Während der ersten 12 Stunden entstehen 558 Zellen, die alle Gewebe und Organe des Wurms bilden. In den nächsten 1 1 /2 Tagen verdoppelt sich in etwa die Zellzahl und die Zellen werden größer. Dadurch werden vier Häutungen notwendig. Unter widrigen Umweltbedingungen kann das Stadium L2 in eine Dauerlarve übergehen, die in der weiteren Entwicklung das Stadium L3 überspringt. b Der Hermaphrodit produziert einige Hundert Nachkommen und hat wie das seltene Männchen (c) eine Lebenserwartung von 2-3 Wochen. Bei b und c ist unten anterior und rechts ventral. [nach Schierenberg und Cassada, 1986].2 Zellpolarität in der Frühentwicklung In diesem Kapitel werden wir zunächst einen Überblick zur frühen Embryonalentwicklung geben, und dann die Gene behandeln, deren Aktivität die asymmetrischen Zellteilungen herbeiführen. Das Prinzip der frühen Trennung von Keimbahn und Soma und das der determinierten Entwicklung aufgrund ungleicher Verteilung von Zytoplasmafaktoren hatte Theodor Boveri Anfang des letzten Jahrhunderts beim Pferdespulwurm Ascaris megalocephala gefunden. Beides wurde für C. elegans bestätigt. aus: Janning u.a., Genetik (ISBN 97831317724) f 2008 Georg Thieme Verlag KG
442 Der Nematode Caenorhabditis elegans Der frühe Zellstammbaum von C. elegans ist in Abb..2 dargestellt. Die erste asymmetrische Teilung der Zygote P 0 trennt die Keimbahnzelle P 1 von der ersten somatischen Gründerzelle AB. Aus der Teilung von P 1 entsteht die Somazelle EMS und die Keimbahnzelle P 2. Die asymmetrische Teilung von EMS ergibt die beiden somatischen Gründerzellen MS und E, während die Teilung von P 2 und nachfolgend von P 3 zu den Soma-Gründerzellen C und D führen. Nach nur fünf asymmetrischen Zellteilungen sind somit fünf somatische Gründerzellen AB, MS, E, C und D und die Urkeimzelle P 4 entstanden, die ein invariables Entwicklungsprogramm durchlaufen. Dies wird durch die Farbgebung in Abb..2 hervorgehoben. Die Keimbahnzellen sind ausgezeichnet durch den Besitz von submikroskopisch sichtbaren Pol- oder P-Granula, wie sie auch bei vielen anderen Organismen als Kennzeichen der Keimbahn vorkommen (z.b. bei Drosophila, s. Abb. 21.3, S. 347). Aber auch die Positionen der Zellen im sich entwickelnden Embryo sind festgelegt. Wie aus der Namensgebung der ersten Nachkommen der AB-Zelle hervorgeht, teilt sich diese Zelle in eine ABa und eine ABp, d. h. in eine anteriore und eine posteriore, und diese wiederum jeweils in eine linke und in eine rechte Zelle. Aus der Abb..2 ist auch zu entnehmen, dass die Zellteilungen nicht synchron nach dem Muster 2 4 8 16 Zellen verlaufen. Wenn nach 12 Stunden die Embryogenese abgeschlossen ist, besteht die geschlüpfte Larve L 1 aus 558 Zellen. Die Zahl der Nachkommen der sechs Gründerzellen ist dann sehr unterschiedlich groß, wobei etliche Zellen durch Apoptose (= programmierter Zelltod) eliminiert worden sind. Die Nachkommen von E, D und P 4 beschränken sich auf die Bildung jeweils eines einzigen Gewebes, während z. B. der Pharynx aus Zellen der Zellfamilien AB und MS, die Hypodermis aus Zellen der Zellfamilien AB und C differenziert werden (Abb..2). Nur der Darm entsteht als Gewebe aus einer einzigen Zelle, E. Bis zum adulten Wurm finden zusätzliche Zellteilungen statt, weitere Zellen werden durch Apoptose eliminiert, so dass schließlich der Zellstammbaum (cell lineage) aller 959 bzw. 1031 Zellen bekannt ist und jede Zelle einen Namen hat. Für ihre führende Rolle bei der Erarbeitung der C. elegans Entwicklung und der Beschreibung des programmierten Zelltods haben Sydney Brenner, John E. Sulston und H. Robert Horvitz im Jahr 2002 den Nobelpreis für Medizin erhalten. Abb..2 Der Zellstammbaum von Caenorhabditis bis zum Abschluss der Embryogenese. Die Zellen P 0 bis P 4 stellen die Keimbahn dar. AB, MS, E, C und D sind die 5 Ursomazellen. Dargestellt sind auch die Zellzahlen in jeder Zelllinie nach Abschluss der Embryogenese (insgesamt 558 Zellen). Weitere Erläuterungen s. Text [nach Schierenberg 1987]. aus: Janning u.a., Genetik (ISBN 97831317724) f 2008 Georg Thieme Verlag KG
.2 Zellpolarität in der Frühentwicklung 443 Im Verlauf der ersten Furchungsteilungen werden auch die Körperachsen festgelegt. In der Abb..3 ist bereits in der Zygote P 0 eine anteriorposterior-achse (A-P-Achse) eingezeichnet, die mit der Teilung in AB und P 1 fixiert ist. Bei der nächsten Teilung wird durch die Lage von P 2 und EMS die dorsal-ventral-achse festgelegt: EMS ist ventral. Dadurch ist auch links-rechts bestimmt. Wir sehen im 8-Zell-Embryo (nach der Teilung von EMS und P 2, Abb..3 unten) die beiden linken Nachkommen von ABa und ABp. Es ist zu beachten, dass das gesamte Zellmaterial des Embryos aus der Zygote stammt, d. h. die Zellen werden bei jedem Teilungsschritt kleiner. Einer der besonders faszinierenden Aspekte der C. elegans Entwicklung ist sicher das Auftreten asymmetrischer Zellteilungen, die zu Zellen unterschiedlicher Entwicklungsschicksale führen. Wie es dazu kommt, werden wir im Folgenden darlegen. Die Oogenese endet zunächst mit einer Oocyte im Diplotänstadium der Meiose (s. Abb. 5.1, S. 30/31). Der Zellkern befindet sich am späteren anterioren Pol. Die Meiose wird fortgesetzt, sobald die Eizelle besamt ist. Die Teilungen der Meiose I und II finden mit einer kleinen Spindel ohne Centriolen statt. Nach Anaphase I und II wird je ein Teilungsprodukt als Polkörper ausgeschieden, so dass schließlich der haploide weibliche Vorkern in der Eizelle bleibt. Das Spermium, das an dem dem Zellkern entgegengesetzten Pol in die Eizelle eindringt und damit den posterioren Pol markiert, bringt nicht nur den haploiden männlichen Vorkern mit, sondern auch zwei Centriolen. Sie trennen sich und bilden in der Nähe des männlichen Vorkerns zwei Zentrosomen aus (Abb..4a). Zu diesem Zeitpunkt sind die P-Granula im Cytoplasma der Eizelle gleichmäßig verteilt. In der nun folgenden Prophase der ersten Mitose kondensieren die Chromosomen in den Vorkernen und diese bewegen sich aufeinander zu. Mikrotubuli bilden sich an den Zentrosomen, und die P-Granula wandern zum posterioren Pol (Abb..4b). Sobald sich die Vorkerne getroffen haben, rotiert der Kerne-Zentrosomen-Komplex so, dass die beiden Zentrosomen in der Längsachse der Zelle liegen (Abb..4c). Die Kerne verschmelzen und damit ist die Befruchtung vollzogen. Die beiden haploiden Chromosomensätze der Zygote liegen in der Metaphaseplatte der Spindel, deren astrale Mikrotubuli nunmehr an der Zellmembran inserieren (Abb..4d). Während der Anaphase wird die posteriore Halbspindel näher zum posterioren Pol gezogen, so dass bei der anschließenden Zellteilung die posteriore P 1 -Zelle kleiner ist als die anteriore AB-Zelle. Die P 1 -Zelle enthält wie alle weiteren P-Zellen die P-Granula als ein Kennzeichen der Keimbahn (Abb..4e). Mit senkrecht aufeinander stehenden Spindelstellungen und anschließendem Kippen der Zellen entsteht mit der folgenden Teilung der 4-Zell-Embryo (Abb..4f und g). Nach dieser Beschreibung der beiden ersten Furchungsteilungen wird man fragen, ob auch etwas über die Mechanismen bekannt ist, die zu den quantitativ und vor allem qualitativ unterschiedlichen Teilungsprodukten führen. In der Tat ist eine Vielzahl maternal exprimierter Gene (s. Kap. 22.2, S. 357) bekannt, deren Proteine im Cytoplasma, zumeist aber im Kortex nachgewiesen werden können. Als Kortex wird eine dünne Cytoplasmaschicht unmittelbar unterhalb der Zellmembran bezeichnet, die sich oftmals unabhängig vom übrigen Cytoplasma entlang der Membran bewegen kann. Im Folgenden werden die wichtigsten dieser Gene von der Zygote bis zum 4-Zell-Stadium behandelt. Eine bedeutende Gruppe ist die der par-gene (abnormal embryonic PARtitioning of cytoplasm). Diese Gene wurden als maternale Mutatio- Abb..3 Die Gründerzellen entstehen durch asymmetrische Zellteilungen. Gleichzeitig werden während der ersten drei Zellteilungen die Körperachsen festgelegt [nach Gönczy and Rose 2005]. aus: Janning u.a., Genetik (ISBN 97831317724) f 2008 Georg Thieme Verlag KG
444 Der Nematode Caenorhabditis elegans Abb..4 Spindelstellungen, ungleiche Verteilung von Determinanten und Genaktivitäten steuern die asymmetrischen Zellteilungen. Erklärung im Text. nen identifiziert, die die A-P-Polarität der Zygote P 0 beeinflussen und deren Phänotyp in abnormen ersten Zellteilungen besteht. PAR-3 und PAR-6 sind Proteine mit PDZ-Domänen (benannt nach den ersten Proteinen, in denen sie gefunden wurden: PSD-95 der Maus, Discs large von Drosophila und ZO-1 von Säugern), mit deren Hilfe Proteinkomplexe gebildet werden können. Ein solcher Komplex aus PAR-3, PAR-6 und PKC-3 (atypische Protein Kinase C) ist im gesamten Kortex des 1-Zell-Embryos ab dem Zeitpunkt der Besamung zu finden (Abb..4a). Gegen Ende der mitotischen Prophase ist der PAR-3/PAR-6/PKC-3-Komplex beschränkt auf den Kortex der anterioren Hälfte, während in der posterioren Hälfte des Kortex zwei weitere PAR-Proteine auftauchen, nämlich PAR-2, ein Ringfinger-Protein, und PAR-1, eine Ser/Thr-Kinase (Abb..4b). Die beiden Gruppen von PAR-Proteinen hemmen sich ge- aus: Janning u.a., Genetik (ISBN 97831317724) f 2008 Georg Thieme Verlag KG
.2 Zellpolarität in der Frühentwicklung 445 genseitig in der Verteilung im Kortex, so dass eine Grenze bei ca. 50 % Eilänge entsteht. Durch diese Verteilung der PAR-Proteine im Kortex wird die A-P-Polarität, die bereits durch die Lage des Eikerns am anterioren Pol und die Eintrittsstelle des Spermiums am posterioren Pol markiert ist, weiter festgelegt und aufrecht erhalten. Damit die erste Zellteilung in der A-P-Richtung stattfindet, durchlaufen wie oben beschrieben die Vorkerne und Zentrosomen in der Prophase eine Drehung um 90. Verantwortlich dafür ist LET-99 (LEThal), ein Protein, das in einem Band in der posterioren Eihälfte exprimiert wird. Diese Bewegungen wie auch die asymmetrischen Kräfte an der Teilungsspindel in der Anaphase werden durch einen G-Protein-Signalweg (s. Box 15.3, S. 186) gesteuert, an dem neben LET-99 und neben weiteren Proteinen auch GPR-1 und GPR-2 (G Protein Regulator) beteiligt sind. Es gibt Hinweise, dass während der Prophase die gleichmäßig einheitliche Lokalisation von GPR- 1 /2 zusammen mit LET-99 die Entwicklung von Zugkräften unterdrückt (Abb..4c). Diese Kräfte kommen in der Anaphase zur Wirkung, wenn GPR- 1 /2 vermehrt in der posterioren Eihälfte lokalisiert ist. Dies bewirkt schließlich, dass die Zytokinese die Zygote in ungleich große Zellen teilt (Abb. 27.3d, e, S. 436). Wenn bei der ersten Zellteilung die Determinanten für Soma in die anteriore AB-Zelle und die Determinanten für die Keimbahn in die posteriore P 1 -Zelle gelangen, so sind dabei einige im Cytoplasma des 1-Zell- Embryos vorkommende Zinkfinger-Proteine beteiligt. Die Zinkfinger- Proteine MEX-5, MEX-6 (Muscle EXcess) und PIE-1 (Pharynx and Intestine in Excess) sind bis zum Eindringen des Spermiums im Eicytoplasma gleichmäßig verteilt. Im weiteren zeitlichen Verlauf werden die MEX- Proteine anterior, PIE-1 posterior lokalisiert (Abb..4c, d). Im 2-Zell- Embryo ist PIE-1 nicht nur im Cytoplasma sondern auch im Zellkern der P 1 -Zelle vorhanden und mit den P-Granula assoziiert, während die MEX-Proteine auf das Cytoplasma der AB-Zelle beschränkt sind. Die PAR-Proteine sind entsprechend ihrer Verteilung im 1-Zell-Embryo nunmehr in der anterioren bzw. posterioren Zelle zu finden (Abb..4e). Bis hierher kann man festhalten, dass durch die räumliche Verteilung der besprochenen Proteine im Kortex und Cytoplasma die erste Teilung asymmetrisch verlaufen ist, und so z. B. Determinanten für die weitere Entwicklung gezielt ungleich verteilt worden sind. In Abb..5 ist dies modellhaft dargestellt. Anterior ist dort, wo der Komplex PAR-3/PAR- 6/PKC-3 im Kortex die Expression von PAR-2/PAR-1 unterdrückt und zugleich MEX- 5 /6 im Cytoplasma PIE-1 und die P-Granula fernhält. Die posteriore Qualität hingegen ist dadurch gekennzeichnet, dass PAR-2/1 einerseits die Verbreitung von PAR-3/PAR-6/PKC-3 und andererseits von MEX- 5 /6 hemmt. Daher können sich PIE-1 und die P-Granula posterior verteilen. Diese Erkenntnisse beruhen auf Färbungen, wie z. B. Antikörper-Färbungen, und Experimenten mit Mutanten der beteiligten Gene. So verläuft die Furchung von Zygoten, die keine funktionsfähigen PAR-Proteine enthalten, symmetrisch. In beiden Tochterzellen können dann P-Granula und cytoplasmatisches PIE-1 vorhanden sein. Über die molekularen Mechanismen, wie z. B. die MEX-Proteine die P-Granula veranlassen, sich nach posterior zurückzuziehen, oder wie der anteriore PAR-Komplex die posterioren PAR-Proteine daran hindert, sich in seiner Domäne auszubreiten, ist noch wenig bekannt. Die Vorbereitung auf die 2. Teilung verläuft in P 1 sehr ähnlich wie in P 0 (vgl. Abb..4c und f), während in der AB-Zelle die Polarisierung durch die PAR-Proteine ausbleibt. P 1 teilt sich asymmetrisch in A-P-Richtung in EMS und P 2. Durch die Bildung des rhombusförmigen 4-Zellstadiums aus: Janning u.a., Genetik (ISBN 97831317724) f 2008 Georg Thieme Verlag KG