Grundideen der Gentechnik Die Gentechnik kombiniert Biotechnik und Züchtung. Wie in der Züchtung wird die Erbinformation eines Lebewesen verändert. Dabei nutzte man in den Anfängen der Gentechnik vor allem Mikroorganismen. Der Stoffwechsel eines gentechnisch-veränderten Organismus wird dabei derart modifiziert, dass gezielt bestimmte Stoffe abgebaut oder aufgebaut werden bzw. Zwischenprodukte oder Enzyme isoliert werden können. Grundlagen für die Gentechnik sind das Wissen über die Struktur der Erbinformation, über dessen Modifizierbarkeit und über die Informationen innerhalb der Erbinformation, die für die Merkmale verantwortlich sind, welche man verändern bzw. in einem Organismus neu erzeugen möchte. Prinzipell also das Wissen über die Gene.
DNA Struktur DNA liegt in der Zelle in Form eines Doppelstranges vor. Das Rückgrat besteht aus dem Zucker Desoxyribose und Phosphatresten. An den Zucker sind die vier Basen A, T, C und G gebunden. Die Abfolge der Basen (Sequenz) enthält die Informationen für Proteine. Ein Gen codiert für ein Protein.
Grundtechniken der Gentechnik Um Merkmale eines Organismus zu verändern bzw. von einem zum anderen zu übertragen, muss die Erbinformation manipuliert werden. Die wichtigsten Techniken sind: - Zerschneiden von DNA (gezielt) - Zusammenfügen von DNA (Bau von Erbgut) - Vervielfältigen von DNA - Bestimmen der Sequenz der DNA (Sequenzierung) - Transfer von DNA in einen Empfängerorganismus (Vektor) - Selektion der Organismen mit neuen Merkmalen.
Schneiden von DNA 1. Lies den Infotext zum Schneiden von DNA. 2. Merke dir die Bedeutung der wichtigen Fachbegriffe: Restriktionsendonuclease, Palindrom, klebrige Enden = sticky ends. 3. In Fragmente welcher Grösse (Anzahl Basenpaare...bp) könnte man folgendes DNA-Stück mit den vier beschriebenen Restriktionsenzymen schneiden: 5 -AGCTAATTGAATTCTTTATCGTCCTGCAGGTTTCCGATATTA-3 4. Wieso ist es möglich, dass verschiedene Individuen einer Spezies unterschiedlich viele und eine unterschiedliche Verteilung von Restriktionsstellen besitzen (denke an den genetischen Code). 5. Der RFLP...Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus hilft bei der Erstellung eines genetischen Fingerabdruckes. Was könnte der Ausdruck bedeuten? 6. Was könnte das Zerschneiden der ringförmigen DNA aus dem Bakterium E. coli nützen (vor und nach der Übertragung auf das Bakterium)?
Lambda (λ-dna)
Ergebnisse Restriktionsverdau
Zusammenfügen von DNA Das Schneiden von DNA allein reicht nicht aus, um das Erbgut eines Organismus zu verändern. Hat man z.b. ein Gen ausgeschnitten, so muss es auch wieder in ein grösseres Stück DNA eingeklebt werden. Dies bewerkstelligt die DNA-Ligase.
Wohin mit dem Gen? Um ein gentechnisch-verändertes Lebewesen zu erzeugen, muss DNA (durch Schneiden und Kleben erzeugte sog. rekombinante DNA) in ein Lebewesen übertragen werden. Dies muss so geschehen, dass das Lebewesen auch etwas mit dem neuen Gen anfangen kann. 1. Zunächst muss die veränderte DNA in ein Transport- DNA-Molekül gebracht werden, in einen sog. Vektor. 2. Nun muss eine geeignete Methode gewählt werden, wie dieser Vektor in die Zielzellen eingebracht werden kann. 3. Bei Mikroorganismen ist dies einfach, bei Pflanzen schon schwieriger und bei höher entwickelten Tieren sehr schwer möglich.
Gentransfer
pgem1 pgem1 ist ein kommerziell erhältliches Plasmid, welches als Vektor für die Übertragung von DNA in Bakterien genutzt wird. Es enthält das Gen für die Resistenz gegen Ampicillin. Ausserdem enthält es diverse Schnittstellen für Restriktionsenzyme, die in der MCS (multiple cloning site) vereint sind.
Restriktionsanalyse Um das Vorhandensein eines Plasmids (z.b. pgem1) in Bakterien nachzuweisen, kann das Plasmid isoliert werden und mit einem Restriktionsenzym geschnitten werden. Wie werden sich Plasmide mit und ohne fremder DNA unterscheiden? Ist es notwendig, dass innerhalb der fremden DNA ebenfalls eine Restriktionsschnittstelle sitzt? Das erwartete Ergebnis kann bereits vorher virtuell beschafft werden: 1. Sequenz des Plasmids aus Genbank holen. 2. Sequenz auf Schnittstellen durchsuchen. 3. Virtuellen Restriktionsverdau durchführen und erwartete Fragmentgrössen in einem virtuellen Gelbild darstellen. 4. Vergleich des erwarteten Ergebnisses mit den echten Gelen.
Gelbilder Was lief falsch bei Gruppe 4, bei Gruppe 6, bei Gruppe 7? Plasmid DNA, die nicht bzw. nur einmal geschnitten wurde, kann auf dem Gel in verschiedenen Formen vorkommen.
Zusammenfassung der Techniken
Selektion transgener Zellen An welcher Stelle des Prozesses können unerwünschte Ereignisse auftreten? Nur jedes 100000. Bakterium nimmt ein Plasmid auf. Worin könnte der Vorteil von Fluoreszenzmarkern bestehen?
Grundtechniken der Gentechnik Um Merkmale eines Organismus zu verändern bzw. von einem zum anderen zu übertragen, muss die Erbinformation manipuliert werden. Die wichtigsten Techniken sind: - Zerschneiden von DNA (gezielt) - Zusammenfügen von DNA (Bau von Erbgut) - Vervielfältigen von DNA - Bestimmen der Sequenz der DNA (Sequenzierung) - Transfer von DNA in einen Empfängerorganismus (Vektor) - Selektion der Organismen mit neuen Merkmalen.
Woher bekommt man das Gen? Um einen transgenen Organismus herzustellen, der ein ihm eigentlich fremdes Gen exprimiert und damit eine neue Eigenschaft hat, bedarf es folgender Vorarbeiten: 1. Finden eines Organismus mit den gewünschten Eigenschaften bzw. mit dem gewünschten Gen. 2. Herausfinden der Sequenz des Gen. 3. Auffinden, gewinnen und vervielfältigen der DNA mit dem gewünschten Gen. Erst jetzt kann das Gen an seinen Enden geschnitten und in einen Vektor eingefügt werden. Den Gesamtprozess nennt man Klonieren.
Genombibliothek