Molekulare Mechanismen der perineuralen Invasion humaner Pankreaskarzinomzellen

2. Arbeits- und Ergebnisbericht zum Teilprojekt B7 Thema des Projekts: Molekulare Mechanismen der perineuralen Invasion humaner Pankreaskarzinomzellen Prof. Dr. Peter Gierschik Abteilung Pharmakologie und Toxikologie, Universitätsklinikum Ulm 2.1 Kenntnisstand bei der letzten Antragstellung und Ausgangsfragestellung Pankreaskarzinome zeigen eine ausgeprägte Tendenz zur gerichteten Invasion entlang von intraund extrapankreatischen Nerven. Diese Eigenschaft trägt entscheidend zur hohen Inzidenz und äußerst schlechten Prognose dieser Tumorerkrankung bei (Nakao et al. Pancreas 1996; 12:357). Die molekularen Mechanismen, die an der Entstehung der perineuralen Invasion und der Interaktion von Karzinomzellen mit Nervenfasern beteiligt sein könnten, waren zum Zeitpunkt der Antragsstellung unbekannt. Eine der diesbezüglich diskutierten Hypothesen beruhte auf der Freisetzung oder Präsentation von proliferationsfördernden Wachstumsfaktoren durch periphere Nerven, die eine Interaktion zwischen Tumorzellen und Nerven und nachfolgend eine verstärkte Proliferation der Tumorzellen auslösen würden (Bockman et al. in Beger HG et al. eds. Cancer of The Pancreas 1996:99). Neben der Identifizierung einzelner Wachstumsfaktoren mit chemound/oder haptotaktischer Wirkung für verschiedene Tumorzellarten, war auch die Beteiligung Pertussistoxin-sensitiver G-Proteine an der gerichteten Motilität von Tumorzellen beschrieben worden (Lester et al. Cancer Res 1989; 49:5940). Darüber hinaus belegten zahlreiche Publikationen eine regulatorische Funktion von Ras- und Rho-GTPasen in der zellulären Motilitat (Laudanna et al. Science 1996;271:981, Albini et al. Cancer Res 1987;47:3239, Nobes and Hall, Cell 1995;81:53). Für humane Pankreaskarzinomzellen lagen bei Antragsstellung nur wenige Befunde zur Induktion und Regulation der Tumorzellmigration vor. Zur Aufklärung der molekularen Mechanismen, die an der perineuralen Invasion menschlicher Pankreaskarzinomzellen beteiligt sind, sollten in der laufenden Förderperiode folgende Programmpunkte bearbeitet werden: (i) Etablierung von in vitro Modellen zur Untersuchung der gerichteten Invasion humaner Pankreaskarzinomzellen, (ii) Analyse der Beteiligung G-Proteingekoppelter Rezeptoren und heterotrimerer, Pertussistoxin-sensitiver G-Proteine an der Regulation der gerichteten Invasion humaner Pankreaskrzinomzellen, (iii) Untersuchung der Regulation der gerichteten Invasion humaner Pankreaskarzinomzellen durch Rho-GTPasen, (iv) 143

Identifizierung neuronaler Faktoren, die eine chemo- und/oder haptotaktische Reaktion humaner Pankreaskarzinomzellen induzieren. 2.2-2.3 Methoden, Ergebnisse und ihre Bedeutung Etablierung von in vitro-modellen zur Untersuchung der gerichteten Invasion Um chemotaktisch wirkende Faktoren zu identifizieren und eine gerichtete Zellbewegung von humanen Pankreaskarzinomzellen zu untersuchen, wurden verschiedene Modellsysteme zur Migrations- und Invasionsanalyse etabliert. Die Identifizierung und Charakterisierung chemotaktisch-wirkender Mediatoren erfolgte dabei mit Hilfe von transwell-migrationsassays, in denen Zellen in serumfreiem Medium mit Mitomycin C als Proliferationsinhibitor in einem Zellkultureinsatz auf einer porösen Membran ausgesät werden. Die Kammer unterhalb der Zellen enthält den chemotaktischen Faktor. Zur Ermittlung des chemotaktischen Potentials des/r Faktors/en wurden die migrierten Zellen auf der Membranunterseite nach Ablauf des Versuchszeitraumes quantifiziert. Mit Hilfe dieses Systems konnten die Wachstumsfaktoren EGF (epidermal growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), LPA (lysophosphatidic acid) und GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) für humane Pankreaskarzinomzellen als chemotaktische Faktoren identifiziert werden. Der Einsatz spezifischer Inhibitoren für die Signaltransduktionsproteine G i/o, MEK1 und Phosphoinositid-3-Kinase (Pertussistoxin, PD98059 bzw. Ly294002) führte darüber hinaus zur Identifizierung von Signaltransduktionswegen, die für die Liganden-induzierte Migration notwendig sind. Die während der Wachstumsfaktor-induzierten Migration auftretenden morphologischen Veränderungen wurden in Wundheilungsexperimenten in serumfreiem Medium mit Mitomycin C analysiert. In diesem experimentellen Ansatz wurde aus einem konfluenten monolayer ruhender PANC-1- oder BxPC-3-Zellen ein 0.5-2 cm breiter Zellstreifen mechanisch entfernt und die Zellen anschließend zur Induktion der Migration mit einem der oben genannten Wachstumsfaktoren stimuliert. Abschließend wurden die Zellen fixiert und immunohistochemisch analysiert. Insbesondere für die LPA-induizierte Migration von PANC-1 und BxPC-3 Pankreaskarzinomzellen konnten so die Ausbildung von Lamellipodien, die Neubildung kurzer Aktinfilamenten unterhalb der Führungslamelle und die Ausbildung Vinculin-haltiger fokaler Kontakte dargestellt werden. Diese Strukturen stellen eine wichtige Voraussetzung für die Zelllokomotion der Tumorzellen dar, wie durch den Einsatz von Pertussistoxin und dem MEK1-Inhibitor PD98059, die die Ausbildung dieser Strukturen inhibieren, gezeigt werden konnte. Darüber hinaus bestätigten diese Studien die bereits in den 144

transwell-migrationsassays gemachten Beobachtungen, dass PANC-1 Zellen vorwiegend als Einzelzellen und BxPC-3 Zellen im Verband, d.h. unter Beibehaltung E-Cadherin-haltiger Zell- Zell-Kontakte, migrieren (weitere Ergebnisse unter 2.2). Zur inhaltlichen Erweiterung, aber auch zur Kontrolle der im Projekt gewählten zellbiologischen und biochemischen Analysen, wurden in vivo-untersuchungen zum invasiv-metastatischen Verhalten von menschlichen Pankreaskarzinomzellen im Nacktmaus-Modell etabliert. Die orthotope Implantation von Karzinomzellen in das Pankreas der Nacktmaus und die anschließende histologisch-immuncytochemische Auswertung bestätigte unsere unter Zellkulturbedingungen erzielten Ergebnisse. Dabei zeigten E-Cadherin/β-Catenin-positive BxPC-3-Zellen nach Implantation in das Pankreas der Nacktmaus ein solides Tumorwachstum mit Auftreten einer Leber- aber keiner Lungenmetastase pro Tier im Versuchszeitraum (4 Wochen; 5 Mäuse). PANC-1 Zellen wiesen ein eher infiltratives Wachstum mit einigen Leberund Lungenmetastasen auf. MiaPaCa-2 Zellen konnten durch ein sehr aggressives, invasivmetastatisches Verhalten mit zahlreichen Tumorinfiltraten in den angrenzenden Organen charakterisiert werden. Diese Versuche wurden in enger Kooperation mit Dr. Andre Menke (Teilprojekt B4) durchgeführt. Leider konnte innerhalb des durch die Tierversuchsgenehmigung auf 4 Wochen begrenzten Versuchszeitraums keine perineurale Invasion menschlicher Pankreaskarzinomzellen in der Maus nachgewiesen werden. Um die molekularen Mechanismen der chemotaktischen Invasion von Pankreaskarzinomzellen durch dreidimensionale Gewebeverbände zu analysieren, haben wir die mehrschichtige Chorioallantois-Membran (CAM) des bebrüteten Hühnereis als Modellsystem verwendet. Dies gelang durch Gewinnung der tierexperimentellen Expertise von Frau Felizitas Genze, die als technische Assistentin auch die Nacktmausversuche dieses Projekts durchgeführt hat. Die CAM (Bebrütungstag 6 bis 12) eignet sich gut zur Kultivierung humaner Tumorzellen (Armstrong PB et al. Cancer Res. 1982;42:1826). In unseren bisherigen Experimenten konnten wir zeigen, dass verschiedene Pankreaskarzinomzelllinien über einen Zeitraum von 6-10 Tagen auf der CAM kultiviert werden können. Während dieser Zeit durchbrechen die Karzinomzellen das einschichtige Epithel der CAM und infiltrieren das mehrschichtige Bindegewebe sowie einzelne Blutgefäße. Der Nachweis der Pankreaskarzinomzellen in histologischen Schnitten der fixierten CAM erfolgt durch Hämatoxylin/Eosin-Färbung sowie immunhistologisch durch Anwendung human- und/oder Pankreas-spezifischer Antikörper. Die Migrations- und Invasionseigenschaften der einzelnen Zelllinien in diesem System sind vergleichbar mit dem Verhalten der Zellen in 145

Zellkultursystemen bzw. nach orthotoper Implantation in das Pankreas der Nacktmaus. PANC-1 Zellen infiltrieren die CAM überwiegend als Einzelzellen oder in kleinen losen Zellverbänden, wohingegen BxPC-3 Zellen große, dicht-gepackte Zellaggregate im mehrschichtigen Bindegewebe bilden. In weiterführenden Experimenten konnten wir außerdem zeigen, dass diese Zellen auch im CAM-Modell chemotaktisch auf die von uns charakterisierten Wachstumsfaktoren (z.b. LPA, EGF, GDNF), reagieren. Die Faktoren werden in einem von uns eigens für die hier bearbeitete Fragestellung entwickelten Zweikompartimentsystem aus Silikon in definiertem Abstand zu den Tumorzellen auf die Chorionallantois-Membran aufgebracht. Die Tumorzellen wandern sowohl auf der CAM als auch nach Infiltration des Bindegewebes von der Aussaatstelle im ersten Kompartiment zur Applikationsstelle des Wachstumsfaktors im zweiten Kompartiment. Kontrollsubstanzen, die in Zellkulturmodellen keine chemotaktische Wirkung auf Pankreaskarzinomzellen haben, versursachen in diesem System keine gerichtete Migration und Invasion. Inhibitoren, die in in vitro Migrationsstudien mit Hilfe der transwell- Zellkultureinsätze zu einer Hemmung der chemotaktischen Antwort führten (siehe Ergebnisse 2.2 und 2.3) inhibieren auch die gerichtete Invasion im CAM-Modell. Diese Ergebnisse zeigen, dass die von uns charakterisierten chemotaktisch-wirkenden Faktoren EGF, HGF, LPA und GDNF nicht nur in vitro unter Zelkulturbedingungen eine gerichtete Migration sondern auch in einem Gewebeverband eine gerichtete Invasion auslösen können. Unsere bisherigen Ergebnisse (Giehl K et al., in Vorbereitung) zeigen, dass uns mit dem CAM-Modell und den von uns entwickelten experimentellen Techniken ein System zur Verfügung steht, welches die Analyse der molekularen Mechanismen der Adhäsion, Migration und Invasion von Pankreaskarzinomzellen in einem dreidimensionalem Gewebeverband erlaubt. Zur Analyse der Regulation der gerichteten Invasion durch Rho-GTPasen haben wir damit begonnen, stabil-transfizierte PANC-1-Zelllinien, die EGFP(enhanced green fluorescent protein)-gtpase-fusionsproteine exprimieren, herzustellen. Neben der Analyse der GTPase- Funktion bei der Migration und nachfolgenden Invasion, ermöglichen diese Zelllinien aufgrund ihrer Fluoreszenz die Charakterisierung des zeitlichen Verlaufs der Invasion auf der CAM, d.h. in vivo. Im Folgeprojekt soll dieses Modellsystem dazu verwendet werden, die zeitliche Abfolge der im Rahmen der Invasion auftretenden morphologischen Veränderungen von Pankreaskarzinomzellen zu beschreiben und die funktionelle Bedeutung von einzelnen Rho- GTPasen an den jeweiligen Teilprozessen zu ermitteln. 146

Analyse der Beteiligung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren und heterotrimerer, Pertussistoxin-sensitiver G-Proteine und Rho-GTPasen an der Regulation der gerichteten Invasion Im Rahmen unserer Analysen der Wachstumsfaktor-induzierten Signaltransduktionsprozesse in humanen Pankreaskarzinomzellen konnten wir zunächst die Bedeutung der Aktivierung Ras- Raf-MEK-ERK-Kaskade für die Proliferationskontrolle der Karzinomzellen aufzeigen (Weisz et al. 1999). Darüber hinaus konnten wir in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Dr. Andre Menke (Teilprojekt B4) einen neuen TGFβ-vermittelten Signalweg in Pankreaskarzinomzellen aufzeigen (Giehl et al. 2000a). Untersuchungen zur Bedeutung der EGF-induzierten Signalkaskaden in PANC-1 Pankreaskarzinomzellen führten zu dem Befund, dass EGF zu einer drei- bis vierfach erhöhte Zellmigration gegenüber unbehandelten Kontrollzellen im transwell- Migrationsassay führt. EGF kann somit als chemotaktisch-wirkender Faktor für diese Zellen klassifiziert werden. Die EGF-induzierte Chemotaxis ist, wie durch den Einsatz des MEK1- Inhibitors PD98059 gezeigt werden konnte, von aktivierter ERK2 (extracellular signal-regulated kinase 2) abhängig. Die Aktivierung der Ras-Raf-MEK-ERK-Kaskade ist also nicht nur für die Proliferations-, sondern auch für die Migrationskontrolle von PANC-1 Pankreaskarzinomzellen von Bedeutung. Diese Daten sind 2000 in Oncogene publiziert worden (Giehl et al. 2000b). Die Untersuchung der Beteiligung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren führte zur Identifizierung des Glyzerophospholipids Lysophosphatidsäure (LPA) als Chemotaxis-auslösender Ligand für PANC-1 und BxPC-3 Pankreaskarzinomzellen. LPA bindet in diesen Zellen an G-Proteingekoppelte Rezeptoren. In [ 35 S]GTPγS-Bindungsstudien konnten wir eine konzentrations- und zeitabhängige Aktivierung Pertussistoxin-sensitiver G i/o -Proteine nachgeweisen. Die Rezeptor- G-Protein-Kopplung ist in vitro sowohl durch Na + -Ionen als auch durch GDP beeinflussbar. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass LPA in PANC-1 Zellen die Aktivierung der GTPasen Ras, insbesondere N-Ras, der Rho-GTPasen RhoA und Rac1, sowie der Proteinkinasen ERK2 und JNK1 (c-jun N-terminal kinase 1) bewirkt. In diesen Experimenten konnte erstmalig direkt die Rac-Aktivierung durch LPA gezeigt werden. Als zellulärer Effekt der LPA-vermittelten Aktivierung Pertussistoxin-sensitiver G i/o -Proteine konnten wir eine 3- bis 8-fache Steigerung der chemotaktischen Migration bei PANC-1 und BxPC-3 Zellen im transwell-system nachgeweisen. Anders als bei der Maus- Fibroblastenzelllinie NIH/3T3 war die Motilität dieser Zellen durch Zugabe des MEK1 (mitogen-activated protein kinase/erk kinase 1)-Inhibitors PD98059 hemmbar. PD98059 verursacht in diesen Zellen eine nahezu vollständige Inhibition der LPA-induzierten ERK2- Aktivierung. Diese Ergebnisse belegen, dass die ERK-Kaskade in humanen 147

Pankreaskarzinomzellen, nicht jedoch in murinen Fibroblasten, die LPA-induzierte Chemotaxis reguliert. Zur Analyse der morphologischen Veränderungen während der LPA-induzierten Migration wurden Wundheilungsexperimente durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass die E-Cadherin/β- Catenin-armen PANC-1 Zellen wie NIH/3T3-Fibroblasten als Einzelzellen wanderten, während die E-Cadherin/β-Catenin-reichen BxPC-3 Zellen als Zellverband, d.h. unter Aufrechterhaltung der zellulären Kontakte, migrierten. Die Bedeutung und die Regulation der E-Cadherinvermittelten Zell-Zell-Kontakte während der Migration sollen in der nächsten Förderperiode in Zusammenarbeit mit Dr. Andre Menke (Teilprojekt B4) analysiert werden. Im Verlauf der LPAinduzierten Migration zeigten sich im Beobachtungszeitraum von 15-120 min deutliche Veränderungen in der Organisation des Aktinzytoskeletts. Bei PANC-1 und BxPC-3 Zellen konnte die distinkte Ausbildung von Lamellipodien und die Ausbildung kurzer Aktinfilamente unterhalb der Führungslamelle in Richtung der Migrationsbewegung beobachtet werden. Außerdem ist dieser Bereich durch die Neubildung von Vinculin-haltigen focal contact- Strukturen, die mit den Enden der Aktinfilamenten kolokalisierten, gekennzeichnet. Aus der Pertussistoxinsensitivität dieser Veränderungen schließen wir, dass in den analysierten Zellsystemen die Aktivierung von G i/o -Untereinheiten für die LPA-induzierten Zytoskelettveränderungen notwendig ist. Die Inkubation der Zellen mit dem MEK1-Inhibitior PD98059 resultierte nicht nur in einer verminderten Zellwanderung, sondern auch in einer deutlich reduzierten Neubildung Vinculin-haltiger focal contact-strukturen und einer Umverteilung neugebildeter Aktinfilamente, die nun nicht unterhalb der Führungslamelle sondern im Zellzentrum lokalisiert waren. Diese Befunde deuten auf eine wichtige Rolle der Ras-Raf-MEK-ERK-Kaskade bei der Koordination der Aktinfilament-Reorganisation während der Zellmigration hin. Die bisher dargestellten Befunde zur LPA-vermittelten Chemotaxis und über die daran beteiligten Signaltransduktionkaskaden sollen in Kürze zur Publikation eingereicht werden. Die molekularen Mechanismen, mit denen die ERK-Kaskade Einfluß auf die Aktin-Organisation haben könnte, sollen im Rahmen des Folgeprojektes näher analysiert werden. Mögliche ERK-abhängige Regulatoren sind das myosin light chain Kinase/Phosphatase- System oder die PAK- oder Rho-Kinasen (Nguyen et al. J Cell Biol 1999;146:149, Itoh et al. Nat Med 1999;5:221, Fincham et al. EMBO J 2000;19:2911). Im Rahmen eines dreimonatigen Forschungsaufenthaltes im Labor von Dr. Alan Hall (MRC, University College London, London, UK), der durch ein EMBO-Kurzzeitstipendium unterstützt wurde, konnte Frau Dr. Klaudia Giehl Mikroinjektions- und time-lapse 148

Videomikroskopietechniken erlernen und auf Pankreaskarzinomzellen anwenden. Durch Anwendung von nukleärer Injektion der Expressionsplasmide für EGFP (enhanced green fluorescent protein)-ras-, -Rac1- und -RhoA-Fusionsproteine konnte in Wundheilungsassays für PANC-1 Zellen die Notwendigkeit von aktiviertem Ras, Rac1 und RhoA für die LPA-induzierte Migration nachgewiesen werden. Sowohl dominant-negatives EGFP-H-Ras(S17N) als auch - Rac1(S17N) und -RhoA(T19N) führten in diesen Experimenten zu einer deutlichen Inhibition der Migration. Durch die Etablierung eines Aktivitätsassay für Rho-GTPasen konnte bei kurzzeitiger (1-3 min) Stimulation von PANC-1 Zellen mit LPA eine deutliche Aktivierung von RhoA gezeigt werden. Durch die Verwendung von GTPase-spezifischen Aktivitätsassays und Mikroinjektionsexperimenten konnte somit die Beteiligung von Ras, Rac1 und RhoA an der LPA-induzierten Migration von PANC-1 Pankreaskarzinomzellen gezeigt werden. Die Analyse der regulatorischen Bedeutung von Rho-GTPasen, insbesondere von RhoA und RhoC, für die Migration und Invasion humaner Pankreaskarzinomzellen ist ein Schwerpunkt des Fortsetzungsantrages. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass LPA ein effektiver Stimulator der gerichteten Migration von humanen Pankreaskarzinomzellen ist. Die chemotaktische Wirkung von LPA wird über Pertussistoxin-sensitive G i/o -Proteine, die GTPasen N-Ras, RhoA und Rac1, sowie die Proteinkinasen MEK1, ERK2 und JNK vermittelt. Diese Ergebnisse werden Anfang 2001 zur Veröffentlichung eingereicht. Die Mechanismen der Signalübertragung von G i/o auf die monomeren GTPasen und deren Verschaltung sollen im Folgeprojekt näher analysiert werden. Identifizierung neuronaler Faktoren, die eine chemo- und/oder haptotaktische Reaktion humaner Pankreaskarzinomzellen induzieren Zur Identifizierung chemo- und/oder haptotaktisch wirkender neuronaler Faktoren wurden zunächst Experimente durchgeführt, in denen Pankreaskarzinomzellen entweder mit neuronalen Zelllinien oder mit Primärkulturen aus murinen embryonalen Gehirnen (Mesencephalon der Maus und der Ratte) kokultiviert wurden. Weder in transwell-migrationsassays noch in Proliferationsuntersuchungen ([ 3 H]Thymidin-Einbau) konnte eine chemotaktische oder mitogene Wirkung des konditionierten Mediums der neuronalen Zellkulturen auf Pankreaskarzinomzellen festgestellt werden. Dagegen wurde bei der Analyse rekombinanter, neurotropher Wachstumsfaktoren der Wachstumsfaktor GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) als chemotaktisch-wirkender Faktor für PANC-1 Pankreaskarzinomzellen identifiziert. BDNF (brain-derived neurotrophic factor) und β-ngf (nerve growth factor β) zeigten keine 149

chemotaktische Wirkung auf PANC-1-Zellen. Diese Daten stehen in Einklang mit Ergebnissen von Okada und Mitarbeitern, die eine GDNF-induzierte Migration für PaCa-1, AsPC-1, SW1990 und Capan-2 Pankreaskarzinomzellen zeigten (Okada Y et al. Int J Cancer 1999;81:67). Die von Miknyoczki (Miknyoczki SJ et al. Int J Cancer 1999;81:417) dargestellte BDNF-induzierte Chemotaxis von PANC-1 Zellen konnten wir bisher nicht reproduzieren. GDNF induziert einen ca. 3-fachen Anstieg der im transwell-migrationsassay pro Zeiteinheit (24 h) gewanderten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Die chemotaktische Reaktion ist damit vergleichbar mit der Reaktion die von anderen Liganden wie LPA, HGF und EGF induziert wird. GDNF hat keinen Einfluß auf die Proliferation dieser Zellen, was durch Zellproliferationsstudien belegt werden konnte. Als neurotropher Faktor fördert GDNF das Überleben und die Differenzierung dopaminerger Neurone im Mittelhirn und verschiedener Subpopulationen peripherer Nerven. Darüber hinaus ist dieser Wachstumsfaktor an der Ausbildung des Darmwandnervensystems beteiligt (Mason I, Pharm Acta Helv 2000;74:261). GDNF bindet mit hoher Affinität an den membranständigen Rezeptorkomplex RET-GRFα1 (Jing S et al. Cell 1996;85:1113). Zur näheren Charakterisierung GDNF-vermittelter Signaltransduktionsmechanismen in PANC-1 Zellen wurden die Rezeptortyrosinkinase RET und der Korezeptor GFRα1 mittels RT-PCR- und Immunblot-Analysen sowohl auf mrna als auch auf Proteinebene nachgewiesen, wobei rezeptorpositive Neuroblastomazellen als Kontrolle dienten. Bei der Charakterisierung GDNF-induzierter Signalwege konnten wir bisher zeigen, dass GDNF zu einer konzentrations- und zeitabhängigen Aktivierung der MAPKs (mitogenactivated protein kinases) ERK2 und JNK1 führt. Durch Einsatz der spezifischen Inhibitoren von MEK-1, PD98059, und von Phosphoinositid-3-Kinase (PI-3K), LY294002, wurde außerdem nachgewiesen, dass sowohl die Aktivierung der MEK-ERK-Kaskade als auch die Aktivierung von PI-3-Kinasen essentiell für die GDNF-stimulierte Migration von PANC-1 Pankreaskarzinomzellen sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass der neurotrophe Faktor GDNF durch Aktivierung verschiedener Signalkaskaden die Zellmotilität von Pankreaskarzinomzellen fördert. Da die Aktivierung der Kinase ERK2 in neuronalen Zellen über die Aktivierung von Ras vermittelt wird, soll im Folgeprojekt die Aktivierung dieser GTPase in PANC-1 Pankreaskarzinomzellen untersucht werden. Nach Abschluß der Analysen der Ras-Aktivierung sollen. Die bisher zur GDNF-induzierten Migration von Pankreaskarzinomzellen sollen im Frühjar 2001 zur Publikation eingereicht werden. 150

In unseren bisherigen Arbeiten zur Wachstumsfaktor-vermittelten ERK-2 Aktivierung in PANC- 1 Pankreaskarzinomzellen konnten wir eine Rezeptor-ERK2-Kopplung über die Aktivierung von N-Ras zeigen. Wenn sich bei unseren jetzigen Untersuchungen eine Aktivierung von Ras durch GDNF zeigt, dann soll ein möglicher Ras-Isoform-spezifischer Signalweg im Folgeprojekt auch für die RET-ERK2-Signaltransduktion identifiziert werden. Darüber hinaus ist insbesondere aus neuronalen Systemen bekannt, dass GDNF über die Aktivierung von Rho-GTPasen durch Reorganisation des Aktinzytoskeletts zur Migration, aber auch Differenzierung beitragen kann, sodass in weiterführenden Analysen eine Beteiligung von Rho-GTPasen (RhoA, Rho C und Rac1) an der GDNF-induzierten Migration untersucht werden soll. 2.4 Reaktionen der wissenschaftlichen Öffentlichkeit auf die eigenen Arbeiten Dr. K. Giehl wurde zu einem Übersichtsvortrag über die Signaltransduktion durch GTPasen auf dem jährlichen internationalen Kongress der Deutschen Gesellschaft für Signaltransduktion (GST) 2000: Signal Transduction: Receptor, Mediators and Genes in Berlin eingeladen Prof. Dr. P. Gierschik war 2000 Organisator des 51. Mosbacher Kolloquiums : GTP Binding Proteins: Central Regulator in Cell Biology der Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie (GBM). Eine Zusammenfassung ist 2000 unter folgendem Titel erschienen: Wittinghofer A and Gierschik P (2000): Highlight: GTP binding proteins-central regulators in cell biology. Biol Chem 381:355 2.6 Publikationen (1998-2000) Ballweber E, Giehl K, Hannappel E, Huff T, Jockusch BM and Mannherz HG (1998): Plant profilin induces actin polymerization from actin:β-thymosin complexes and competes directly with β-thymosins and with negative co-operativity with DNase I for binding to actin. FEBS Lett 425: 251-255 Menke A, Yamaguchi H, Giehl K and Adler G (1998): Hepatocyte growth factor and fibroblasts growth factor 2 are overexpressed after cerulein-induced acute pancreatitis. Pancreas 18: 28-33 Illenberger D, Schwald F, Pimmer D, Maier G, Dietrich A and Gierschik P (1998): Stimulation of phospholipase C-beta-2 by the Rho GTPases Cdc42Hs and Rac1. EMBO J. 17:6241-6249 Menke A, Geerling I, Giehl K, Vogelmann R, Reinshagen M and Adler G (1999): Transforming growth factor-β-induced upregulation of transforming growth factor-β receptor expression in pancreatic regeneration. Biochim Biophys Acta 1449: 178-185 Weisz B, Giehl K, Gana-Weisz M, Egozi Y, Ben-Baruch G, Marciano D, Gierschik P and Kloog Y (1999): A new functional Ras antagonist inhibits human pancreatic tumor growth in nude mice. Oncogene 18: 2579-2588 151

Slupsky JR, Quitterer U, Weber CK, Gierschik P, Lohse MJ and Rapp UR (1999): Binding of Gβγ subunits to craf1 downregulates G-protein-coupled receptor signalling. Curr Biol 9:971-974 Giehl K, Seidel B, Gierschik P, Adler G and Menke A (2000a): TGFβ1 represses proliferation of pancreatic epithelial cells which correlates with Smad4-independent inhibition of ERK activation. Oncogene 19: 4531-4541 Giehl K, Skripczynski B, Mansard A, Menke A and Gierschik P (2000b): Growth factordependent activation of the Ras-Raf-MEK-MAPK pathway in the human pancreatic carcinoma cell line PANC-1 carrying activated K-ras: implications for cell proliferation and cell migration. Oncogene 19: 2930-2942 Illenberger D, Stephan I, Gierschik P and Schwald F (2000): Stimulation of phospholipase C- beta 2 by Rho GTPases. Methods Enzymol. 325:167-77 Scheffzek K, Stephan I, Jensen ON, Illenberger D and Gierschik P (2000):The Rac-RhoGDI complex and the structural basis for the regulation of Rho proteins by RhoGDI. Nature Struct Biol. 7:122-6 Vorträge und Abstracts Flossmann-Kast BBM, Lutz MP, Adler G, Gierschik P and Giehl K (1998): Src stimulates the MAPK pathway in the pancreatic carcinoma cell line Panc-1. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiolgie, Eur J Cell Biol Suppl 48(75): 275 (Posterpräsentation: B. Flossmann-Kast) Giehl K, Flossmann-Kast B, Mansard A, Skripczynski B, Stähle M, Lutz MP and Gierschik P (1998): Activation of the Ras-MAPK-cascade in human pancreatic carcinoma cells by lysophosphatidic acid. 39. Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für experimentelle und klinische Pharmakologie und Toxikologie, Mainz, Naunyn Schmiedeberg s Arch Pharmacol Suppl Vol 357 (4): 247 (Vortrag: K. Giehl) Giehl K, Mansard A, Skripczynski B, Stähle M, Werber M and Gierschik P (1998): Growth factor signaling through Ras is maintained in pancreatic carcinoma cell lines carrying activated Ras. XIIIth International Congress of Pharmacology, München, Naunyn-Schmiedeberg s Arch Pharmacol Suppl Vol 358 (1) R 654 (P2133) (Posterpräsentation: K. Giehl) Giehl K, Stähle M, Werber M, Mansard A and Gierschik P (1998): Lysophosphatidsäure aktiviert Ras-MAPK-abhängige Zellmigration in humanen BxPC-3-Pankreaskarzinomzellen. 53. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Verdauungs- und Stoffwechselkrankheiten mit Sektion für Gastroenterologische Endoskopie, Kiel (Posterpräsentation: K. Giehl ) Giehl K, Stähle M, Werber M, Mansard A and Gierschik P (1998): Lysophosphatidic acid mediates cell migration via pertussis toxin-sensitive G proteins and MAPK in human pancreatic carcinoma cells. 2. Joint Meeting der Signaltransduktions-Arbeitskreise der DGfL, der DGZ und der GBM-Studiengruppe Gentechnik/Biotechnologie, Langen (Vortrag: K. Giehl) Stähle M, Mansard,A, Gierschik P and Giehl, K (1999): Signaling mechanisms invovled in growth factor-mediated cell migration of human pancreatic carcinoma cells. 40. Frühjahrstagung 152

der Deutschen Gesellschaft für experimentelle und klinische Pharmakologie und Toxikologie, Mainz, Naunyn Schmiedeberg s Arch Pharmacol Suppl Vol 359 (3): R 64 (241) (Vortrag: K. Giehl) Giehl K, Gierschik P, Adler G and Menke A (1999): Inhibition of epithelial cell proliferation by TGFβ1 is mediated by reduced ERK activation. 13. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie, Rostock, Eur J Cell Biol Suppl 49 (78): 56 (Posterpäsentation: A. Menke) Giehl K, Stähle M, Mansard A and Gierschik P (1999): Activation of ERK1/2 is necessary for growth factor-induced cell migration of pancreatic carcinoma cell lines, but not for fibroblasts. Keystone Symposia: Oncogene networks in Signal Transduction, Keystone (USA) (Posterpräsentation: K. Giehl) Giehl K, Veit C, Genze F and Gierschik P (1999): The neurotrophic factor GDNF stimulates mitogen-activated protein kinases and induces chemotaxis of pancreatic carcinoma cells. 3. Joint Meeting der Signaltransduktions-Arbeitskreise der DGfL, der DGZ und der GBM-Studiengruppe Gentechnik/Biotechnologie, Berlin (Vortrag: K. Giehl) Bachfischer U, Mansard A, Rick B, Schuster A, Gierschik P and Giehl K (2000): Isoformspecific activation of Ras proteins by growth factors in the pancreatic carcinoma cell line PANC- 1. 41. Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für experimentelle und klinische Pharmakologie und Toxikologie, Mainz, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol Suppl Vol 361 (4): 242 (R64) (Posterpräsentation: U. Bachfischer) Veit C, Mansard A, Gierschik P and Giehl K (2000): Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) induces migration of human pancreatic carcinoma PANC-1 cells. 41. Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für experimentelle und klinische Pharmakologie und Toxikologie, Mainz, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol Suppl Vol 361 (4): 261 (R69) (Posterpäsentation: C. Veit) Bachfischer U, Siegert P, Mansard A, Gierschik P and Giehl K (2000): Epidermal growth factor induces N-Ras activation in the K-Ras mutated human pancreatic carcinoma cell line PANC-1. 51. Mosbacher Kolloquium der Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie, GTP- Binding Proteins: Central Regulators in Cell Biology, Mosbach / Baden (Posterpräsentation: U. Bachfischer) Giehl K, Schierling K, Siegert P, Bachfischer U, Veit C and Gierschik P (2000): Functional analysis of GTPases in cellular transformation using EGFP-tagged Ras and Rac1. Millenium Meeting of the Signal Transduction Society (STS), Signal Transduction (2001) Suppl Vol 1: 55 (Posterpräsentation und Übersichtsvortrag Signal transduction through G-Proteins : K. Giehl) 153

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