Wirtschaftskundliches Bundesrealgymnasium 8010 Graz, Sandgasse 40

Wirtschaftskundliches Bundesrealgymnasium 8010 Graz, Sandgasse 40 Praktische Anwendung der Gentechnik - Am Beispiel Humaninsulin als Medikament bei Diabetes mellitus Fachbereichsarbeit aus Biologie und Umweltkunde vorgelegt bei Prof. OStRn. Mag. Ilse Müller von Angelika Hofer, 8. c Klasse Graz, im Schuljahr 2001/2002

Inhaltsverzeichnis: 1. Einleitung... 3 2. Grundlagen über Diabetes mellitus... 4 2.1 Die Definition des Diabetes mellitus... 4 2.1.1 Typ I oder insulinabhängiger Diabetes mellitus... 4 2.1.2 Typ II (nicht insulinabhängiger) Diabetes mellitus... 4 2.2 Problematik... 5 3. Theoretische Grundlagen der Gentechnik... 6 3.1 Was bedeutet Genetic engineering?... 6 3.2 Vektoren... 6 3.2.1 Plasmide... 7 3.3 Gewinnung von spezifischen Genfragmenten... 7 3.4 Schneiden und Modifizieren von DNA... 8 3.4.1 Sticky end und Blunt end Ligation... 8 3.5 DNA-Transfer... 9 3.6 Selektion... 9 4. Rekombiniertes menschliches Insulin... 11 4.1 Insulinstruktur... 11 4.2 Geschichte der Insulinproduktion... 12 4.3 Traditionelle Insulinproduktion und Reinigung... 13 4.4 Umwandlung von Schweineinsulin... 13 4.5 Insulinproduktion mit rekombinanten Methoden... 14 4.5.1 Zwei-Ketten-Methode... 14 4.5.2 Proinsulin-c-DNA-Methode... 15 4.5.3 Proinsulin-Methode mit sezernierenden Bakterien... 16 4.6 Analytische Trennung und Reinigung von Insulin... 17 4.7 Reinigung von Humaninsulin im großtechnischen Maßstab... 17 1

5. Experimenteller Teil... 19 5.1 DNA-Modell... 19 5.2 Isolierung der DNA aus einer Zwiebel... 20 5.3 Praktikum am Institut für Biotechnologie: Herstellung von Insulin mit gentechnischen Methoden... 21 6. Zusammenfassung... 29 7. Versuchsprotokoll... 30 8. Abbildungsverzeichnis... 45 9. Literaturverzeichnis... 46 10. Danksagung... 47 11. Erklärung der Fachbegriffe... 48 2

1. Einleitung Im letzten Jahrzehnt ist eine neue Ära in der Wissenschaft entstanden: Die Gentechnik. Die Gentechnik hat das Potenzial, neue Herzkranzgefäße wachsen zu lassen, Krebs zu besiegen, Lebewesen beliebig zu duplizieren sowie neue Organe aus Stammzellen zu züchten, also kurzgesagt: Ein verlängertes und qualitativ verbessertes Leben! Doch trotz all dieser Fortschritte wird die Gentechnik von größeren Bevölkerungsschichten partiell abgelehnt. Dennoch wird dieses höchst umstrittene Anwendungsgebiet mit größter Wahrscheinlichkeit eine äußerst wichtige Rolle im dritten Jahrtausend spielen. Schon relativ früh haben die Geheimnisse rund um das Erbgut mein Interesse geweckt. Als ich vor die Wahl einer Fachbereichsarbeit gestellt wurde, war für mich sofort klar, eine Arbeit über diese Thematik schreiben zu wollen. Gleich zu Beginn möchte ich hervorstreichen, dass das Hauptgewicht dieser Arbeit auf dem experimentellen Sektor basiert. Die Naturwissenschaften ermöglichen großteils ein intensives, experimentelles Arbeiten. Das war eine ganz wichtige und neue Erfahrung für mich, weil man das experimentelle Arbeiten in der Schule meist nicht lernt, so aber einen besseren Gesamteindruck der Wissenschaft erlangt. Aus diesem Beweggrund habe ich ein neuntägiges Praktikum am Institut für Biotechnologie an der Technischen Universität Graz absolviert. Dies hat mir die Möglichkeit gegeben, Seite an Seite mit Wissenschaftlern zu arbeiten und deren Arbeitsmethoden näher kennen zu lernen. Ich durfte dort eine Versuchsreihe durchführen, um Insulin mit gentechnischen Methoden zu produzieren (siehe Kapitel in der Arbeit). Sicherlich war das ein Sprung ins kalte Wasser, denn ich konnte nicht mit Samplern umgehen, war mit dem Umgang mit hochkomplizierten Zentrifugen nicht vertraut und musste mir die Grundlagen erst aneignen. Umso schöner ist der Rückblick auf den Erfolg dieser geglückten Versuchsreihe. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit erscheint mir hier ebenso nennenswert: Die Zusammenarbeit und der Informationsaustausch mit namhaften Wissenschaftlern, u.a.: Prof. Børge Diderichsen aus Dänemark von der Firma Novo Nordisk. In diesem Zusammenhang möchte ich ebenfalls zuletzt erwähnen, dass die Fachbereichsarbeit nicht nur meinen Wissenshorizont drastisch erweitert hat, sondern ich konnte ebenfalls das eigenständige Arbeiten praktizieren, das mir extrem zukunftorientiert erscheint. 3

2. Grundlagen über Diabetes mellitus 2.1 Die Definition des Diabetes mellitus Die Definition der Erkrankung, Diabetes mellitus, sollte bevorzugt unabhängig von den Krankheitssymptomen erfolgen und die in der Medizin allgemeine Definition wurde von Köbberling niedergeschrieben. Die einfachste und trotzdem umfassende Definition lautet, daß der Diabetes mellitus eine Erkrankung ist, die unbehandelt mit einer chronischen Erhöhung der Blutglucosekonzentration einhergeht. 1 Die biochemischen und klinischen Symptome addieren sich und wirken sich unterschiedlich stark aus. Das Ausmaß der klinischen Symptome hängt von der Schwere und der Dauer der Hyperglykämie ab. 2 Die Spätkomplikationen sind allerdings nicht Teil dieser Definition. 2.1.1 Typ I oder insulinabhängiger Diabetes mellitus Der Typ- I- Diabetes ist durch ein Versiegen der Insulinsekretion charakterisiert. Im Gegensatz zur meist relativ rasch progredienten klinischen Symptomatik des Typ-1-Diabetes beginnt die Zerstörung der Beta-Zellen A bereits Monate bis Jahre vor der klinischen Manifestation der Erkrankung. Diese tritt erst auf, wenn 80 % der Inselzellmasse zerstört sind. 3 Der Typ- I- Diabetes tritt in der Regel bei Kindern und Jugendlichen auf und wird deshalb auch jugendlicher Diabetes genannt. 2.1.2 Typ II (nicht insulinabhängiger) Diabetes mellitus Im Gegensatz zu Typ- I- Diabetes lässt sich der Typ II-Diabetes eventuell mit Diät oder sonstigen Arzneimitteln einstellen. Er tritt hauptsächlich bei älteren Personen auf und ist daher auch als Altersdiabetes geläufig. Dieser macht ca. 90 % der Erkrankungen aus. 1 WALDHÄUSL, W.; GRIES, F. A.: Diabetes in der Praxis. Berlin u.a.: (1996) S. 15 2 ebda. S. 15 3 ebda. S. 25 4

2.2 Problematik Diabetes mellitus gehört zu einer der häufigsten und kostenintensivsten Erkrankungen weltweit. Es wird geschätzt, dass es weltweit 120-140 Millionen Diabetiker gibt und dass sich diese Zahlen höchstwahrscheinlich bis zum Jahr 2025 verdoppeln werden. Die Wachstumsrate der U.S. Population beträgt immerhin 1 % pro Jahr, die Zuwachsrate der Insulinverbrauchsbevölkerung beträgt 5 6 % pro Jahr. In Österreich beträgt die Zahl der Zuckerkranken ungefähr 400.000 von fast exakt 8 Millionen Einwohnern. 4 Es bestehen allerdings nicht nur Unterschiede bei der Zahl der Neuerkrankungen je Jahr regional gesehen, sondern auch für Männer ist die Wahrscheinlichkeit um 20-60% größer als für Frauen. Als Ursache für die in verschiedenen Regionen unterschiedliche Häufigkeit des Diabetes mellitus Typ I werden Abweichungen in der genetischen Ausstattung und Umweltfaktoren erwogen. 5 Die Gesundheitsprobleme, welche bei Diabetes mellitus entstehen, können verheerend sein. Zu spät diagnostiziert und unzureichend behandelt, führt diese Erkrankung zu schweren Folgeerscheinungen, die sich in vielen Organen manifestieren. Die akuten Symptome lassen sich mit Insulin behandeln, jedoch reduzieren Gefäßkomplikationen in späteren Abschnitten dieser Krankheit die Lebenserwartung dreifach. Außerdem erblinden Diabetiker 25mal wahrscheinlicher und sind dem zweifachen Risiko einer Herzerkrankung im Vergleich zu einem Nicht- Diabetiker ausgeliefert. 4 Verbesserung der Diabetikerbetreuung in Österreich. http://www.nagys.at/diabetikerimcircus/zahlen/content.htm, 27.09.2001 5 loc.cit. WALDHÄUSL, W.; GRIES, F. A. S. 3 5

3. Theoretische Grundlagen der Gentechnik 3.1 Was bedeutet Genetic engineering? Seit bekannt ist, dass der Informationsgehalt von Zellen in der Desoxyribonukleinsäure (DNA) B gespeichert ist, brachte das den Nukleinsäuren natürlich enormes Interesse ein. Auf der einen Seite konnte man diese leicht aus der Zelle isolieren und andererseits war bekannt, dass die genetische Information durch eine Veränderung in der DNA (=Mutation) gesteuert werden kann. Aufgrund dieser Erkenntnisse wollte man diese Veränderungen nun ganz bewusst und gezielt durchführen. Damit war der Grundgedanke des genetic engineering (=Gentechnik oder Gentechnologie) geboren: Mit Hilfe von geeigneten molekularbiologischen, biochemischen und mikrobiologischen Arbeitstechniken sollten DNA-Stücke (die auch als Gene bezeichnet werden) isoliert, analysiert, außerhalb der Zelle verändert und schlussendlich wieder in einen Organismus eingebracht werden. 6 3.2 Vektoren Eine wichtige Grundlage für die Manipulation der DNA bilden die Vektoren. Unter Vektoren versteht man Gentaxis, mit deren Hilfe es gelingt, zellfremde DNA in Organismen einzubringen. Man teilt Vektoren aufgrund ihrer Basis in drei verschiedene Gruppen ein: a) Plasmidvektoren b) Phagenvektoren c) Eine Kombination von a) und b) 7 Gerlitz, M., hat in seiner Diplomarbeit erwähnt, dass von diesen drei oben genannten Gruppen besonders die Plasmidvektoren für die biotechnologische Anwendung von Bedeutung seien, während die beiden restlichen Vektorarten nur für spezielle 6 GERLITZ, M.: Untersuchung zur Partitioning-Region des Plasmids RP4. Konstruktion von Deletionsderivaten und Versuche zum Komplementations-bzw. Inkompatibilitätsverhalten. Diplomarbeit. Graz. Technische Universität Graz: (1986) S. 6 7 loc.cit. GERLITZ, M. S. 7 6

Zwecke (z.b.: Phagen für Genbanken und Sequenzierung) verwendet werden würden. 3.2.1 Plasmide Ringförmige und doppelsträngige DNA wird als Plasmid bezeichnet. Ihr Vorkommen ist extrachromosomal innerhalb der Zelle und auf einige Hefespezies beschränkt. Solche extrachromosomalen Elemente konnten in höheren Eukaryoten C nicht nachgewiesen werden. 8 Die Plasmide übernehmen keinerlei Überlebensfunktion der Zelle, aber sie weisen einige nützliche Eigenschaften auf: a) Sie sind relativ klein (ungefähr 100 Gene), damit ist ihre DNA sehr einfach zu isolieren und zu manipulieren. b) Aufgrund ihrer ringförmigen DNA bleiben sie bei chemischer Isolierung stabil. c) Das Vorhandensein vieler Kopien, welche die Vervielfältigung der DNA ermöglicht. d) Es besteht eine Unabhängigkeit des Replikationsursprungs (origin), so dass die Plasmidreplikation getrennt von der der Chromosomen abläuft. e) Antibiotikaresistenz und Abbau spezifischer Substrate 9 In der Gentechnik setzen die Wissenschaftler bestimmte Gene im Reagenzglas in den Plasmidvektor ein. 3.3 Gewinnung von spezifischen Genfragmenten Prinzipiell können spezifische Genfragmente auf vier verschiedene Arten gewonnen werden: 1) Aus einer genomischen Genbank (auch DNA-Bibliothek genannt), wobei die Transformanten auf den gewünschten Klon selektioniert werden. 2) Aus einer cdna-genbank, wenn man Gene sucht, deren Expression für Gewebe spezifisch sind. 3) Aus spezifischen Restriktionsfragmenten durch Subklonierung 4) in vitro DNA-Synthese 10 8 loc.cit. GERLITZ, M. S. 15 9 vgl. MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.; PARKER, J.: Brock Mikrobiologie. Berlin u.a.: (2001) S. 384 10 loc.cit. GERLITZ, M. S. 8 7

3.4 Schneiden und Modifizieren von DNA Um das ausgewählte, bereits isolierte Gen in den Plasmidvektor einsetzen zu können, bedient man sich der Restriktionsenzyme D. Sie sind äußerst wichtige Werkzeuge in der Gentechnik, da sie die Eigenschaft besitzen, in einem Gewirr von DNA, bestimmte Basensequenzen zu finden. An der aufgespürten Stelle schneidet das Restriktionsenzym die Phosphordiester-Verbindung an jedem der zwei DNA- Stränge präzise durch. Wenn die DNA ein Plasmid darstellt, dann öffnet ein solch präziser Schnitt den Ring, in den nun das für diesen Zweck ausgewählte beliebige Gen eingesetzt werden kann. Man unterteilt die Restriktionsenzyme in drei Kategorien: In der Gentechnik sind die Vertreter des Typ II von größtem Interesse, da diese die DNA an genau definierten Stellen (Erkennungssequenzen) zerlegen. 11 Heute können solche Enzyme, von denen weit über 2000 bekannt sind, in einem äußerst breiten Spektrum von diversen Firmen bezogen werden. 3.4.1 Sticky end und Blunt end Ligation Restriktionsenzyme des Typ II, die asymmetrisch schneiden können, hinterlassen entweder einen 3 oder einen 5 Überhang des einzelnen Strangs. Die Basen sind nicht mehr mit ihrem normalen Partner gepaart und können sich daher jederzeit beliebig mit jedem DNA-Stück verknüpfen, das die gleiche Gruppe von überstehenden Basen besitzt. Da sich die DNA-Stücke, welche mit demselben Restriktionsenzym geschnitten wurden, einander anziehen, spricht man auch von sticky ends. Abbildung 1: Sticky-end Restriktionsenzym (EcoRI) 11 vgl. Bios 312 Day 2 Lab Protocols. http://www.owlnet.rice.edu/~bios311/bios312day2.html, 11.10.2001 8

Ein anderer Restriktionsendonukleasetyp wird blunt-end genannt, der die Spaltung an angrenzenden Stellen hinterlässt. Abbildung 2: Blunt-end Restriktionsenzym (HaeIII) Relativ kurze Sequenzen, die von Restriktionsenzymen erkannt werden, sind häufig Palindrome E, wobei die Sequenz von 5 -Phosphat -> 3 -OH-Gruppe beziehungsweise von 3 -OH-Gruppe -> 5 -Phosphat gelesen werden kann. Um die länger anhaltende Bindung herzustellen, bedient man sich eines weiteren Enzyms, der DNA-Ligase. Sie verleiht dem rekombinierten Molekül die erwünschte Stabilität. 3.5 DNA-Transfer Der DNA-Transfer kann auf mehrere Arten durchgeführt werden: 1) Transformation: Bei diesem Vorgang wird freie DNA in eine Empfängerzelle aufgenommen und eingebaut. 2) Transfektion: die Transformation einer Prokaryotenzelle durch DNA oder RNA aus einem Virus. 3) Transduktion: Diese Art des Transfers beinhaltet die Übertragung von Wirtsgenen von einem Bakterium auf ein anderes durch Viren (verläuft analog einer Virusinfektion). 3.6 Selektion Die gewünschten Genotypen F werden durch geeignete Selektionsmaßnahmen als Reinkulturen gewonnen. 9

Es gibt nun drei Arten von Zelltypen im Bakteriengemisch: 1) Bakterien mit normalem Plasmid, das nicht das rekombinierte Gen in sich trägt 2) Bakterien ohne Plasmid 3) Bakterien die ein Plasmid mit dem rekombinierten Gen aufgenommen haben Nur diese dritte Art ist erwünscht. So ermöglichen bestimmte Gene im Plasmid, die eine Resistenz gegen Antibiotika G auslösen, durch Inkubation auf Antibiotika- Nährböden, diejenigen Zellen in einem Genotypen-Gemisch zu finden, die das Fremdgen übertragen bekommen haben. Weiters gibt es mehrere Wege, um die Klone mit dem gewünschten Gen zu isolieren. Eine Variante wäre der Test mit radioaktiven Antikörpern. Nun kann man die Originalkultur nehmen und die entsprechenden Kolonien weiterzüchten. 10

4. Rekombiniertes menschliches Insulin 4.1 Insulinstruktur Insulin ist ein starkes Polypeptidhormon der Bauchspeicheldrüse, das blutzuckersenkend wirkt und direkt oder indirekt jedes Organ oder Gewebe im Körper beeinträchtigt. Die Produktion findet in den β-zellen der Langerhanschen Inseln des Pankreas statt. Es gibt drei Insulinformen: 1) Präproinsulin, das Primärprodukt der Translation H, mit dem Signalpeptid (Leader) und den kompletten A-, B- und C-Abschnitten 2) Proinsulin, dem die Leadersequenz gänzlich fehlt 3) Insulin 12 Proinsulin wird aus Präproinsulin gebildet und die Umwandlung von Proinsulin zu Insulin beinhaltet eine enzymatische Abspaltung der Verbindungsschleife, die 35 Aminosäuren lang und als C-Peptid bekannt ist, ein verbindendes Polypeptid der A- und B-Kette. Das Insulin wird dann in den Zellen in Form von Zinksalzkristallen gespeichert. Abbildung 3: Struktur des menschlichen Proinsulins 12 WATSON, J.D.; TOZE, J.; KURTZ, D.T.: Rekombinierte DNA. Heidelberg: (1983) S. 197 11

Das aktive Insulin ist ein gut definiertes Peptid mit bekannter Aminosäurensequenz. Es besteht in seiner aktiven Form aus zwei separaten Peptidketten, welche sich aus der A-Kette (21 Aminosäuren) und B-Kette (30 Aminosäuren) durch zwei Disulfidbrücken I miteinander verbinden. Menschliches Insulin und Schweineinsulin unterscheiden sich in nur einer einzigen Aminosäure, während sich Rinder- und Humaninsulin in drei Aminosäuren unterscheiden. Da Insulin ein relativ kleines Molekül mit einer Masse von 5800 Dalton ist, eignet es sich für die Studien von Peptidsequenzen und Strukturen. Die Aminosäuresequenz von Insulin wurde 1955 erstmals von F. Sanger 13 entschlüsselt. Wissenschaftlich gesehen ist das ein wichtiger Schritt gewesen und hat seitdem der Proteinforschung einen gewaltigen Auftrieb gegeben. 4.2 Geschichte der Insulinproduktion Insulin hat eine lange und äußerst interessante Geschichte. Frederick Banting und Charles Best 14 behandelten im Jahre 1922 den ersten menschlichen Patienten mit einem Insulinpräparat, das aus tierischer Bauchspeicheldrüsenextraktion gewonnen wurde. Zunächst wurde Insulin bis 1972 aus dem Pankreas von Schweinen und Kühen aufbereitet. Die Insulinproduktion war für die Verbesserung der Lebensqualität und für die Lebensverlängerung der Erkrankten von großer Wichtigkeit, weil diese ansonsten mit großer Wahrscheinlichkeit langsam gestorben wären. Die laufenden Verbesserungen in der Insulinreinigung zwischen 1970 in der Produktion eines stabilen Arzneimittels mit einer voraussagenden Wirkungszeit waren äußerst erfolgreich. 1950 entwickelte Novo Nordisk Insulinkristalle mit einem hohen Zinkanteil, ganz im Gegensatz zum herkömmlichen amorphen J Insulin, das sehr schnell absorbiert wurde. Nach der überraschenden Entwicklung von rekombinierten DNA- Technologien folgte 1982 die Produktion sowie die therapeutische Verwendung des ersten rekombinierten Produkts: Humaninsulin. 13 KARLSON, P.: Kurzes Lehrbuch der Biochemie für Mediziner und Naturwissenschaftler. Stuttgart: (1974) S. 34 14 vgl. LADISCH, M.R.; KOHLMANN, K.L.: Review. Recombinant Human Insulin. Biotechnol. Prog. 8 469-478. (1992) S. 469 12

Das rekombinierte Humaninsulin hat gegenüber dem traditionellen Insulin, das durch Pankreasextraktion gewonnen wurde, zwei Vorteile. Aufgrund der technischen Produktion ist hier praktisch eine völlig uneingeschränkte Versorgung von rekombiniertem Humaninsulin gegeben, außerdem ist dieses völlig identisch mit dem menschlichen Insulin. Ein wichtiger Antrieb für die Entwicklung des rekombinierten Humaninsulinprozesses war, dass aufgrund des steigenden Bedarfes ein Mangel an Rinder- und Schweinebauchspeicheldrüsen in den siebziger Jahren entstand. 4.3 Traditionelle Insulinproduktion und Reinigung Gefrorenes Rinder- oder Schweinebauchspeicheldrüsengewebe wird in Würfel geschnitten, mit Ethanol gelöst, und zunächst auf einen bestimmten ph-wert mit HCl K oder H 2 SO L 4 angesäuert. Dadurch soll das Enzym Trypsin unwirksam gemacht werden, welches das Insulin degradieren könnte. Um diese Lösung zu neutralisieren, wird Calciumcarbonat hinzugeführt und anschließend bei niederen Temperaturen im Vakuum konzentriert. Mit Hilfe von einem bestimmten Salz wird das Insulin dann gefällt und danach wird dieses Hormon wieder in Wasser aufgelöst. Zuerst wurde das Insulin aus tierischem Gewebe mit Extraktionsverfahren gereinigt, gefolgt von chromatographischen Trenntechniken. Solche Reinigungsverfahren sind Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie. Proinsulinähnliche Materialien müssen während des Reinigungsverfahrens unbedingt entfernt werden, da sie immunologische Nebenerscheinungen hervorrufen können. 15 4.4 Umwandlung von Schweineinsulin Diese Umwandlung basiert auf dem komplizierten Austausch des B 30 Alaninrückstands von Schweineinsulin mit Threoninrückstand. Fünf Stufen führen zum halbsynthetisierten Humaninsulin. 15 vgl. loc.cit. LADISCH, M.R.; KOHLMANN, K.L. S. 470 f. 13

Wie schon im vorhergehenden Kapitel erklärt wurde, wird Insulin zuerst aus gefrorenen Schweinebauchspeicheldrüsen extrahiert und durch herkömmliche Prozesse gereinigt. Die eigentliche Umwandlung des Schweineinsulins in menschliches Insulin erfolgt in einem speziellen Medium, welches neben einer kleinen Menge Wasser und Trypsin eine große Menge von organischen Lösungsmitteln und ein Threoninester enthält. Das Trypsin hydrolisiert das Insulin an der Gruppe Lys B29 -Ala B30 bei der ein Threoninester das Alanin an der Position B 30 ersetzt. 16 Bei dieser Eiweißübertragungsreaktion kann eine Ausbeute von ungefähr 97% erreicht werden. Dieser Reaktion muss die chromatographische Reinigung folgen, womit messbare Rückstände von Proinsulin sowie andere Reagentien entfernt werden. 4.5 Insulinproduktion mit rekombinanten Methoden Insulin von manipulierten Mikroorganismen produzieren zu lassen, bedeutet nicht einfach, ein Gen in einen Expressionsvektor zu klonieren, sondern es handelt sich um einen aufwendigen Prozess, der im wesentlichen aus zwei Hauptschritten besteht: Fermentation und Reinigung. Das Insulin im aktiven Zustand wird von getrennten Teilen eines einzigen Insulingens codiert 17. Einige der verschiedenen Methoden der Insulinproduktion werden nun in den nächstfolgenden Kapiteln erklärt. 4.5.1 Zwei-Ketten-Methode Die A- und B-Kette wird bei dieser Methode in zwei getrennten Escherichia coli Bakterienkulturen hergestellt und anschließend werden die beiden Ketten mit Hilfe von chemischer Verknüpfung zum aktiven Insulin verbunden. Das Insulinprotein ist relativ klein und so ist es einfacher die DNA-Sequenz synthetisch herzustellen, anstatt das Insulingen aus dem menschlichen Gewebe zu isolieren. 63 Basen codieren die A-Kette und 90 Basen die B-Kette 18. 16 vgl. loc.cit. LADISCH, M.R.; KOHLMANN, K.L. S. 472 17 loc.cit. MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.; PARKER, J. S. 412 18 ebda. S. 412 14

Nach der synthetischen Herstellung der Polynukleotide werden die Fragmente mit EcoRI und BamHI Restriktionsschnittstellen versehen und anschließend mit einem Plasmidvektor so ligiert, dass die Insulinketten mit einem Teil eines vom Vektor codierten Proteins als Fusionsprotein gebildet werden. Der Grund für die Wahl des Fusionsproteins liegt darin, dass es um vieles stabiler ist als Insulin selbst. Außerdem wird auch die Einsetzrichtung beachtet: Die synthetisierten Gene werden stromabwärts eingesetzt, um eine effektive Expression zu erreichen. 19 Es befindet sich ein Nukleotidtriplett zwischen dem Insulingen und dem ß-Galactosidase M - Fusionsprotein, welches Methionin N codiert. Ein logischer Grund für diese Vorgangsweise ist, dass das chemische Reagens CNBr O die Polypeptidketten spezifisch an den Methioninstellen spaltet und so die Freisetzung der jeweiligen Kette vom ß-gal-Fusionsprotein ermöglicht. Durch diesen Vorgang wird das Insulingen selbst nicht angegriffen. Nach der Fermentation der Zellen, vorzugsweise E. coli werden die Zellen aufgearbeitet und aufgebrochen. Die weiteren Arbeitsschritte sind nicht genau publiziert worden. Anschließend folgt die Reinigung. Die Peptide werden dann durch geringe Mengen von Mercaptan dazu gebracht, sich im Verhältnis 2:1 der A:B (S- sulfonierte Form) zu falten und zu kombinieren. 20 4.5.2 Proinsulin-c-DNA-Methode Ein weitaus weniger kompliziertes Verfahren stellt die Proinsulin-Methode dar, weil die A- und B-Ketten nicht getrennt hergestellt werden müssen. Die Proinsulinroute ist heute die geläufige Methode für die großtechnische Insulinproduktion. Bevor die Information des Proinsulins in einen Vektor eingeschleust wird, muss die m-rna in c-dna kopiert werden und das Methionincodon (ATG) wird synthetisiert und an das 5 -Ende der Proinsulin c-dna angehängt. 21 Dieses Konstrukt wird, wie in den vorgehenden Kapiteln schon eingehend beschrieben, in einen Vektor eingebaut und in E. coli vermehrt. Das Proinsulin wird hier aus dem Bakterium herausgeholt, indem das Methionin-Bindeglied zerstört wird. Das Proinsulin wird hier mit Hilfe von Bromcyan gewonnen, das die Verbindungsschleife abspalten muss, und anschließend durch Disulfidbrückenbildung in das aktive Insulin umwandelt. 19 vgl. MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.; PARKER, J.: Brock Mikrobiologie. Berlin u.a.: (2001) S. 412 20 vgl. loc.cit. LADISCH, M.R.; KOHLMANN, K.L. S. 472 21 ebda. S. 473 15

Abbildung 4: Eine schematische Darstellung der Proinsulin-c-DNA-Methode Die mrna der Pankreaszellen wird in cdna umgeschrieben und weiters folgen alle notwendigen gentechnischen Methoden: (1) Das Genfragment wird mit dem Plasmidvektor ligiert. (2) Der DNA-Transfer in E.coli Bakterien folgt. Die Selektion ist der nächste wichtige Schritt der folgen muss, wobei das Antibiotikaresistenzgen genutzt wird (siehe Plasmidring). 4.5.3 Proinsulin-Methode mit sezernierenden Bakterien Natürlich strebten die Forscher nach einer Produktionsmöglichkeit mit extrem hoher Ausbeute. Watson schlug eine Alternative vor, bei der große Mengen von Fremdproteinen durch die Bakterien direkt ins Medium ausgeschieden werden. Hier, im Fall von Insulin, könnte das rekombinante Protein aus Proinsulin und β- Lactamase bestehen. Dieses Enzym deaktiviert Penecillin P und wird natürlicherweise von den Bakterien nach außen hin abgegeben. 22 Die β-lactamase wirkt als Träger für das sezernierende Q Proinsulin. Für diese Methode kommen auch Hefen in Frage, weil sie nur wenige ihrer eigenen Proteine ausscheiden. 22 WATSON, J.D.; TOOZE, J.; KURTZ, D.T.: Rekombinierte DNA. Eine Einführung. Heidelberg: (1983) S. 197 16

4.6 Analytische Trennung und Reinigung von Insulin Bevor die Reinigung einer Substanz erfolgt, muss vorher ein Nachweis der Proteinverunreinigungen erfolgen. Die RP-HPLC (Verkehrte Phasen Hochleistungs-Flüssigchromatographie) über Alkylsilan R -Trägern 23 ist die Standardmethode für die Analyse von Insulin. Die hohe Selektivität und hohe Auslösung der RP-HPLC mit vielen verschiedenen stationären und beweglichen Phasen erlauben die Trennung von Insulin und Proteinen, die sich nur durch einzelne Aminosäure unterscheiden. Der Mechanismus der Insulintrennung basiert auf den hydrophoben S Eigenschaften von Insulin und verwandter Verbindungen. Große Proteine tendieren sehr leicht an die stationäre Phase zu binden, sodass diese Proteine schwer eluiert T werden können, und so sind die Alkylsilan-Träger optimal dafür einsetzbar 24. Eine weitere gängige Methode der Insulinanalyse und Trennung stellt die Elektrophorese dar. 4.7 Reinigung von Humaninsulin im großtechnischen Maßstab Die Reinigung eines Proteins erfordert eine Technologie, die sich von der gewöhnlichen Proteinreinigung oder Analytik klar unterscheidet, denn für Arzneimittel in der Praxis wird eine wesentlich höhere Reinheit benötigt. Einerseits müssen Lösungsmittel und Giftstoffe von E.coli beseitigt werden, anderseits ebenso die Nährstoffe, Metabolite U, Katabolite V und funktionelle Moleküle der Gastzellen, die während des Wachstums in E.coli entstehen. All diese Erfordernisse müssen bei der großtechnischen Reinigung unbedingt berücksichtigt werden. Ein wichtiger Aspekt, der hierbei zu erwähnen wäre ist, dass die Reinigung des Insulins wesentlich mehr kostet als die Fermentation (=Herstellung) selbst. Es gibt nur wenig Literatur über die detaillierte Vorgangsweise einer kompletten großtechnischen Reinigung. Ich habe mit Prof. Borge Diderichsen, einem Öffentlichkeitsbeauftragten von Novo Nordisk, Kontakt aufgenommen und er hat mir erklärt, dass die Firma keinerlei Information über die Reinigungsmethoden erteilt. 23 vgl. loc.cit. LADISCH, M.R.; KOHLMANN, K.L. S. 474 24 ebda. S. 475 f. 17

Obwohl mit diesen Methoden bereits hochreines Insulin hergestellt werden kann, beschäftigt sich die Forschung immer noch mit der Verbesserung dieser Reinigungsprozeduren, da der Bedarf an Insulin mit geringst möglichen Verunreinigungen wächst und auch die hohen Kosten der Reinigung vermindert werden sollen. 18

5. Experimenteller Teil 5.1 DNA-Modell Um die Struktur der Erbsubstanz (DNA) besser nachvollziehen zu können, habe ich mich kurzerhand dazu entschlossen, ein stark vereinfachtes Modell zu bauen. Die vier Nucleobasen dieser Molekülstruktur: Adenin (rot), Thymin (grün), Cytosin (blau), und Guanin (gelb) werden hierbei durch vier verschiedenfärbige Bausteine dargestellt. Abbildung 5: Modell der DNA Abbildung 6: Modell der DNA Die zwei Restbestandteile Desoxyribose (silbrig) und der Phosphatstrang (weiß) vollenden die molekulare Struktur des kurzen DNA-Abschnitts. Um das Modell getreu nachbauen zu können, muss man sich stets vor Augen halten, dass sich Adenin immer mit Thymin (Purinbasen) und Guanin immer mit Cytosin (Pyrimidinbasen) 19

paart. Die beiden Seitenstränge des Modells verlaufen antiparallel, das bedeutet, dass sie in entgegengesetzter Richtung verlaufen (Doppelhelix). 5.2 Isolierung der DNA aus einer Zwiebel Im Rahmen der Scienceweek 2001 besuchte ich das Institut für Biotechnologie an der Technischen Universität Graz, wobei neben einer Vorlesung der Arbeitsgruppe Genetik sowie einer Institutsführung auch ein Versuch, der als Genknacker bezeichnet wird, gezeigt wurde. Dieser Versuch hat mein Interesse geweckt und ich habe mich an die Arbeit gemacht, ihn einmal selber durchzuführen. Bei diesem relativ einfachen Experiment besteht der Grundgedanke darin, die DNA aus den Zwiebelzellen herauszulösen. Dazu sind einige wichtige chemische Arbeitsschritte notwendig, die ich hier kurz beschreiben möchte: 1) Eine Zwiebel würfelig schneiden, 3 g Tafelsalz mit 10 ml Spülmittel vermischen. Auf 100 ml Wasser auffüllen und durch ständiges Umrühren das Salz lösen. 2) Die zerschnittene Zwiebel der Lösung beifügen, denn das Spülmittel zerstört die Zellmembranen und die DNA tritt aus den Zellen heraus. 3) Die Lösung wird für 15 Minuten bei 60 C erwärmt, da die Wärme den Löseprozess fördert und die DNAsen denaturiert, die die DNA degradieren würden. 4) Anschließend wird die Lösung für einige Minuten auf Eis abgekühlt. 5) Die abgekühlte Lösung muss jetzt 5 Sekunden gemixt werden, aber auch hierbei muss die Zeit eingehalten werden, ansonsten würde die DNA ebenfalls zerstört werden. 6) Die Suspension abfiltrieren, das trennt die Zellwandbestandteile von dem DNA-Protein-Gemisch ab. 7) Zwei bis drei Tropfen Protease zu 10 ml Zwiebelextrakt hinzufügen. Die Protease hat die Aufgabe, die Proteine in der DNA-Lösung zu zerstören. Ich habe die Protease (Enzym) von der Firma Merck bezogen, obwohl diese vermutlich nicht ganz Nuclease-frei ist. Normalerweise ist anzuraten, die Proteinase K (Z.B.: von Roche) bei solchen DNA-Präparationen zu verwenden. 8) Im letzten Arbeitsschritt wird die gleiche Menge eiskaltes Ethanol beigefügt. Die DNA fällt jetzt aus, weil die sich nicht in Ethanol lösen kann. 25 25 Institut für Biotechnologie an der Technischen Universität Graz: Scienceweek. (2001) 20