Regulation der Genexpression: regulierbare Promotoren, Proteine und sirna Biochemie Praktikum Christian Brendel, AG Grez
Ebenen der Genregulation in Eukaryoten Cytoplasma DNA Zellkern Introns Exons Chromatin Gen Transkription Cap RNA Processing AAAAA mrna AAAAA RNA Stabilität und Transport RNAi Protein AAAAA Protein Tuning Translation Protein Reifung/Modifikation
Regulation auf Ebene der Transkription Beispiele: 1. Metallothionein Promoter 2. Tetracyclin regulierbare Systeme 3. Steroidrezeptor abgeleitete Systeme und viele mehr.
1. Metallothionein Promoter GRE MRE MRE MRE MRE GC TATA 260 150 140 70 60 50 20 0 MRE: Metal responsive elements Promoter des Metallothionein1 Gens der Maus wird durch Schwermetalle aktiviert (zu Beginn wurde dafür Cadmium benutzt) Genprodukt dient der detoxifikation Spätere, modifizierte Varianten des Promoters erlauben die Aktivierung mit Zink Nachteile: System ist sehr leaky Metalle sind oft entweder toxisch oder beinflussen massiv die Physiologie (Zink) Meist längere Zeiten bis der Promotor wieder inaktiv wird (besonders in vivo)
2.Tetracyclin regulierbare Systeme Tn10 Transposon aus E. coli codiert für Tetracyclinresistenz Promoter TRE TRE Tet Repressor Tetracyclin +Tetracyclin Promoter TRE TRE Tet Operator
Tet Repressor System PCMV Tet Repressor PCMV Tet Repressor Dox + Dox teto Reporter Gen teto Reporter Gen Dox: Doxycyclin ein Tetracyclin Analogon
Tet Off/On Systeme Weiterentwicklungen : Der Tet Repressor ist mit einem Transregulator fusioniert Tet Off Promoter TetR VP16 Transaktivator Domäne tta Tetracyclin regulierbarer Transaktivator DNA Bindedomäne Tetracyclin Bindestelle
Tet Off Tet On Tet Off: ist Tet da, keine TK Tet On: ist Tet da, dann TK
Vor und Nachteile von Tet Regulierbaren Systemen: Relativ hohes Maß an Aktivierung Einfach und vielseitig, funktioniert in fast allen Zellen und auch in vivo (Mausmodellen) Mit Doxycyclin gute Verfügbarkeit im gesamten Organismus (alle Zellen werden erreicht. Systeme sind zu leaky, um toxische Proteine zu exprimieren.
3. Steroidrezeptor abgeleitete Systeme Estradiolrezeptor Estradiol Zelle Zielgen NNAGGTCANNNTGACCTNN Estrogen response element
Prinzipieller Aufbau: Rezeptor Aktivator Liganden Bindung Ecdysonrezeptor GAL4 DNA Bindedomäne (aus Hefe) DNA Bindung Dimerisierung Transaktivator VP16 Transaktivator Domäne aus HSV Retinsäurerezeptor (RXR) Dimerisierungsdomäne
RheoSwitch System (New England Biolabs)
Vor und Nachteile : Sehr hohes Maß an Aktivierung (10.000X) Sehr geringe basale Aktivität Der Ligand besitzt gute Eigenschaften in Bezug auf Nebenwirkungen, Stabilität und Biodistribution und availability
Regulation auf RNA Ebene: RNA Interferenz (RNAi) natürlicher Mechanismus in eukaryotischen Zellen wichtige Rolle in der Genregulation und Abwehr von Viren hemmt die Expression einzelner Gene post transkriptionell oder translationell führt zur Spaltung oder zur Translationsblockade einer Ziel mrna reduziert somit die Produktion spezifischer Proteine RNA als Ziel erkennendes Molekül mirna sirna shrna
RNA interference Dicer RISC Dicer: Rnase III Ribonuclease, Spezifität für dsrna, Schnitt alle ~ 22 Nukleotide 5 Phosphat, 3 Überhang RISC: RNA induced silencing complex 250K Precursor Complex 100K aktiver Komplex nach Bindung von ATP und unwinding von dsrna zu ssrna
mirna micro RNA kleine ssrna (17 23Nt): biologisch aktive Form ca.1 3% der Gene im Genom höherer Eukaryonten kodieren für spezielle mirnas endogene RNAs spielen bei der Steuerung einer Vielzahl von zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle wirken hauptsächlich über RNAi, als negative Regulatoren der Genexpression auf Translationsebene
mirna Transkription der mirna Gene durch RNA Pol II im Kern: pri mirna (primary mirna): Prozessieren der pri mirna durch Drosha (RNase III) im Kern: pre mirna (precursor mirna): Transport über den Exportin 5 Rezeptor ins Cytoplasma Schneiden der pre mirna durch Dicer (RNase III): ds mirna: Einbau des anti sense Stranges in den RISC Komplex: Erkennen und Binden der komplementären mrna: a) vollst. Basenpaarung: Abbau der mrna b) unvollst. Basenpaarung: Hemmung der Translation
mirna mirnas haben generell keine perfekte Komplementarität zum Target, daher bildet sich ein Loop aus typisches Merkmal von mirnas
sirna small interfering RNA kurze dsrna (19 28 Nt) mit Einzelstrangüberhängen Entstehung: a) herausgeschnitten aus langer dsrna (z.b durch viralen Befall) durch das Enzym Dicer b) synthetisch Transfektion von Zellen wirken über RNAi und führen somit zu einer verminderten Expression spezifischer Proteine (knockdown) Hinweise auf die physiologische Bedeutung betreffender Gene
Auswahlparameter für target sequence 19 23nt unique sequence (max. 15bp matches zu anderen Genen) Bereich der CDS Sequenzen sollen nicht im Bereich von 100bp des TK Starts bzw. der TK Termination sein Base an +1 Position soll ein Purin sein (für POL III Effizienz) Die Haarnadel Struktur soll im 5 Bereich des top strands stabiler sein als in seinem 3` Bereich Für bessere Effizienz des Silencing sollten die beiden Bases unmittelbar upstream der Target Sequence AA sein GC Gehalt zwischen 30% und 70%, möglichst weniger als 50% Online Tool benutzen
sirna
sirna Vorteile der Transfektion mit sirna: schnell und unkompliziert gute Transfektionseffizienz kaum toxisch Nachteile der Transfektion mit sirna: Synthese der RNA: teuer nur knockdown, kein knockout geringe Proteinmengen reichen z.t. aus, um die normale Proteinfunktion zu erhalten transiente Transfektion Proteinmenge steigt wieder mit fortlaufender Zellteilung
shrna: short hairpin RNA kurzes RNA Transkript (< 23 Nt), das sich zu einer Stammschleife falten kann Dicer führt über den Mechanismus der RNA Interferenz zum knockdown spezifischer Proteine Einbringen in die Zelle mittels eines Plasmid Vektors stabile Transfektion kontinuierliche Expression der shrna kontinuierliche Repression der Translation spezifischer Proteine
Vektorbasierte RNAi
Nebenwirkungen
Regulierbare Proteine
Regulierbare Proteine Beispiel: ProteoTuner von Clontech
Ebenen der Genregulation in Eukaryoten Cytoplasma DNA Zellkern Introns Exons Cap Gen Transkription Tet Off/On Steroid Rezeptor Systeme AAAAA mrna Protein AAAAA AAAAA RNA Stabilität RNAi Translation Proteinmodifikation Protein Tuning
sirna Video Ende