Schwermetalle und Pflanzen - eine komplizierte Beziehung (II) Schwermetall-Hyperakkumulation im Wilden Westen modified from:
Die Dosis macht das Gift - auch bei Schwermetallen! hemmend Effekt förderlich nur Schadstoff (z.b. Quecksilber) Mikronährstoff (z.b. Kupfer) Konzentration
Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität Ein scheinbar intakter, natürlicher Bachlauf - die Elodea canadensis darin war jedoch an Zn-Vergiftung eingegangen, die ihr Chlorophyll in Zn-Chlorophyll umgewandelt hatte. Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295), 259-66
Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität (II) Wo? Wodurch? Für Wen? Natürlicherweise auf schwermetallhaltigen Böden (Cu: z.b. in Zaire, Afrika; Zn/Cd: rel. häufig, auch in Mitteleuropa; Nickel: rel. häufig, Serpentinböden z.b. in Afrika, Australien, Nord- und Mittelamerika): Schwermetallkonzentrationen hoch genug für Toxizität gegen die meisten Organismen. Natürlicherweise in kupferhaltigen Bereichen der Ozeane (z.b. Sargasso-See): Kupferkonzentrationen im nanomolaren Bereich hemmen bereits empfindliche Cyanobakterien. Anthropogen wegen Einsatzes von Schwermetallsalzen (z.b. CuSO 4, z.b. Zn-Phosphid, Zn-Borat, Zn-Fluosilikat): Konzentrationen im mikromolaren Bereich sind toxisch für viele Pflanzen, v.a. Wasserpflanzen in angrenzenden Gewässern Anthropogen durch Erz-Abbau und -Verhüttung, Konzentrationen in der Umgebung von Minen, Hütten und Abraumhalden können extrem hoch und für alle Organismen toxisch sein. Anthropogen in geringerem Umfang auch durch andere Industrien. Der Rhein enthielt in den 70er Jahren bis zu 0.5 µm Kupfer, was für empfindliche Wasserpflanzen wie Stratiotes oder Elodea bei längerer Einwirkung letal ist.
Wirkungsmechanismen von Schwermetall-Toxizität und Resistenz-Mechanismen, die diese gezielt verhindern --> Hemmung der Wurzelfunktion --> direkte Hemmung der Photosynthese --> oxidativer Stress, entweder direkt durch die Schwermetall hervorgerufen oder durch die Fehlfunktion der Photosynthese induziert. --> Substitution von aktiven Zentren in Enzymen --> Hemmung der Atmung und anderer weniger sensitiver Prozesse
1. Hemmung der Wurzelfunktion Warum Wurzeln? Bei terrestrischen Pflanzen ist die Wurzel generell das erste Organ der Pflanze, das mit den Schwermetallen in Berührung kommt. Bei Schwermetallen mit relativ geringer Mobilität, z.b. Cu +, werden auch die höchsten Konzentrationen in der Wurzel erreicht Mechanismen Kompetition in der Aufnahme mit weniger verfügbaren essentiellen Spurenelementen, da z.t. von denselben Proteinen transportiert: umstritten da widersprüchliche Daten Vermutlich Hemmung von Transportproteinen Diverse relativ unspezifische Inhibierungen von cytoplasmatischen Enzymen Hemmung der Zellteilung (Wirkmechanismus unbekannt) Also Folge der Wurzeltoxizität sterben zunächst die Wurzelhaare und Wurzelspitzen ab
1. Hemmung der Wurzelfunktion: Resistenzmechanismen Strategien Verringerung der unspezifischen Durchlässigkeit der Wurzel für unerwünschte Schwermetalle: Expression von Peroxidasen verstärkt Lignifizierung Aktive (ATP-abhängige) Ausschleusung durch Efflux-Pumpen: Wurde für Cu in Silene vulgaris und für diverse Metalle in Bakterien gefunden.
2. Direkte Hemmung der Photosynthese 2.1. Angriffspunkte in den photosynthetischen Lichtreaktionen heavy metals P700* A 0 A 1 Antenna Chl-protein complexes, main protein: LHCII 4 h ν Chl Chl excitation energy transfer Chl P680* P680 Pheo QA Q B PQ electron transport FeS/ Rieske PC P700 Chl Chl E 4 WSC e- 2 H 2 O O 2 + 4 H +
2.1. Der Mechanismus der Hemmung der photosynthetischen Lichtreaktionen ist in Chlorophyta lichtabhängig Schatten-Reaktion Bei geringer Lichtintensität mit einer Nachtphase ist der größte Teil der Antennenchlorophylle (v.a. LHCII) der Mg- Substitution zugänglich. Werden dabei stabile Schwermetallchlorophylle wie z.b. Kupferchlorophyll gebildet, bleiben die Pflanzen auch nach ihrem Absterben grün. Sonnen-Reaktion In hoher Lichtintensität ist dagegen nur ein kleiner Anteil der Chlorophylle der Mg- Substitution zugänglich, statt dessen findet die Hemmung direkt im PSIIRC statt. Der größte Anteil der Chlorophylle bleicht im Zusammenhang mit der Zerstörung des Photosyntheseapparates aus. Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58, 125-33
Warum sind Schwermetallchlorophylle untauglich zur Photosynthese? Instabiler S1-Zustand Blauverschobene Absorptionsbande des S1-Zustandes Wegen der vorgenannten Gründe wirken Schwermetallchlorophylle in einem Mg-Chlbasierten System als schwarze Löcher für Anregungsenergie nur wenige (3-10) Prozent des Gesamtchlorophylls müssen in Schwermetallchlorophyll umgewandelt werden, um komplette Hemmung der Photosynthese zu erreichen. Schwermetall-Chlorophylle haben eine geringere Tendenz als Mg-Chl, eine Ladungstrennung durchzuführen. Schwermetall-Chlorophylle binden, im Gegensatz zu Mg-Chl, axiale Liganden nur schwach (z.b. Zn-Chl) oder gar nicht (Cu-Chl)
Vergleich von Gausaustausch und steady state-fluoreszenz in Elodea gestresst mit 0.2 µm Cu 2+ im Schwachlicht µ y 100 100 net photosynthetic oxygen release 80 60 40 20 0 photosynthesis fluorescence 80 60 40 20 fluorescence -20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 days of heavy metal stress
UV/VIS -Spektroskopie: Sonnen vs. Schattenreaktion Spektren von E. canadensis Extrakten In vivo Spektren von E. canadensis Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295), 259-66 Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58, 125-33
Hemmung des PSIIRC Diskutierte Mechanismen Hemmung des wasserspaltenden Komplexes Hemmung der primären Ladungstrennung: - durch Bindung ans D1-Protein - durch Insertion ins Pheophytin Hemmung des Elektronentransports - durch Bindung an Q a -Domäne des D1-Proteins - durch Bindung an nicht-häm-fe- Dömäne des D1-Proteins
2.2. Hemmung der Dunkelreaktionen der Photosynthese (Calvin-Cyclus) Indizien aus Messungen der Chlorophyll-Fluoreszenz-Kinetik Mechanismus und Bedeutung unklar
3. Oxidativer Stress Bedeutung Umstritten: Studien mit geringen aber noch toxischen Schwermetall-Konzentrationen zeigen oft keinen oxidativen Stress Mechanismen Direkt: Katalysiert von redox-aktiven Metallionen (Fe 2+, Cu + ) werden aus Wasserstoffperoxid durch die Fenton-Reaktion reaktive Sauerstoff-Radikale: Indirekt: Durch Fehlfunktion der Photosynthese und Atmungskette können reaktive Sauerstoff-Spezies entstehen. Deswegen kann auch bei in vivo redox-inerten Metallionen wie Zn 2+ und Cd 2+ oxidativer Stress auftreten. Oxidativer Stress kann zur Oxidation von Lipiden in Membranen und somit zu deren Undichtigkeit führen. Populärer aber in seiner Bedeutung in vivo umstrittener Mechanismus.
3. Resistenzmechanismen gegen oxidativen Stress Verstärkte Expression von Enzymen, die reaktive Sauerstoffspezies entgiften (Superoxid-Dismutase+Katalase. Problem: Hemmung der Zn-Aufnahme ( SOD) bei Cd-Stress. Synthese von nicht-enzym-antioxidantien, z.b. Ascorbat und Glutathion Umbau der Zellmembranen, um sie resistenter gegen den Angriff von reaktiven Sauerstoff-Spezies zu machen: - Lipide mit weniger ungesättigten Bindungen - Austausch von Phosphatidylcholin durch Phosphytidyl-Ethanolamin als Lipid- Kopf - Verringerter Anteil von Lipiden und erhöhter Anteil von stabilisierenden Proteinen in der Membran
4. Allgemeine Resistenz-Mechanismen 4.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden Phytochelatine Binden mit sehr hoher Affinität Cd 2+, andere Metallionen aber wenig Speziell zur Cd 2+ -Bindung synthetisiert von Phytochelatin-Synthase Sind der wichtigste Cd-Resistenzmechanismus in den meisten Pflanzen (außer Hyperakkumulatoren) und vielen Tieren Phytochelatin-Synthase wird von (z.b. durch Cd-Bindung) blockierten Thiolen von Glutathion und ähnlichen Peptiden aktiviert Phytochelatine binden Cd 2+ im Cytoplasma, dann Tranport des Komplexes in die Vakuole. In der Vakuole bilden sich große Phytochelatin-Cd-Aggregate
4. Allgemeine Resistenz-Mechanismen 4.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden Glutathion Auch Glutathion selbst, der Baustein der Phytochelatine, könnte Schwermetalle binden und somit entgiften - in vivo Bedeutung eher fraglich. Metallothionine MTs vom Typ I und II binden mit sehr hoher Affinität Cu 2+ und scheinen an dessen Entgiftung beteiligt zu sein. Aber: Hauptrolle der MTs in Pflanzen vermutllich Metall-Verteilung während des normalen (nichtgestressten) Stoffwechsels
4. Allgemeine Resistenz-Mechanismen 4.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden Freie Aminosäuren Wie beim Metalltransport unter normalen physiologischen Bedingungen, scheinen freie Aminosäuren (v.a. Histidin+Nicotianamin) eine Rolle bei der Entgiftung von Schwermetallen zu spielen. Andere Liganden Diverse Proteine Anthocyane: Scheinen in Brassicaceen Molybdän zu binden (Entgiftung oder Speicherung?) Zellwand Manche Algen scheiden unter Cu-Stress noch unidentifizierte Thiol-Liganden aus
4.2. Schwermetall-Entgiftung durch Kompartimentierung Mechanismen Generell: aktive Transportprozesse gegen den Konzentrationsgradienten Transportproteine beteiligt. Ausschluss aus der Zellen: - in Algen: bei Braunalgen beobachtet - in Wurzeln: siehe Wurzeln Einlagerung in die Vakuole: - Pflanzen-spezifischer Mechanismus (Tiere haben keine Vakuolen...) - sehr wirksam, da die Vakuole keine zu hemmenden Enzyme enthält - spart den Aufwand der Synthese von starken Liganden wie Phytochelatinen - wichtigster Mechanismus in Hyperakkumulatoren Einlagerung in wenig sensitive Gewebe, z.b. Epidermis ohne statt Mesophyll mit Photosynthese
4.3. Weitere Resistenz-Mechanismen Reduktion durch Reduktasen, z.b. Hg 2+ --> Hg 0, Cu 2+ --> Cu + Ausfällung unlöslicher Sulfide außerhalb der Zelle (auf der Zellwand) Methylierung, z.b. von Arsen
Cadmium zu allen Mahlzeiten: Pflanzen mit einem ungewöhnlichen Appetit Schwermetall-Hyperakkumulation --> Biologische Funktion der Hyperakkumulation --> Mechanismen der Hyperakkumulation --> Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung und zur Erzgewinnung
Effekte von Ni 2+ auf das Wachstum und Ni 2+ -Konzentrationen im Sproß Shoot dry weight (g) 10 8 6 4 2 (a) 14 Thlaspi goesingense 12 Alyssum bertolonii Alyssum lesbiacum Ni concentration (µg g -1 ) (b) 30000 25000 20000 15000 10000 5000 Thlaspi goesingense Alyssum bertolonii Alyssum lesbiacum 0 0 1000 2000 3000 4000 0 0 1000 2000 3000 4000 Ni added to the substrate (mg kg -1 ) Ni added to the substrate (mg kg -1 ) Alyssum lesbiacum Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365), 2291-2300
Mechanismen der Hyperakkumulation: Komplexierung von Cadmium hyperakkumuliert von Thlaspi caerulescens (Ganges-Typ) Analysiert mit Röntgenabsorptions-Spektroscopie Percent of all ligands binding to Cd 80 60 40 20 0 80 60 40 20 young mature senescent dead 0 stems petioles leaves Developmental stage of leaves Tissue sulphur ligands N/O ligands Percent of all ligands binding to Cd Küpper H, Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH (2003) Plant Physiology 134 (2), 748-757
Komplexierung von Kupfer im Cu-sensitiven CdZn-hyperaccumulator T. caerulescens Analysiert durch XAS von gefrorenen Blättern Cu-K-edge EXAFS Cd: Küpper H, Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH (2003) Plant Physiology 134 (2), 748-757 Cu: Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH, Küpper H - unpublished
Akkumulation der Metalle in Hyperakkumulatoren Größter Bioakkumulationskoeffizient bei kleinen Schwermetall-Konzentrationen (--> Tafelbild) Akkumulation meist in Epidermis-Vakuolen Aktiv gegen Konzentrationsgradient durch natürliche Überexpression von Metall- Transportproteinen Viele Transporter überexprimiert, aber bisher unklar, was primäre und was dadurch verursachte sekundäre Überexpression ist Regulation der Überexpression unbekannt Gene der meisten Metalltransporter bekannt biochemisch-biophysikalischer Mechanismus der Funktion, und dreidimensionale Proteinstruktur bei keinem Schermetall-Transportprotein vollständig bekannt
Kompartimentierung der Metalle in Blättern Zn/Cd/Ni -Akkumulation in Epidermis- Vakuolen von Thlaspi und Alyssum -Arten mm / mm Ca Compartmentation in leaves of Thlaspi caerulescens 8 young leaves 6 4 2 Alyssum bertolonii 0 8 Zn Mg P S Cl K mature leaves mm / mm Ca 6 4 2 0 Zn Mg P S Cl K upper epidermis upper mesophyll lower mesophyll lower epidermis Concentrations of elements in leaf tissues Zn K α line scan and dot map of a T. caerulescens leaf Ni K α line scan and dot map of a A. bertolonii leaf Zn: Küpper H, Zhao F, McGrath SP (1999) Plant Physiol 119, 305-11 Ni: Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365), 2291-2300
Kompartimentierung von Metallen in Blättern Korrelation zwischen Metallkonzentrationen im Mesophyll von Arabidospis halleri 10 25 8 20 Cd / mm 6 4 Mg / mm 15 10 2 0 data points regression line (R = 0.94; P < 0.0001) 95% confidence limits 0 20 40 60 Zn / mm 5 0 data points regression line (R = 0.79; P < 0.0001) 95% confidence limits 0 2 4 6 8 10 Cd / mm Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, McGrath SP (2000) Planta 212, 75-84
Cd-Stress im Zn-/Cd-hyperakkumulator T. caerulescens: Verteilung von Photosystem II-Aktivität T. caerulescens T. fendleri Control 30 20 10 C Control 20 10 A 0 20 D 0 20 B Cellular F v /F m distribution in a control plant Distribution of F v /F m in a Cdstressed plant Stressed Acclimating Acclimated 10 0 20 E 10 0 20 F 10 0 Stressed 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 F v / F m 10 0 Küpper H, Aravind P, Leitenmaier B, Trtilek M, Šetlík I (2007) New Phytologist 175, 655-674
Heterogenität als Resistenzmechanismus Normal: Sequestration in epidermal storage cells Stressed: additional sequestration in selected mesophyll cells Acclimated: Enhanced sequestration in epidermal storage cells v v v Küpper H, Aravind P, Leitenmaier B, Trtilek M, Šetlík I (2007) New Phytologist 175, 655-674
Regulation der ZNT1-Transkription analysiert durch quantitative mrna in situ-hybridisierung (QISH) in einer nicht-hyperakkumulierenden und einer hyperakkumulierenden Art 0.5 10 µm Zn 2+ Thlaspi caerulescens 10 µm Zn 2+ Thlaspi arvense 1 µm Zn 2+ Thlaspi arvense c(znt1 mrna) / c(18s rrna) 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 spongy mesophyll phloem bundle sheath palisade mesophyll epidermal subsidiary cells epidermal guard cells epidermal metal storage cells Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187
Reinigung und Characterisierung einer Zn/Cd transportierenden P 1B -typ ATPase aus natürlicher Überexpression in Thlaspi caerulescens Scheme from: Solioz M, Vulpe C 1996) TIBS21_237-41 Parameswaran A, Leitenmaier B, Yang M, Welte W, Kroneck PMH, Lutz G, Papoyan A, Kochian LV, Küpper H. (2007) BBRC 364, 51-56
Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung: Phytoremediation Aufnahme des Metalls in Hyperakkumulatoren. Nach diesem Prozess ist das Metall durch den hohen Bioakkumulations-Koeffizienten der Hyperakkus in einem viel kleineren Volumen konzentriert. Die geernteten Pflanzen werden verbrannt; die Asche wird entweder deponiert oder erneut zur Metallgewinnung eingesetzt. Pflanzenart Max. Cd Biomasse Cd-Entfernung mg/kg DW t DM/ha g/(ha*jahr) Arabidopsis halleri 100 2 200 Thlaspi caerulescens (Prayon) 250 5 1250 Thlaspi caerulescens (S. France) 2500 5 12500 Dichapetalum gelonoides 2.1 5 10 Athyrium yokosense 165 2 330 Arenaria patula 238 2 476 Sedum alfredii 180 5 900 Weide/Pappel 2.5 20 50 Upland Rice 40. 10 400 Daten aus Feldexperimenten von Rufus Chaney (USA), präsentiert auf Konferenz in Hangzhou 2005
Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Metallgewinnung: Phytomining Vegetation auf natürlich nickelreichem Boden (Serpentin). Solcher Boden ist weder für die Landwirtschaft (Ni-Konz. viel zu hoch) noch für die konventionelle Erzgewinnung tauglich (Ni-Konz zu niedrig). Werden Nickel-Hyperakkumulatoren auf solchen Böden angebaut, reichern sie mehrere Prozent ihrer Trockenmasse an Nickel an. Nach Verbrennung enthält die Asche 10 bis 50% Nickel, so dass sie als Bio-Erz genutzt werden kann. Phytomining pictures from R. Chaney So eine Pflanzenmine kann, Feldstudien unter kommerziell anwendbaren Bedingungen zufolge, etwas 170 kg Nickel pro Hektar und Jahr produzieren. Beim derzeitigen (6.12.07) Nickelpreis von fast 18 pro Kilo Rohnickel sind das etwa 3000.ha -1.
Interactions of plants with potentially toxic metals complexation by strong ligands metal-induced damage to photosynthesis (e.g. Mg-substitution) complexation by strong ligands oxidative stress and other damage cytoplasm vacuole vacuole cytoplasm cell walls epidermis cells photosynthetic cells (e.g. mesophyll cells, stomatal guard cells) cell walls stem epidermis regulation by boundary cells? leaf phloem stem phloem leaf xylem stem xylem ± root to shoot translocation in thecaseof submerged aquatic plants cell walls vacuole root root uptake exclusion mechanisms damage to roots Heavy metals in soil or water
Alle Folien meiner Vorlesungen im Internet unter http://www.uni-konstanz.de /FuF/Bio/kuepper/Homepage /AG_Kuepper_education.html weiterführende Literatur als pdf auf Anfrage