Metalle als Cofaktoren Funktion - Analyse Metall-Cofaktoren Was gibt es, was machen die Cofaktoren? Fe Cu Mn Co Zn Mo V W Ni
Fe HämFe FeS Anderes Fe Fe HämFe Hämoglobin, Myoglobin, Cytoglobin*, Neuroglobin*, Cytochrome, etc, Cytoglobin *Sauerstofftransport, Sauerstoffspeicherung
Fe FeS FeS Zentren: FeS Zentren:Atmungskette
FeS Zentren:Atmungskette 1 x FMN 7 x [4Fe-4S] 2 x [2Fe-2S] 1 FAD 1 x [2Fe-2S] 1 x [3Fe-4S] 1 x [4Fe-4S] 1 Heme 3 x Heme 1 x [2Fe-2S] 2 x Cu 2 x Heme FeS: Erinnerung an den Ursprung? Hypothese von Günter Wächtershäuser Energiequelle des ersten Lebens FeS + H 2 S FeS 2 (Pyrit) + 2 H + + 2e - ΔE = -0.62 V
Schwarze Raucher sind eine reiche Quelle für Metallsulfide Rezente FeS Zentren in Proteinen. Molekulare Erinnerungen an die FeS Welt?
Strömungen und Gase in Schloten erzeugen feine FeS Poren und Bläschen Russell (2007) Spektrum Wiss. Jan., 74 Martin & Russell (2007) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.362,1887 Martin & Russell (2007) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.362,1887
Akkumulation von Nukleotiden in hydrothermalen Poren Baaske (2007) PNAS 104, 9346 Rezente FeS Zentren bei DNA RNA Interaktion. Molekulare Erinnerungen an die FeS Welt?
Fe Nicht Häm Fe Lipoxygenase, Ribonukleotidreduktase Cu Elektronentransport Sauerstofftransport Redoxkatalyse, Sauerstoffaktivierung
Cu - Elektronentransport Plastocyanin (Photsynthese) Azurin (Bakterien) Cu - Sauerstofftransport In Gliederfüßern und Weichtieren Große Komplexe mit ca. 1.5 8 MDa, je nach Spezies
Cu-Sauerstoffaktivierung Superoxiddismutase, Glactoseoxidase, Laccase, Ascorbatoxidase Cu Ion stabilisiert reaktive Intermediate. Bsp unten Cytochrom c Oxidase Cu-Sauerstoffaktivierung Mitochondriale Cytochrom c Oxidase
Mo Molypdopterin in Sulfitoxidase, Xanthinoxidase Mn Redox: - Photoreaktionszentrum / wasserspaltende Komplex - Bakterille Katalase Hydrolasen -Mitochondriale Pyrophosphatase
Co C- Transfer Reaktionen Cobalaminabhängig, z.b. SAM (S- Adenosylmethionine) Methyltransferreaktionen Hydrolasen vor allem bei anaeroben Bakterien & Archaea Ni Hydrolasen Urease von Helicobacter pylorii
Ni Redoxenzyme, z.b. Hydrogenasen Detektion Fe HämFe Detektierbar über Absorption ε 410 nm ca. 100 000 M -1 cm -1 FeS ε 400 nm ca. 10 000 M -1 cm -1 => Andere Methoden
FeS Zentren: g z =2.02 reduced g av = 1.91 reduced g av = 1.96 g z =2.05 g y =1.95 g y =1.91 g x =1.79 [2Fe-2S] 2+/+ Rieske [2Fe-2S] 2+/+ ferredoxin oxidized g av = 2.01 g z =2.02 g x =1.89 g x,y =2.00 [3Fe-4S] +/0 g z =2.06 reduced g av = 1.96 oxidized g av = 2.06 g z =2.12 g y =1.92 g x =1.88 g x,y =2.04 [4Fe-4S] 2+/+ [4Fe-4S] 3+/2+ HiPIP 300 320 340 360 380 400 Magnetic field [mt] Detektion Naß-chemische Nachweise Komplexbildung mit Farbstoffen Bsp Cu mit Bathocuprein Bsp Fe mit Ferene Komplexbildung mit fluoreszierenden Chromophoren Bsp Zn Bsp Ca
Nicht denaturierende Detektion mit EPR Electron Paramagnetic Resonance e - e - + 1/2-1/2 Electron Paramagnetic Resonance B hν ΔE nucleus electron ΔE = g β B = h ν
EPR Electron Paramagnetic Resonance Δ E hν B Magnetfeld Resonanz: Δ E = g β B = hν The EPR Spectral Fine Structure electron Interaction of nuclear and electron spin => more energy levels Each line is split into = 2 S + 1 lines e.g. N S=1 => 3 lines for each N number of lines = 2 S + 1 e.g. Cu S=3/2 => 4 lines for Cu
Darstellung von EPR Daten Absorption 1 st 2 nd 1000 2000 3000 4000 5000 Magnetic Field (Gauss) EPR Spectrometer Für Metalle meist Kühlung auf 70-10 K nötig! Kühlung mit flüssigem Helium, => technisch sehr aufwendig
The EPR Spectral Fine Structure electron Interaction of nuclear and electron spin => more energy levels Each line is split into = 2 S + 1 lines e.g. N S=1 => 3 lines for each N number of lines = 2 S + 1 e.g. Cu S=3/2 => 4 lines for Cu Cu 2+ Binding to S100B Magnetic
Counting N in Cu 2+ site 14 23 N 0 => N => 93 57 lines 1 line + Bsp Cu 2+ Quantifizierung
Detektion mit EPR Detektiert werden Metallionen mit UNgepaarten Elektronen: Fe 2+, Fe 3+, Cu 2+, Mn 2+, Co 2+, Nicht detektiert wird z.b. Zn 2+, Ca 2+, Cu +, AAS Atomabsorptionsspektroskpie Lampe: spezifisch für Elemente Detektiert wird die Licht-Absorption der Atome Ethin/O 2 Probe Lachgas (N 2 O) /O 2 2500-2800 C
AAS Lampe: spezifisch für Elemente AAS Gute Sensitivität (je nach Element und Gerät 0.1-2 ppm) Gute Spezifität, Aber, nur ein Element pro Messung Eingeschränkte Anzahl an Elementen AAS Gerät im Limnologie, AG Küppers
ICP-MS Probe Argon Plasma (über Induktion in ionisiertem Argon erzeugt) Detektiert werden die Ionen per Massenspektrometrie ICP MS Gute Sensitivität Gute Spezifität Mehrere Elemente parallel können in einem Experiment detektiert werden. Grosser Vorteil: Relative Verhältnisse können bestimmt werden; z.b. Schwefel : Metal Schwefel (Cys, Met) gibt Auskunft über Proteinkonzentration)
ICP-MS Sensitivität Element U, Cs, Bi Ag, Be, Cd, Rb, Sn, Sb, Au Ba, Pb, Se, Sr, Co, W, Mo, Mg Cr, Cu, Mn Zn, As, Ti Li, P Ca Detection Limit (ppt) less than 10 10-50 50-100 100-200 400-500 1-3 ppb less than 20 ppb Wie werde ich Metalle los? EDTA => Ca 2+, Mg 2+, Zn 2+, Cu 2+, Fe 2+/3+, Mn 2+, EGTA => Ca 2+, Mg 2+, Zn 2+ Hohe Konzentrationen an Imidazol (2 M) Aufreinigung von H 2 O und Puffer über Säulenmatrix, welche Metallionen bindet, z.b. Chelex
TPEN TPEN ist ein membrangängiger Zn 2+ spezifischer Chelator (N,N,N',N' tetrakis-(2pyridylmethyl) ethylene diamine) TPEN-Zn 2+ Komplex