Naturwissenschaft Sabrina Engels Genetik-Protokolle 1.Teil
1 Genetisches Blockpraktikum für Lehramt SII im Hauptstudium 1. Woche vom 18.2-23.2.2002 Cytogenetischer Teil - Chromosomen Gliederung. 1. Präparation von primären Spermatocyten aus den Hoden von Drosophila hydei verschiedener Genotypen 2. Darstellung von Mitosen aus dem Wurzelmeristem von Allium ( nach Induktion von Chromosomen- Mutationen durch Maleinsäurehydrazid ) 3. Präparation von Polytänchromosomen von Drosophila hydei und Induktion von Hitzeschock- Puffs 4. Identifizierung des Geschlechtschromatins in Interphase- Kernen 5. Präparation von Mitose- Chromosomen aus Neuroblasten
2 1. Präparation von Polytänchromosomen von Drosophila hydei und Induktion von Hitzeschock- Puffs Einleitung: Normale Chromosomen bestehen aus ein bis zwei Chromatiden, während der Interphase ist die Chromosomenstruktur aufgelöst. Riesenchromosomen bestehen aus einer Vielzahl von Chromatiden (größenordnungsmäßig 1000). Sie werden daher auch polytäne Chromosomen oder Polytänchromosomen genannt. Ihre Größe übersteigt die normaler Metaphasenchromo-some. In jeder mitotischen Phase sind sie bis zu 25 µm breit und bis zu 250 µm lang, Das ist 10x breiter & 100x länger als normale kondensierte Metaphase Chromosomen. Der polytäne Charakter bleibt während der Interphase erhalten. Man findet sie dann aber nicht als freie Chromosomen im Plasma, sondern stets im Kern von einer deutlich sichtbaren Kernmembran umgeben. In Präparationen der Riesenchromosomen (in Quetschpräparaten) wird die Membran absichtlich zerstört, um die Chromosomen zu spreiten und dadurch besser sichtbar zu machen. Riesenchromosomen kommen in Geweben mit trophischer Funktion (z.b. Speicheldrüsen, Malphigische Gefäße, Darmepithel) bei Dipteren, Ciliaten und Collembolen vor. Außerdem gibt es sie in den Antipoden- und Suspensorzellen einiger Pflanzen (Samenanlage von Bohnen). Im Praktikum werden die Polytänchromosomen aus den Kernen der Speichel-drüsenzellen der Larven der Gattung Drosophila hydei untersucht. Riesenchromosomen setzen sich aus einer großen Anzahl gepaarter Chromatiden zusammen, die durch schrittweise Verdopplung von DNA (Replikation) ohne darauffolgende Zell- und Kernteilung entstehen (Endomitose). Durch ihre endomitotische Entstehung sind die entstehenden Kerne polytän, d.h. sie besitzen ein Vielfaches des normalen Chromosomensatzes. Normale diploide Zellen besitzen einen doppelten Chromosomensatz 2n. Riesenchromosomen der Speicheldrüsen von Drosophila erreichen eine Polytänie von ungefähr 1000n (210), die von Zuckmücken eine Polyploidie bis zu 16000n. Die Anzahl der Chromatiden pro Chromosom beträgt bei Drosophila etwa 1024. Bei Dipteren sind es die homologen Chromatiden, die gebündelt ein aus tausenden parallel verlaufenden DNA-Molekülen bestehendes, dicht gepacktes vielsträngiges Riesenchromosom bilden. Durch die Fusion der jeweils homologen Chromosomen entsteht der Eindruck, es würde nur ein haploider Chromosomensatz vorliegen. Das X-Chromosom der Männchen ist leicht daran erkennbar, dass es nur halb so dick wie die übrigen ist, da ihm ein homologer Partner fehlt. Dies liegt daran, dass alles Heterochromatin ( und das Y- Chromosom ist total heterochromatisch) bei der Polytänisierung nicht oder nur sehr wenig mitpolytänisiert wird, so dass es anteilsmäßig in den Riesenchromosomen stark zurück tritt. Alle Riesenchromosomen von Drosophila sind im Bereich ihrer Centromeren untereinander verbunden. Dieser Bereich ist stark heterochromatisch (Chromozentrum).Von dem Chromozentrum gehen sechs Chromosomenarme aus, von denen einer sehr kurz und oft nicht zu sehen ist (6. Chromosom). Riesenchromosomen zeichnen sich durch eine deutliche regelmäßige Querbänderung aus; das Bandenmuster ist hochspezifisch. Ihr Bänderungsmuster, auch Banden genannt, ist charakteristisch für Riesenchromosomen. Sie entstehen dadurch, dass die DNA in den Banden dichter kondensiert vorliegt als in den benachbarten Bereichen, den Interbanden. Durch ihre je nach Region unterschiedliche Dicke und den variierenden Abständen zwischen den einzelnen Banden können mittels des Bänderungsmusters Chromosomenkarten erstellt werden. Auf diese Weise lassen sich einzelne Gene bestimmten Banden zuordnen und so z.b. ihre Akti-vität mikroskopisch untersuchen. Die Bänderungsmuster sind allerdings nicht fixiert, vielmehr weisen sie zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der Entwicklung oder in verschiedenen Gewe-ben charakteristische Unterschiede auf. 1952 wurde von Wolfgang Beermann erkannt, dass diese Unterschiede ihre Ursache in unterschiedlicher Genaktivität haben.
Im Fall von Drosophila melanogaster ist jede einzelne Bande identifiziert, klassifiziert und nummeriert worden. Dabei ist zu beachten, dass die Bänderung der Riesenchromosomen nichts mit der eben besprochenen Bandierung normaler Chromosomen zu tun hat. Die Bänderung der Riesenchromosomen ist auch ohne Färbung sichtbar (z.b. im Phasenkontrast- oder im Interferenzkontrastmikroskop). Die Bandierung normaler Chromosomen ist, wenn man so will, ein Artefakt, ein Muster also, das nur nach Einsatz spezifischer Farbstoffe und unter bestimmten Bedingungen zutage tritt. Riesenchromosomen erwiesen sich als geeignete Studienobjekte zur Untersuchung von Strukturänderungen der Chromosomen und deren Folgen. Die differenzielle Transkriptionsaktivität ist anhand des Puffing klar zu ersehen. Jene Chromosomenabschnitte an denen Transkription stattfindet, sind stark aufgelockert und bilden sogenannte Puffs oder Balbiani-Ringe (das sind besonders große Puffs; z.b. in der Zuckermückenlarve). Verteilung und Größe der Puffs ist in verschiedenen Geweben und Entwicklungsstadien unterschiedlich. Mit dem Beginn der Transkription eines Genes dekondensiert die DNA einer Bande und wird so für die an der RNA-Synthese beteiligten Moleküle und Enzyme zugänglich, es entsteht ein sogenannter Puff. Diese Puffs können mehrere benachbarte Banden einschließen oder sich über eine Reihe schrittweise fortbe-wegen. Da in den Riesenchromosomen eine starke RNA-Synthese zu beobachten ist und sie dekondensiert vorliegen, handelt es sich um Interphasenchromosomen. Durch Hitzebehandlung von Larven kann man eine Stressantwort induzieren, wobei Hitzeschock-Gene aktiviert werden, was die Ausbildung markanter Puffs bewirkt. Schemazeichnung eines Puffs 3 http://fachberatung-biologie.de/themen/klassgenetik/seitengenetik/riesenchrom.htm Mit Hilfe von Untersuchungen an Riesenchromosomen ist es möglich, die Theorie von der linearen Anordnung der Gene zu bestätigen, Mutationen mikroskopisch gut sichtbar nachzuweisen, Evolutionsvorgänge und Entwicklungsvorgänge über die Änderung des Puffing-Musters nachzuweisen und Genaktivitäten nachzuweisen Die beiden Versuch werden hier unter der gleichen Einleitung beschrieben, da sie die gleiche Thematik beherbergen. Durchführung ( Versuch VI) Die geeignetsten Drüsen finden sich in Larven des 3. Stadiums, die auch zur Präparation von Ganglien genommen werden. Die Vorgehensweise ist dieselbe. Der weitere Ablauf wird im Skript auf Seite 14 erläutert. Ergebnisse und Diskussion: Durch das Mikroskop kann man nun die Polytänchromosomen auf dem Objektträger identifizieren. Die Kerne der Speicheldrüsenzellen sind aufgequetscht, die Polytänchromosomen ausgetreten. Zu erkennen sind die Chromosomen mit Banden und Interbanden, Telomeren und Endochromozentrum. Nicht zu erkennen sind Nukleolus, Puffs bzw. Balbiani-Ringe. Leider ist keines meiner Präparate so gut geworden, dass man die 6 Arme, die vom Chromo-zentrum ausgehen, genau erkennen kann. Dies könnte an einer schlechten Präparation liegen. Im Skript auf den Seiten 15 und 16 sind die Arme der Polytänchromosome genau dargestellt. Um ein