2.2 Chromosomen des Menschen

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1 2.2 Chromosomen des Menschen entdeckten, dass Fluoreszenz nach Anfärben der Chromosomen mit Quinacrin ein distinktes Bandenmuster erzeugt, und systematisierten damit eine gelegentliche Beobachtung von spontanen horizontalen Dichteunterschieden, die bis dahin wenig Beachtung gefunden hatte. Kurz danach wurden die Giemsa-Bänderung und andere Bänderungsmethoden entwickelt. Durch die Kombination von molekularbiologischen Methoden mit neuen Anfärbemöglichkeiten gelang es in den letzten Jahren, das Auflösungsvermögen noch einmal zu steigern. Dadurch entwickelte sich die molekulare Zytogenetik.Durch den Einsatz von DNA-Sonden und an sie gebundene fluoreszenzmarkierte Reportermoleküle (s. Kapitel 2.2.2) gelingt es mit den Methoden der Chromosomen-in-situ-Suppressions-Hybridisierung und der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung kleinere Chromosomenbereiche, ja selbst einzelne Gene zu markieren und mikroskopisch analysierbar zu machen. Die kurze Beschreibung der jüngeren historischen Entwicklung des methodischen Inventars der medizinischen Zytogenetik an dieser Stelle wurde nicht nur unternommen, um im Sinne einer historischen Einleitung einen Einstieg in das Kapitel zu ermöglichen. Sie soll vielmehr zeigen, wie innerhalb von nur ca. 50 Jahren, fast vom Stande null aus, durch die Kombination von methodischen Ansätzen aus primär völlig verschiedenen wissenschaftlichen Richtungen ein wissenschaftliches Werkzeug für die prä- und postnatale Chromosomenanalyse und für die Tumorzytogenetik von faszinierender Dimension geschaffen wurde. Parallele Entwicklungen, ausgehend von der Verbesserung der optischen Auflösung über die Entwicklung von DNA-Sonden und neuen Fluoreszenzmarkierungen bis hin zur computergestützten Separation von Fluoreszenzspektren, haben hier ein weites Feld eröffnet. Über die ausgesprochenen Anwendungsgebiete hinaus sind die Konsequenzen weitreichend. Stellvertretend seien hier nur die physikalische Genkartierung und die Evolutionsforschung genannt Darstellung menschlicher Chromosomen Zur Chromosomenanalyse beim Menschen ist grundsätzlich jedes Untersuchungsmaterial geeignet, das Mitosen enthält oder bei dem man die Mitose anregen kann. Von Bedeutung ist auch die Zugänglichkeit. In der Praxis erfolgen die meisten Chromosomenpräparationen aus

2 196 Genetik Kurzzeit-Lymphozytenkulturen, Langzeit-Fibroblastenkulturen, Amnionzellkulturen (für Pränataldiagnostik), Mitosen nach Chorionzottenbiopsie (für Pränataldiagnostik). Grundsätzlich ist auch die direkte Präparation aus Knochenmark möglich. Sie spielt jedoch in der Praxis kaum oder nur in begründeten Ausnahmefällen eine Rolle. Präparation Das Blut gesunder, nicht an Leukämie erkrankter Personen enthält keine teilungsfähigen Zellen. Die Lymphozyten können jedoch artifiziell zur Teilung angeregt werden und vermehren sich dann in der Regel in 72-h-Kulturen zu einer für die Präparation genügenden Zelldichte. Die wesentlichen Präparationsschritte sind im einzelnen: Nach 70 h Zucht in geeignetem Nährmedium Behandlung der mitotischen Zellen mit dem Spindelgift Colchizin (für 2 h). Colchizin arretiert die Zellen in der Prämetaphase oder Metaphase, da die Formierung der Spindel, die zur Anaphasebewegung notwendig ist, verhindert wird. Hypotone Behandlung der Zellen für kurze Zeit, z.b. mit 0,075 molarer KCL. Fixierung des Materials mit einem Gemisch aus Essigsäure und Methanol (in der Regel im Verhältnis 1:3). Auftropfen der Zellen auf Objektträger und deren Trocknung. Färbung mit geeigneten Färbemethoden. Darstellungsmethoden Färbung Die konventionelle Färbung der Chromosomen erfolgt in der Regel mit Giemsa-Färbelösung oder anderen Kernfarbstoffen. Bänderungsmethoden Mit den verschiedenen Bänderungsmethoden lassen sich etwa 350 Banden unterscheiden. Die älteste Bänderungsmethode ist die mit Quinacrin (Q-Bänderung), welche distinkte fluoreszierende Banden erzeugt. Die Banden sind bei allen Bänderungsmethoden für jedes Chromosom spezifisch

3 2.2 Chromosomen des Menschen und reproduzierbar.sie können nach Anzahl,Größe,Verteilung und Intensität unterschieden werden. Die Q-Bänderung hat allerdings für die Routinediagnostik heute keine Bedeutung mehr. Die in der Praxis am häufigsten angewandte Bänderungsmethode ist die Giemsa-Bänderung oder G-Bänderung (z Abb. 2.35). Nach Inkubation der Chromosomen in Trypsinlösung (Trypsinierung) erfolgt eine Inkubation mit Giemsa-Lösung, wobei der Farbstoff nach Denaturierung des Chromatins in die DNA eingebaut wird. Die Bandenstruktur basiert auf Unterschieden in der Längenstruktur der Chromatiden. Jede Bande unterscheidet sich von der nächsten durch ihre Basenzusammensetzung, die Chromatinformation, die Dichte der Gene, ihre repetitiven Sequenzen und den Zeitpunkt ihrer Replikation. Die G-Banden sind spät replizierend und enthalten stark kondensiertes Chromatin. Die hellen Banden (auch R-Banden, reverse G-Bandenmuster genannt) werden dagegen früh in der S-Phase repliziert und enthalten weniger stark kondensiertes Chromatin. Die DNA in den G-Banden ist transkriptionell relativ inaktiv, Gene sind dagegen besonders häufig in den hellen Banden zu finden. z Abb Mikroskopisches Bild einer Metaphase nach Giemsa-Bänderung. (Mit freundlicher Genehmigung von H.-D. Hager, Institut für Humangenetik der Universität Heidelberg)

4 198 Genetik Man hat bis vor kurzem vermutet, dass die G-Banden besonders ATreich, die R-Banden dagegen reich an GC wären. Inzwischen hat sich jedoch herausgestellt, dass beim Menschen in den G-Banden nur geringfügig mehr AT-reiche Sequenzen vorhanden sind als in den hellen Banden. Das weiterentwickelte Modell des Aufbaus von Metaphasechromosomen brachte hier die richtige Lösung. Danach werden die besonders AT-reichen Gerüstkopplungsbereiche (SAR) entlang der Längsachse der Chromatiden jeweils unterschiedlich gefaltet. Bereiche mit hoher Dichte an SAR findet man in den G-Banden, mehr entfaltete SAR in den hellen Banden. Dabei wird angenommen, dass der Giemsa- Farbstoff selektiv die Basis der DNA-Schlaufen anfärbt, während man das R-Bandenmuster (z. B. durch die nachfolgende Färbemethode) dann sieht, wenn man gezielt die Schlaufenkörper anfärbt. Die Q- und die G-Banden sind identisch. Nach Vorbehandlung der Chromosomen mit heißem Phosphatpuffer und nachfolgender Färbung mit Giemsa kann man R-Banden erzeugen. Die R-Bänderung bringt helle Heterochromatin- und dunkle Euchromatinbanden hervor. Sie entspricht also quasi dem photographischen Negativ der G-Bänderung. Das konstitutive Heterochromatin in der Region um das Zentromer und am distalen Ende des langen Armes (q) des Y-Chromosoms kann mit der C-Bänderung dargestellt werden. Die T-Bänderung schließlich markiert die Telomerregionen der Chromosomen. Eine Variante zur Darstellung von Metaphasen mit höherer Auflösung ist die Darstellung von mittleren und späten Prophasen und von Prometaphasen (High Resolution Banding).Sie gelingt nach Synchronisation der Zellzyklen. Da die Chromosomen zu diesem Zeitpunkt noch nicht ganz so stark kondensiert sind, können einzelne Chromosomenabschnitte, die sich in der Metaphase als eine Bande darstellen, in mehrere Banden aufgelöst werden. Bei einer qualitativ einwandfreien Präparation lassen sich ca Banden (im haploiden Satz) erkennen (z Abb. 2.36). In-situ-Hybridisierung Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung brachte nun eine entscheidende Erweiterung dieser Darstellungsmethoden, wobei die vorangestellten Chromosomendarstellungsmöglichkeiten für die Routinezytogene-

5 2.2 Chromosomen des Menschen z Abb Mikroskopisches Bild einer Prometaphase nach hochauflösender Giemsa- Bänderung. (Mit freundlicher Genehmigung von H.-D. Hager, Institut für Humangenetik der Universität Heidelberg) tik damit nicht etwa an Bedeutung verloren haben. Wie bereits ausgeführt, verwendet man DNA-Sonden, die durch modifizierte Nukleotide mit Reportermolekülen (wie Biotin) charakterisiert sind und an die fluoreszenzmarkierte Affinitätsmoleküle gebunden sind. Dabei setzt man verschiedene Fluorophoren ein (z Abb. 2.37). Die verwendeten DNA-Sonden stammen aus verschieden angelegten DNA-Bibliotheken: Phagen- und Plasmid-DNA-Bibliotheken, in die sortierte menschliche Chromosomen einkloniert sind; Plasmid-DNA-Bibliotheken mit chromosomenspezifischen Teilbereichen; Cosmide (das sind Plasmide mit Verpackungssequenzen von Lambda, einem E.-coli-Virus) YAC (Yeast Artificial Chromosomes: künstliche Hefeminichromosomen mit definierten DNA-Abschnitten).

6 200 Genetik z Abb Beispiel eines markierten Nukleotids, bei dem die Reportergruppe über ein Zwischenstück an ein Nukleotid gebunden ist Allerdings existiert da noch das Problem der verstreuten repetitiven Sequenzen, die ja wie beschrieben über alle menschlichen Chromosomen verteilt sind. Eine direkte Hybridisierung der Sonden würde zu keinen verwertbaren Ergebnissen führen, da diese eben auch repetitive Sequenzen enthalten, eine Markierung aller Chromosomen wäre die Folge. Daher ist die Anwendung der In-situ-Suppressionshybridisierung sinnvoll. Bei dieser Kompetitionshybridisierung versetzt man vor der eigentlichen Sondenhybridisierung die Sonde mit einem großen Überschuss unmarkierter chromosomaler Gesamt-DNA, diese wird dann denaturiert. Dadurch wird eine Absättigung der repetitiven Sequenzen der Sonde erreicht, sie können somit das Signal der spezifischen Sequenz nicht mehr überlagern. Die so vorbereitete Sonde kann nun direkt mit Metaphasechromosomen auf dem Objektträger hybridisiert werden. Beim chromosome painting besteht die DNA der Sonden aus vielen verschiedenen Fragmenten, die von einem einzigen Chromosomentyp abstammen. Damit werden über das ganze Chromosom verteilte Genloki markiert. Verwendet man zusätzlich noch verschiedenfarbige Fluoreszenzmarker, so erhält man eine Palette von Farbabstufungen für das ganze Chromosom. In Erweiterung dieser Methode ist es vor wenigen Jahren gelungen, eine Multicolor-Spektral- Karyotypisierung aller menschlichen Chromosomen vorzustellen, die eine simultane Darstellung aller menschlichen Chromosomen in verschiedenen Farben erlaubt (z Abb. 2.38). Stellenwert der FISH. Die FISH hat damit einen hohen Stellenwert in der Ergänzung der konventionellen Chromosomendarstellungstech-

7 2.2 Chromosomen des Menschen z Abb a Männliche Metaphase mit einer Trisomie des Chromosoms 8. b Karyogramm nach einer Hybridisierung mit 24 chromosomenspezifischen DNA-Sonden als Falschfarbenbild. (Mit freundlicher Genehmigung von M.R. Speicher, Institut für Anthropologie und Humangenetik der Universität München)

8 202 Genetik z Abb. 2.39a-f. Vergleichende genomische Hybridisierung (Comparative genomic hybridization, CGH) mit Tumor-DNA aus autoptischem Material einer Patientin mit kleinzelligem Lungenkarzinom. Die Tumor-DNA (Detektion mit FITC, grüne Fluoreszenz) wurde im Verhältnis 1:1 mit Referenz-DNA (Detektion mit TRITC; rote Fluoreszenz) eines gesunden, männlichen

9 2.2 Chromosomen des Menschen Probanden gemischt und auf Metaphasespreitungen mit normalem, weiblichem Chromosomenkomplement (46, XX) hybridisiert. a Metaphasespreitung zeigt eine relativ homogene Färbung mit TRITC (Hybridisierung der Referenz-DNA). b Die FITC-Färbung dieser Metaphasespreitung (Hybridisierung der Tumor-DNA) zeigt eine im Vergleich zur Referenz-DNA stärkere oder schwächere Färbung einzelner Chromosomen und Chromosomenabschnitte. c Überlagerung des FITC- und TRITC-Bildes: Chromosomenabschnitte mit signifikant erhöhten FITC/TRITC-Quotienten (Hinweis auf eine Überrepräsentation des Chromosomenabschnitts im Tumor) sind in dieser Falschfarbendarstellung grün, Chromosomenabschnitte mit signifikant erniedrigten FITC/TRITC-Quotienten (Hinweis auf eine Unterrepräsentation des Chromosomenabschnittes im Tumor) sind rot gekennzeichnet. Blau gefärbte Abschnitte repräsentieren unauffällige FITC/TRITC-Quotienten. Die Zahlen geben die Chromosomennummern an. d Fluoreszenzbänderung mit DAPI. Zur verbesserten Sichtbarmachung des Bandenmusters wurde eine inverse Darstellung gewählt. Die Aufnahmen (a), (b) und (d) wurden mit einer CCD-Kamera mit FITC-, TRITC- und DAPI-spezifischen Filterkombinationen aufgenommen. e Paarweise Anordnung der in (c) dargestellten Chromosomen. Man beachte, dass homologe Chromosomen ein weitgehend identisches Falschfarbenbild aufweisen. Beispielsweise sind die kurzen Arme auf beiden Chromosomen 3 rot (Verlust von 3p), die proximalen Abschnitte des langen Arms blau (Hinweis auf eine ausgeglichene Kopienzahl), die distalen Abschnitte grün (Erhöhung der Kopienzahl). Bei Chromosom 5 weist die Falschfarbendarstellung auf eine erhöhte Kopienzahl des kurzen Arms und eine verminderte Kopienzahl des langen Arms hin usw. Ungleichmäßige Farbverteilungen auf beiden Chromatiden eines Chromosoms oder beiden homologen Chromosomen sind Hinweise auf Artefakte. Für statistisch gesicherte Aussagen muss eine Serie von Referenzmetaphasespreitungen ausgewertet werden. f Mittelwerte der FITC/TRITC-Fluoreszenzquotientenprofile wurden für jeweils 1 β-referenzchromosomen ermittelt. Die drei Linien neben den schematisch dargestellten Chromosomen (ISCN 1985) stellen von links nach rechts einen unteren Schwellenwert, normale Fluoreszenzquotienten und einen oberen Schwellenwert dar. Eine Unterschreitung des unteren Schwellenwerts oder eine Überschreitung des oberen Schwellenwerts weist darauf hin, dass ein Verlust oder ein Gewinn des entsprechenden Chromosoms oder Chromosomenabschnitts in mindestens 50% der Tumorzellen eingetreten ist. Die schraffierten Areale kennzeichnen heterochromatische Abschnitte, die von der Bewertung ausgeschlossen wurden. Die Profile für die Chromosomen 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 16, 17, 19 und 21 weisen auf pathologische Veränderungen hin, während die Profile für die übrigen Chromosomen unauffällig sind. Das nach rechts verschobene Profil für das X-Chromosom ist Ausdruck der höheren X-Kopienzahl in der weiblichen Tumor-DNA im Vergleich zur männlichen Referenz-DNA. (Mit freundlicher Genehmigung von T. Reed, Institut für Humangenetik, Heidelberg) niken erreicht. Sie wird besonders dort unentbehrlich, wo es um komplizierte Strukturumbauten menschlicher Chromosomen geht, sowohl bei chromosomal bedingten menschlichen Syndromen als auch in der Tumorzytogenetik (z Abb. 2.39). Eine weitere Anwendung der FISH ist die Interphasezytogenetik.Da die fluoreszenzmarkierten Chromosomen auch im Interphasekern ein entsprechendes Signal geben, ist dieses natürlich auch im Interphasen-

10 204 Genetik kern sichtbar. Markiert man mit einer chromosomenspezifischen Sonde ein bestimmtes Chromosom, so wird das Chromosomenpaar im Interphasenkern durch 2 Spots sichtbar. Bei einer Trisomie würde man folglich 3 Spots vorfinden. Das gleich gilt natürlich auch für die Trisomie von Chromosomenabschnitten. Wesentliche Bedeutung besitzt die FISH-Technik auch in der vergleichenden Zytogenetik. So kann man in der Evolutionsforschung z. B. den Weg von konservierten Genen durch die Evolution verfolgen. Gleiches gilt für Chromosomenstrukturumbauten z. B. in der Säugetierevolution. Auswertung Nach Färben der Chromosomenpräparate mit einer oder (auf verschiedenen Objektträgern) mehreren der vorgestellten Färbemethoden können diese unter dem Mikroskop bei 1000facher Vergrößerung analysiert und photographiert werden. Nach Herstellung von photographischen Abzügen ist dann die Sortierung der Chromosomen möglich. Dies geschah konventionell von Hand durch Ausschneiden und Aufkleben der Chromosomen zu einem geordneten Bild. Heute werden die Chromosomen häufig bereits über Computerprogramme in der nachfolgend beschriebenen Weise zur Auswertung geordnet und das Dokumentationsbild wird über Videoprinter ausgedruckt Beschreibung der Chromosomen Nach Beschreibung des technischen Ablaufs der Chromosomenpräparation und der Auswertung soll nun auf die Einteilung der Chromosomen (z Übersicht 2.21) in einem geordneten Chromosomenbild einer Metaphase, das man als Karyogramm bezeichnet, eingegangen werden z Abb Menschlicher Chromosomensatz (Karyogramm) im Vergleich verschiedener Färbemethoden. 1 Konventionelle Giemsa-Färbung, 2 Schema der Banden, 3 Färbung nach der Giemsa-Bandenmethode, 4 methodische Variante, die Stellen im Chromosom anfärbt, die nach der Giemsa-Bandenmethode ungefärbt bleiben (R-Banden, reverse), 5 Zentromerfärbung. (Nach Vogel u. Motulsky 1996)

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