Venor GeM Sample Preparation Kit

Venor GeM Sample Preparation Kit Manual Extraction of Mycoplasma DNA from cell culture material and biopharmaceutical materials for use with Venor GeM Mycoplasma Detection Kits Instructions for Use Gebrauchsinformation FOR USE IN RESEARCH AND QUALITY CONTROL ZUR ANWENDUNG IN DER FORSCHUNG UND QUALITÄTSKONTROLLE Order No. Bestell-Nr. 56-1005/-1050/-1100

Symbols Symbole Lot No. Chargen-Nr. Order No. Artikel-Nr. Expiry date Verfallsdatum Store at Lagerung bei Contains reagents for 5, 50 or 100 reactions Enthält Reagenzien für 5, 50 oder 100 Reaktionen Manufacturer Hersteller

INDICATION The Venor GeM Sample Preparation Kit was developed for isolating mycoplasma DNA from cell culture or biopharmaceutical material. The isolated DNA in combination with Mycoplasma detection kits from Minerva Biolabs GmbH can be used directly for sensitive and robust detection of mycoplasma providing unprecedented performance. The kit s chemistry is based on the previous MB DNA Extraction Kit but the protocol and user instructions were adapted to meet the criteria for EP-compliant testing according to chapter 2.6.7. For isolating genomic DNA or total RNA from other organisms and sources such as eukaryotic tissue, bacterial cells, viruses, and peripheral blood, we recommend our specific ExtractNow Kits. Please go to www.minerva-biolabs.com/extractnow/ for further information. PRINCIPLE OF THE METHOD Cells are lysed by a combination of detergent and chaotropic salt. The lysate is directly applied onto a spin column, where the DNA is selectively bound to highly specified silica membrane. Two subsequent washes remove residual contaminants, like proteins, metabolites, dyes, detergent etc. The purified DNA is eluted in TE buffer. The procedure is completed in ~30 minutes providing DNA ready-to-use for PCR analysis. Kit component Label information 5 extractions Order No. 56-1005 50 extractions Order Nr. 56-1050 Required supplements Spin Columns 5 units 50 units - Collection Tubes 5 units 50 units - Conditioner 2 ml 20 ml - Buffer A1 1.2 ml 11.5 ml 1.5/15 ml ethanol Buffer A2 0.8 ml 8.0 ml 1.9/18.6 ml ethanol Buffer E 0.6 ml 6 ml - REAGENTS Each kit contains reagents for 50 extractions. Samples for 5 extractions are available as well. The expiry date of the unopened package is marked on the package label. The kit components are stored until use at room temperature (18 to 25 C). The lot-specific QC certificate (Certificate of Analysis) can be downloaded from our website (www.minerva-biolabs.com). E N G L I S H 1

ADDITIONAL CONSUMABLES AND EQUIPMENT NOT INCLUDED IN THE KIT The Venor GeM Sample Preparation Kit contains reagents for isolating DNA from various sources. Additional consumables and equipment are required but not included in the kit: Ethanol > 96 % abs. Micro centrifuge tubes (1.5 ml) Micro centrifuge and heat block for 1.5 ml reaction tubes micropipettes and filtered tips (10, 100, and 1000 µl) Proteinase K (catalog No: 56-0002) needed for samples with high protein content (>10mg/ ml) Internal Control DNA extra, needed as spike-in to enable process controlling in conjunction with Venor GeM Classic kit (catalog No: 11-1905) or Venor GeM qep (catalog No: 11-9905) SPECIMEN PCR inhibiting substances may accumulate over time in cell culture medium. Also, medium with more than 12 % serum show inhibitory effects on downstream application such as PCR. Moreover, phenol red, a standard ingredient in cell culture medium, is likely to cross-react and thus falsifying the optical read-out of fluorescence signals in qpcr. These adverse effects can be circumvented by using the Venor GeM Sample Preparation Kit for DNA isolation and clean-up. The Venor GeM Sample Preparation Kit facilitates DNA isolation directly from cell culture supernatant containing up-to 10 6 cells per ml. Samples with high protein content of >10mg/ml may need to be treated with Proteinase K prior to DNA isolation (see protocol for further details). Note that preparation of eukaryotic DNA from cells or tissue is not within the scope of the kit. 2 E N G L I S H

PRECAUTIONS The Venor GeM Sample Preparation Kit is intended for research use. Clinical diagnostics or testing of human samples require extensive validation prior to use. The kit should be used by trained laboratory staff only. All samples should be considered potentially infectious and handled according to local or national regulations. This kit substances may be disposed according to local regulations. Always wear a suitable lab coat, disposable gloves, and protective goggles. The samplepreparation waste contains Conditioner and Buffer A1, which can form highly reactive compounds when combined with bleach. DO NOT add bleach or acidic solutions directly to the samplepreparation waste. If liquid containing these buffers is spilt, clean with suitable laboratory detergent and water. The risk phrases applying to Conditioner and Buffer A1 according to GUIDANCE 67/548/EWG OR GUIDANCE 1999/45/EG are: R 22 R 36/38 R 52/53 Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. Harmful if swallowed. Irritating to eyes and skin. The risk and safety phrases applying are: S 13 S 26 S 36 S 46 Keep away from food, drink and animal feed. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. Wear suitable protective clothing. If swallowed, seek medical advice immediately and show container or label. The risk phrases applying to Conditioner and Buffer A1 according to EG 1272/2008 (GHS) are: Acute Tox. 4, H302; Skin Irrit. 2, H315; Eye Irrit. 2, H319 This kit can be disposed as municipal waste according to local guidelines. E N G L I S H 3

PROCEDURE Before first use reconstitute Buffer A1 and Buffer A2 with absolute ethanol as stated on the bottle label. Pre-heat Buffer E to 70 C. Transfer up to 200 µl of cell culture material into a new 1.5 ml reaction tube. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. For product release testing: add up to 50 µl of Internal Control DNA to the sample or add 30 µl or 12 µl of Internal Control DNA to each sample when using Venor GeM Classic or Venor GeM qep Kit, respectively. Add 200 µl of Conditioner, vortex for at least 10 sec and incubate at room temperature (18 to 25 C) for at least 5 min. Optional: add 10 µl Proteinase K per sample after adding the Conditioner if protein content is >10mg/ml. Vortex briefly and incubate as described above.. Add 200 µl of absolute ethanol to the mixture. Vortex immediately and thoroughly in order to prevent any precipitation of nucleic acids. Do not centrifuge the sample and proceed immediately. Place a new spin column into a new collection tube. Note the sample ID on the lid of the spin column. Fill the sample lysate into the spin column without moistening the rim of the spin column. Centrifuge the spin column for 1 min at 10,600 x g (approx. 10,000 rpm with a bench top centrifuge). Discard the flow through from the collection tube and reassemble spin column and collection tube. Add 500 µl of Buffer A1. Centrifuge the spin column for 1 min at 10,600 x g (approx. 10,000 rpm with a bench top centrifuge), discard the flow through and re-assemble the spin column and collection tube. Add 500 µl Buffer A2. Centrifuge the spin column for 1 min at 10,600 rpm (10,000 x g), discard the flow through and re-assemble spin column and collection tube. Centrifuge for another minute at full speed (approx. 13,200 rpm) in order to remove the remaining Buffer A2. 9. Discard the collection tube and place the spin column into a sample storage tube. 10. Pipette 60 µl of pre-heated Buffer E (70 C) into the spin column directly onto the center of the silica membrane. The complete membrane should get in touch with the Buffer E. Secure the sample storage tube and incubate for 2 min at room temperature. 11. Following the incubation, centrifuge the system for 2 min at 10,600 rpm (10,000 x g). 12. Remove the spin column and use the eluate directly for the PCR procedure. 4 E N G L I S H

NOTES ON THE PROCEDURE 1. This instructions for users must be widely understood for a successful use of Venor GeM Sample Preparation Kit The reagents supplied should not be mixed with reagents from different lots and used as an integral unit. The reagents of the kit should not be used beyond its shelf life. 2. Any deviation from the extraction method can affect the results. 3. For each setup, the use of control samples is advised to secure the day-to-day validity of results. Using Internal Amplification Control as spike-in facilitate the evaluation of the extraction. 4. Do not use other alcohols than ethanol, because other alcohols may cause inconsistent yields. 5. Pre-heating of Buffer E increases the yield significantly. 6. The extract is stable for approximately 1 week at +2 C to +8 C and can be kept at -18 C for long term storage. 7. Untreated cell culture materials should be extracted as soon as possible. Cell culture materials can be stabilized by heat treatment (95 C, 10 min, up to 500 µl) for 1 week at room temperature. APPENDIX Limited Product Warranty This warranty limits our liability for replacement of this product. No warranties of any kind, express or implied, including, without limitation, implied warranties of merchantability or fitness for a particular purpose, are provided. Minerva Biolabs shall have no liability for any direct, indirect, consequential, or incidental damages arising out of the use, the results of use, or the inability to use this product. E N G L I S H 5

ANWENDUNGSGEBIET Der Venor GeM Sample Preparation Kit wurde für die Extraktion und Reinigung von genomischer Mykoplasmen-DNA aus Zellkulturen oder biopharmazeutischen Materialien für eine nachfolgende PCR-Analyse mit dem Venor GeM Mycoplasma PCR Detection Kits entwickelt. Die enthaltenen Reagenzien wurden gegenüber der Vorgängerversion, dem MB DNA Extraction Kit, nicht verändert. Die hier beschriebenen Protokolle wurden jedoch für die spezifischen Anforderungen des Screenings von Zellkulturen und der European Pharmacopoeia (EP)-konformen Testung auf Mykoplasmen gemäß Kapitel 2.6.7 optimiert. Bereits etablierte und validierte Protokolle können weiterhin genutzt werden. Für die Extraktion von viraler, eukaryotischer oder mikrobieller RNA oder DNA aus verschiedensten Materialien empfehlen wir unsere spezialisierten ExtractNow Kits. Eine Auswahl finden Sie auf Seite 11 und unter www.minerva-biolabs.com/extractnow/. ERKLÄRUNG DES VERFAHRENS Die Zellen werden durch eine Kombination aus Detergenz und chaotropen Salz lysiert. Eine vorangegangene Hitzelyse ist unkritisch für die DNA-Ausbeute. Das Lysat wird direkt auf die Spinsäulen aufgebracht. Die DNA wird selektiv an die hoch spezifische Silikamembran gebunden. Zwei nachfolgende Waschschritte entfernen Reste von Verunreinigungen wie Proteine, Stoffwechselprodukte, Farbstoffe, Detergenz usw. Die gereinigte DNA wird in TE-Puffer eluiert. Der Prozess ist in 30 Minuten abgeschlossen. Die DNA kann direkt in die PCR eingesetzt werden. ENTHALTENE REAGENZIEN Jedes Kit enthält Reagenzien für die Extraktion von 50 Proben (Probekits 5 Extraktionen). Das Verfallsdatum der ungeöffneten Packung ist auf dem Außenetikett vermerkt. Die Lagerung erfolgt bis zur Verwendung bei Raumtemperatur. Das chargenspezifische Qualitätskontrollzertifikat (Certificate of Analysis) kann auf unserer Webseite heruntergeladen werden (www.minerva-biolabs.com). Reagenz Bezeichnung 5 Extraktionen Art. Nr. 56-1005 50 Extraktionen Art. Nr. 56-1050 Ergänzungen Spin Columns 5 Einheiten 50 Einheiten - Collection Tubes 10 Einheiten 100 Einheiten - Conditioner 2 ml 20 ml - Buffer A1 1,2 ml 11,5 ml 1,5/15 ml Ethanol Buffer A2 0,8 ml 8,0 ml 1,9/18,6 ml Ethanol Buffer E 0,6 ml 6 ml - 6 D E U T S C H

BENÖTIGTES, ABER NICHT IM KIT ENTHALTENES MATERIAL Der Venor GeM Sample Preparation Kit enthält die Reagenzien für die Extraktion von Gesamt- DNA aus diversen Materialien. Allgemein übliche Verbrauchsmaterialien und Reagenzien eines molekularbiologischen Labors sind nicht enthalten. Dazu zählen: Ethanol > 96 % abs. 1,5 ml Reaktionsgefäße Mikrozentrifuge und Heizblock für 1,5 ml Reaktionsgefäße Pipette mit Filterspitzen (10, 100 und 1000 µl) Proteinase K für Proben mit > 10 mg/ml Gesamtproteingehalt (Art. Nr. 56-0002) Internal Control DNA extra, DNA für die Prozesskontrolle als Probenspike für die Anwendung der Venor GeM Classic Kit (Art. Nr. 11-1905) oder dem Venor GeM qep Kit (Art. Nr. 11-9905) 8 D E U T S C H

PROBENMATERIAL Bei hochkonfluenten Zellkulturen, Zellkulturmedien mit einem Serumgehalt von mehr als 12 % oder hochproteinogenen Proben kann es zu einer Inhibitionen der PCR durch Stoffwechselprodukte bzw. Lipide kommen. Phenolrot wird üblicherweise Zellkulturmedien hinzugefügt und beeinflusst deutlich die Messung der Fluoreszenz in der qpcr. In diesen Fällen ist eine Probenvorbereitung durch DNA-Extraktion dringend notwendig. Der Venor GeM Sample Preparation Kit kann direkt für die Extraktion von DNA aus normalen Proben wie Zellkulturüberständen, die bis zu 10 6 Zellen/ml enthalten können, mit hohen Ausbeuten genutzt werden. Proben mit einer Proteinkonzentration von über 10 mg/ml, wie Zellpellets, Serum oder Fermentationsprodukte, können eine Vorbehandlung mit Proteinase K erfordern (weitere Details siehe Protokoll). Der Kit wurde nicht für die Aufreinigung von eukaryotischer DNA aus Zellen optimiert. VORSICHTSMAßNAHMEN Dieser Kit ist ausschließlich für Forschungszwecke bestimmt und darf ohne probenspezifische Validierung nicht für die Freigabetestung eingesetzt werden. Dieser Kit sollte nur von geschulten Personen verwendet werden. Das Probenmaterial muss als potentiell infektiös betrachtet und nach den lokalen oder nationalen Vorschriften behandelt werden. Immer Einmalhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille tragen. Bestandteile des Conditioners und des Buffer A1 können mit Bleichmitteln oder säurehaltigen Lösungen hochreaktive Verbindungen bilden. Mischen Sie keine säurehaltigen oder bleichenden Mittel mit dem Flüssigabfall. Ausgelaufene oder verschüttete Reste können mit Wasser und Spülmittel entfernt werden. Einstufung gemäß Richtlinie 67/548/EWG oder Richtlinie 1999/45/EG für Conditioner und Buffer A1: R 22 R 36/38 R 52/53 S 13 S 26 S 36 S 46 Gesundheitsschädlich beim Verschlucken. Reizt die Augen und die Haut. Schädlich für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen haben. Von Nahrungsmitteln, Getränken und Futtermitteln fernhalten. Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen. Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen und Verpackung oder Etikett vorzeigen. Einstufung gemäß Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 (GHS) für Conditioner und Buffer A1: Acute Tox. 4, H302; Skin Irrit. 2, H315; Eye Irrit. 2, H319 Dieser Kit kann gemäß den örtlichen Bestimmungen als Hausmüll entsorgt werden. D E U T S C H 9

DURCHFÜHRUNG Vor der ersten Verwendung muss Ethanol abs. (> 96 %) zu Buffer A1 und Buffer A2 gemäß den Etiketteninformation gegeben werden. Des Weiteren muss der Buffer E vorab auf 70 C äquilibriert werden. 200 µl des Probenmaterials werden in ein frisches 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Für die Freigabetestung: wird die Zugabe von bis 50 µl Internal Control DNA als Prozesskontrolle empfohlen. Für die Testung mit dem Venor GeM Classic sollten 30 µl je Probe und für den Venor GeM qep Kit 12 µl je Probe von der Internal Control DNA des PCR Kits hinzugegeben werden. Nach Zugabe von 200 µl Conditioner wird ausgiebig (10 sec.) gevortext und der Ansatz über 5 min bei Raumtemperatur (18 bis 25 C) inkubiert. Optional: bei Proben mit einem Protein-Gehalt > 10 mg/ml werden 10 µl Proteinase K zum Probe/ Conditioner-Gemisch dazu pipettiert und kurz gevortext. Die Inkubation erfolgt wie oben beschrieben. Der Ansatz wird mit 200 µl absolutem Ethanol versetzt und sofort gut gemischt, um eine Fällung der DNA zu vermeiden. Die Verwendung anderer Alkohole führt zu einer deutlichen Verringerung der Ausbeute an DNA. Für jede Probe wird ein Spin Column wird aus der Verpackung genommen und in das Collection Tube gesteckt. Die Probenkennung wird auf dem Deckel notiert und mit dem gesamten Lysat befüllt, ohne dabei den oberen Rand des Gefäßes zu benetzen. Das Spin Column wird mit dem Collection Tube für 1 min bei 10.600 g (bei Tischzentrifugen ca. 10.000 Umdrehungen/min) zentrifugiert, das Eluat verworfen und das Spin Column wieder in das Collection Tube platziert. In das Spin Column werden 500 µl Buffer A1 hineingegeben und das Spin Column mit dem Collection Tube für 1 min bei 10.600 g (bei Tischzentrifugen ca. 10.000 Umdrehungen/min) zentrifugiert, um den Buffer A1 abzutrennen. Das Eluat wird verworfen und die Säule wieder in das Collection Tube platziert. In das Spin Column werden 500 µl Buffer A2 hineingegeben und das Spin Column mit dem Collection Tube für 1 min bei 10.600 g (bei Tischzentrifugen ca. 10.000 Umdrehungen/min) zentrifugiert, um den Buffer A2 abzutrennen. Das Spin Column wird aus dem Collection Tube genommen und das Eluat (Buffer A2) verworfen. Das Spin Column wird mit dem gleichem Collection Tube noch einmal 1 min bei maximaler Umdrehungsleistung der Zentrifuge zur vollständigen Trocknung zentrifugiert. Das Spin Column wird in ein frisches 1,5 ml Reaktionsgefäß gegeben und das Eluat samt Collection Tube verworfen. Es werden 60 µl vorgewärmter Buffer E in das Spin Column pipettiert und für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wird das System für 2 min bei 10.600 g (bei Tischzentrifugen ca. 10.000 Umdrehungen/min) zentrifugiert. Das Spin Column wird entfernt und das Probengefäß verschlossen. Der Extrakt kann direkt für die PCR eingesetzt werden. 10 D E U T S C H

ANMERKUNGEN ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Diese Gebrauchsinformation muss für eine erfolgreiche Benutzung des Venor GeM Sample Preparation Kits weitgehend verstanden worden sein. Die gelieferten Reagenzien einer Charge sind als integrale Einheit zu verstehen. Reagenzien verschiedener Chargen dürfen nicht vermischt werden. Die Reagenzien des Kits dürfen nach Ablauf der Haltbarkeit nicht mehr verwendet werden. 2. Jegliche Abweichung vom Extraktionsverfahren kann die Resultate beeinträchtigen. 3. Je Ansatz sollte mindestens eine Extraktionskontrolle mitgeführt werden. Vorzugsweise wird diese mit der Internen Amplifikationskontrolle des PCR-Tests versetzt. 4. Der Extrakt ist bei +2 C bis +8 C für ca. 1 Woche stabil und kann bei mindestens -18 C gelagert werden. 5. Die Verwendung anderer Alkohole als Ethanol abs. führt zu einer deutlichen Verringerung der Ausbeute an DNA. 6. Unbehandelte Zellkulturmaterialien sollten schnellstmöglich extrahiert werden. Zellkulturmaterialien können durch eine Hitzebehandlung (95 C, 10 min, bis zu 500 µl) für 1 Woche bei Raumtemperatur stabilisiert werden. D E U T S C H 11

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