Produkte & Applikationen LC 24 2017 Optimierung der Analytik von Peptiden und kleinen Proteinen Relativ kleine Änderungen der Bedingungen können in der Peptidanalytik mittels RP-Chromatografie größere Auswirkungen auf Trennung und Peakform haben. Die Verwendung einer sauren mobilen Phase hat sich zweifellos bewährt (E. Wang, D. Kalu Appulage, F. Carroll, K. Schug, Intact protein separation and quantitation in biological fluids using HPLC and triple quadrupole mass spectrometry, ASMS, St. Louis, MO, 2015). Dabei hat die Art der Säure und deren Konzentration einen großen Einfluss auf die Selektivität des Trennsystems. Auch die Temperatur und die Steigung des Gradienten spielen eine bedeutende Rolle. Nicht zu vergessen die Säule, die dauerhaft dem sauren Eluenten standhalten und stabile Retentionszeiten liefern sowie für schmale Peaks sorgen muss. Anhand einer Mischung strukturell unterschiedlicher Peptide und Cytochrom C (als Vertreter kleiner Proteine) (Tabelle 1) wird im Folgenden der Einfluss verschiedener Säuretypen und Säurekonzentrationen gezeigt. Tabelle 1: Mischung verschiedener Peptide und eines kleinen Proteins Die Stärke der verwendeten Säure beeinflusst entscheidend die Chromatografie des Peptid/Protein-Mixes (Abb.1). Abbildung 1: Effekt des Säuretyps auf Selektivität und Peakform (FA = Ameisensäure, TFA = Trifluoressigsäure) (2.7µm 100x2.1mm, Art. Nr.9314A12) Temperatur: 60 C Probe: Peptid/Protein-Mix (Tabelle 1) 0.2-0.4 mg/ml in Wasser mit 0.1% Ameisensäure A: Wasser + Säure B: Acetonitril + Säure Flussrate: 1 ml/min 0 min 5%B 1 min 5% B 10 min 50% B anschließend Re-Äquilibrierung. Detektion: MS, ESI pos. www.restekgmbh.de
Faustregel: Jede Ladung im Molekül macht es (um ein Vielfaches) polarer, wodurch die Retention auf C18-Säulen abnimmt und die Peakform meist schlecht wird. D.h. will man auf C18-Säulen eine längere Retention und gute Peakform erreichen, muss man dafür sorgen, dass die Substanz möglichst wenig Ladungen trägt. Die Säurestärke beeinflusst hier die Dissoziation der Säuregruppe der Peptide (Abb. 2). Z.B. das neutrale Peptid VAL-TYR-VAL (Peak 2) eluiert mit der stärkeren Säure Trifluoressigsäure (TFA) später und mit besserer Peakform, weil im stärker sauren Medium die Säuregruppe des Peptids weniger stark dissoziiert und damit hydrophober ist. Abbildung 2: Grundstruktur eines Dipeptids mit peptidischer Bindung und den endständigen, dissoziierbaren Amin- und Säurefunktionen (Quelle: P. Karlson, Kurzes Lehrbuch der Biochemie, 13. Auflage). H + Zudem weist die Trifluoressigsäure einen gewissen ionenpaarbildenden Effekt auf, der die Ladung an der Aminfunktion kompensiert und deshalb generell zu längerer Retention der Peptide führt. Dies wird insbesondere am basischen Peptid MET-ARG-PHE-ALA sichtbar (Peak 3), das durch die zusätzlichen Aminfunktionen der Aminosäure Arginin noch mehr Ladungen aufweist, die durch TFA abgeschirmt werden, nicht aber durch die schwächere Ameisensäure. Die Variation der Säurekonzentration (Abb. 3) zeigt im Prinzip das Gleiche. Mit steigender Konzentration an TFA verbessern sich Retention und Peakform bis zu einem stabilen Zustand bei 0.1% TFA. (2.7µm 100x2.1mm, Art. Nr. 9314A12) Temperatur: 60 C Probe: Peptid/Protein-Mix (Tabelle 1) 0.2-0.4 mg/ml in Wasser mit 0.1% Ameisensäure A: Wasser + TFA B: Acetonitril + TFA Flussrate: 1 ml/min 0 min 5%B 1 min 5% B 10 min 50% B anschließend Re-Äquilibrierung. Detektion: MS, ESI pos. 2
TFA ist in der LCMS nicht gerade beliebt wegen der starken Ionensuppression, die es bei negativer Elektrosprayionisation verursacht und der Tatsache, dass es sich nur schlecht aus dem System ausspülen lässt, was einen Wechsel zwischen ESI positiv und ESI negativ schwierig macht. Man kann auch schauen, wie weit man mit Ameisensäure kommt. Deren Eignung hängt ja primär von der Art des Peptids ab. Einige Peaks in Abb. 1 sehen auch mit Ameisensäure gut aus. Wichtig dabei ist auch die richtige Konzentration herauszufinden, um stabile Retentionszeiten zu erhalten. Verwendet man einen UV-Detektor oder nutzt man das LCMS-Gerät nur für die Peptid- bzw. Proteinanalytik im positiven ESI-Modus, dann ist TFA die Säure der Wahl. Ein Problem, das man mit TFA aufgrund seiner Säurestärke auf längere Sicht haben kann, sind kürzer werdende Retentionszeiten durch Abbau der stationären Phase. Deshalb ist es wichtig, unter diesen Bedingungen eine säurestabile C18-Säule zu verwenden, wie zum Beispiel die sterisch geschützte Raptor ARC-18 Core-Shell Säule, die zudem noch für schmale Peaks sorgt. Nähere Informationen zur Säurestabilität der Raptor ARC-18 sind in der Broschüre auf Seite 3 zu finden. Anhand der Peptide aus einem tryptischen Verdau von Rinderserum-Albumin (BSA) als Probe wird der Einfluss der Säulentemperatur und der Steigung des Gradienten gezeigt (Abb. 4). (2.7µm, 100x2.1mm, Art. Nr. 9314A12) Temperatur: siehe Abbildung Probe: 5pmol Standard tryptischer Verdau von BSA, verdünnt in Wasser mit 0.1% Ameisensäure. A: Wasser + 0.1% Ameisensäure B: Acetonitril + 0.1% Ameisensäure Flussrate: 0.3 ml/min 0 min 2% B 40 min 25% B anschließend 10 min Re-Äquilibrierung. Detektion: MS TIC, 300-1250 Da, ESI pos. Abbildung 4: Effekt der Temperatur auf die Selektivität der BSA-Peptid-Trennung 60 C ist eine häufig angewendete Temperatur in der Peptid- und Proteinanalytik, aber es lohnt sich durchaus, im RP-Modus auch niedrigere Temperaturen zu versuchen. Abbildung 4 zeigt eine leicht geänderte Selektivität bei 40 C, die unter anderem zur Abtrennung eines weiteren Peaks im ersten blau umrandeten Bereich führt. 3
Wie eigentlich auch zu erwarten war, können bei flacheren Gradienten weitere Peaks aufgelöst werden (Abb. 5). (2.7µm, 100x2.1mm, Art. Nr. 9314A12) Temperatur: 40 C Probe: 5pmol Standard tryptischer Verdau von BSA, verdünnt in Wasser mit 0.1% Ameisensäure. A: Wasser + 0.1% Ameisensäure B: Acetonitril + 0.1% Ameisensäure Flussrate: 0.3 ml/min 0 min 2% B X min 25% B (siehe Abbildung) anschließend 10 min Re-Äquilibrierung. Detektion: MS TIC, 300-1250 Da, ESI pos. Abbildung 5: Effekt der Gradientensteigung auf die Selektivität der BSA-Peptid-Trennung Damit sind flache Gradienten ein gutes Hilfsmittel, wenn komplexe Proben wie zum Beispiel ein Protein -Verdau analysiert werden sollen. Steilere Gradienten dagegen sind besser geeignet für Mischungen spezifischer Peptide, bei denen es um kurze Laufzeiten und hohen Durchsatz geht. Einen englischsprachigen Artikel zu diesem Thema finden Sie hier. 4
Fast Facts zur Raptor ARC-18 Core-Shell Säule optimiert für die Multikomponentenanalyse mittels saurem Eluenten C18-Phase mit sterischer Abschirmung des Liganden für optimale Beständigkeit bei ph-werten < 2 Wechseln Sie zu Raptor ARC-18, wenn Sie komplexe Mischungen analysieren, insbesondere per LC/MS stark saure Bedingungen benötigen (ph 1-3) schnelle Trennungen mit langen Säulenstandzeiten bei niedrigen ph-werten erreichen möchten Anwendungsbeispiele: Aflatoxine, DNPH-Aldehyde/Ketone, FMOC-Aminosäuren, Cannabinoide, Flavonoide, Polyphenole, Pestizide (!), Peptide und kleine Proteine, Sprengstoffe / explosive Stoffe, fettlösliche Vitamine und Vitamin D Metaboliten,. >> Weitere Informationen und Applikationen zur Raptor ARC-18 Säule finden Sie HIER << Haben Sie Fragen zu dieser Problematik oder benötigen Sie weitere Informationen dazu? Kontaktieren Sie uns! Dr. Ute Beyer, Tel. 06172/2797-42, Email ute.beyer@restekgmbh.de Restek GmbH Schaberweg 23 61348 Bad Homburg Tel. 06172 / 2797-0 Fax 06172 / 2797-77 www.restekgmbh.de info@restekgmbh.de 5