RIDASCREEN Penicillin Art. No. R2921

RIDASCREEN Penicillin Art. No. R2921 Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Penicillin-Antibiotika Enzyme immunoassay for the quantitative determination of penicillin antibiotics In vitro Test Lagerung bei 2-8 C Storage at 2-8 C

Für weitere Fragen stehen Ihnen gerne zur Verfügung: Please contact for questions and further information: Zentrale/Switchboard Tel./Phone: +49 (0) 61 51-81 02-0 Auftragsannahme/Order department Fax: +49 (0) 61 51-81 02-20 E-Mail: orders@r-biopharm.de Marketing & Vertrieb/Marketing & sales Fax: +49 (0) 61 51-81 02-40 E-Mail : info@r-biopharm.de RIDA und RIDASCREEN sind eingetragene Marken der R-Biopharm AG Hersteller: R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland R-Biopharm AG ist ISO 9001 zertifiziert. RIDA and RIDASCREEN are registered trademarks of R-Biopharm AG Manufacturer: R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany R-Biopharm AG is ISO 9001 certified. 2 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21

Kurzinformation RIDASCREEN Penicillin (Art. Nr.: R2921) ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Penicillin-Antibiotika in Milch und Milchprodukten (Kondensmilch, Molke, Butter, Käse, Quark, Sahne, Schmand, Crème fraîche, Joghurt, Kefir), Babynahrung, Serum (Rind, Schwein) und Fleisch (Rind, Schwein, Geflügel). Alle Reagenzien für die Durchführung des Enzymimmunoassays - inkl. Standards - sind im Testkit enthalten. Ein Testkit ist ausreichend für 96 Bestimmungen (einschl. Standardbestimmungen). Zur Auswertung benötigt man ein Mikrotiterplatten-Photometer. Probenvorbereitung: Zeitbedarf: Milch: Verdünnen Kondensmilch, Molke: Verdünnen Butter: Schmelzen, verdünnen, zentrifugieren, weiterverdünnen Käse: Homogenisieren, verdünnen, zentrifugieren, weiterverdünnen Quark, Sahne, Schmand, Crème fraîche, Joghurt, Kefir: Verdünnen, zentrifugieren, weiterverdünnen Babynahrung: rekonstituieren, verdünnen Serum: verdünnen Fleisch: Homogenisieren, extrahieren, zentrifugieren, verdünnen Probenvorbereitung (für 10 Proben) Milch, Kondensmilch, Molke, Fruchtmolke... ca. 10 min Butter... ca. 60 min Käse... ca. 60 min Quark, Sahne, Saure Sahne, Schmand, Crème fraîche, Naturjoghurt, Fruchtjoghurt, Kefir... ca. 45 min Babynahrung (rekonstituiert)... ca. 30 min Serum (Rind, Schwein)... ca. 10 min Fleisch (Rind, Schwein, Geflügel)... ca. 30 min Testdurchführung (Inkubationszeit)... 1 h 30 min RIDASCREEN Penicillin 15-10-21 3

Nachweisgrenze: (bezogen auf die Standardsubstanz) Milch... ca. 0,2 µg/l Kondensmilch, Sahne, Molke... ca. 0,9 µg/l Fruchtmolke... ca. 1,1 µg/l Butter, Käse... ca. 2,1 µg/kg Quark, Saure Sahne, Schmand, Crème fraîche,... ca. 1,1 µg/kg Naturjoghurt, Fruchtjoghurt, Kefir... ca. 1,3 µg/kg Babynahrung (rekonstituiert)... ca. 0,3 µg/l Serum (Rind, Schwein)... ca. 0,4 µg/l Fleisch (Rind, Schwein, Geflügel)... ca. 2,6 µg/kg Wiederfindung: Milch... ca. 96 % (bezogen auf Kondensmilch, Sahne, Molke... ca. 127 % Penicillin G)* Fruchtmolke... ca. 152 % Butter, Käse... ca. 115 % Quark, Saure Sahne, Schmand, Crème fraîche... ca. 101 % Naturjoghurt, Fruchtjoghurt, Kefir... ca. 87 % Babynahrung (rekonstituiert)... ca. 101 % Serum (Rind, Schwein)... ca. 141 % Fleisch (Rind, Schwein, Geflügel)... ca. 104 % * Penicillin G ist bei Milchkühen das am häufigsten eingesetzte Antibiotikum. Zur Bestimmung der Wiederfindung wurden daher die Proben mit Penicillin G dotiert. Die zur Berechnung der Wiederfindung gemessene Konzentration der dotierten Proben wurde dabei nicht um die Kreuzreaktivität des Antikörpers für Penicillin G im Puffer oder in der jeweiligen Matrix korrigiert. Die Spezifität des RIDASCREEN Penicillin-Tests wurde durch die Bestimmung der Kreuzreaktivität zu den entsprechenden Substanzen im Puffersystem ermittelt. In Proben kann die Spezifität aufgrund von Matrixeffekten von der im Puffersystem ermittelten abweichen. Vor der Analyse von kreuzreaktiven Substanzen muss deren Nachweisgrenze und Wiederfindungsrate in der jeweiligen Matrix durch den Anwender bestimmt werden. Der Test kann nicht zwischen Analyten und kreuzreaktiven Substanzen diskriminieren. 4 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21

Ampicillin (Standardsubstanz)... 100 % Azlocillin... ca. 130 % Penicillin G... ca. 115 % Piperacillin... ca. 91 % Penicillin V... ca. 86 % Amoxicllin... ca. 63 % Cloxacillin... ca. 31 % Oxacillin... ca. 30 % Dicloxacillin... ca. 13 % Nafcillin... ca. 6 % Cephalosporin-Antibiotika... < 1% Zur Erhöhung der Prüfungsqualität bei ELISA-Verfahren verweisen wir zusätzlich auf unser ELISA-Handbuch in der jeweiligen Fassung. Dieses führt Mindeststandards hinsichtlich der Rahmenbedingungen auf, die bei der Verwendung von Testsystemen der R-Biopharm AG und der Durchführung von ELISA-Analysen mit diesen Testsystemen zu beachten sind. Das Handbuch kann unter der Webseite www.r-biopharm.com/de/produkte/lebensmittel-futtermittelanalytik abgerufen, gedruckt und gespeichert werden. 1. Verwendungszweck RIDASCREEN Penicillin ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Penicillin-Antibiotika in Milch und Milchprodukten (Kondensmilch, Molke, Butter, Käse, Quark, Sahne, Schmand, Crème fraîche, Joghurt, Kefir), Babynahrung, Serum (Rind, Schwein) und Fleisch (Rind, Schwein, Geflügel). 2. Allgemeines β-lactam-antibiotika welche nach ihrem charakteristischen fünfgliedrigen β-lactam-ring benannt sind, stellen eine große Gruppe von Antibiotika dar. Sie werden anhand ihrer chemischen Struktur in mehrere Untergruppen klassifiziert, von denen die Penicilline, Cephalosporine und Carbapeneme die wichtigsten sind. Die Penicilline wurden im Jahre 1928 von Alexander Fleming eher versehentlich entdeckt und hemmen die Zellwandsynthese von grampositiven Bakterien. Trotz ihrer frühen Entdeckung, sind sie weltweit immer noch die am häufigsten eingesetzte Gruppe von Antibiotika. Speziell für Mastitis, eine bakterielle Infektion der Euter von Milchkühen, werden sie zur Primärbehandlung eingesetzt. Aus Gründen des Verbraucherschutzes und zur Absicherung der Prozesssicherheit in der Milchindustrie, wurden in der Verordnung (EU) Nr. 37/2000 Rückstandshöchstmengen (MRLs) für 7 Penicilline in Lebensmitteln tierischen Ursprungs festgelegt. RIDASCREEN Penicillin 15-10-21 5

3. Testprinzip Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Vertiefungen der Mikrotiterstreifen sind mit Fänger-Antikörpern gegen anti-ampicillin-antikörper beschichtet. Zugegeben werden Standards bzw. Probe, anti-ampicillin-antikörper und enzymmarkiertes Ampicillin. Freies und enzymmarkiertes Ampicillin konkurrieren um die Ampicillin-Antikörperbindungsstellen (kompetitiver Enzymimmunoassay). Die anti-ampicillin-antikörper werden von den immobilisierten Fänger-Antikörpern gebunden. Nicht gebundenes, enzymmarkiertes Ampicillin wird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Der Nachweis erfolgt durch Zugabe von Substrat-/Chromogenlösung. Gebundenes Enzymkonjugat wandelt das Chromogen in ein blaues Endprodukt um. Die Zugabe des Stopp-Reagenzes führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm; die Extinktion der Lösung ist umgekehrt proportional zu der Ampicillin-Konzentration in der Probe. 4. Packungsinhalt Mit den Reagenzien einer Packung können 96 Bestimmungen durchgeführt werden (einschließlich Standardbestimmungen). Jedes Testkit enthält: Komponente Deckelfarbe Zustand Inhalt Microtiter plate Mikrotiterplatte Standard Standard Wash buffer Waschpuffer Conjugate Konjugat Antibody Antikörper Standard/conjugate/ antibody/sample buffer Standard/Konjugat/ Antikörper/Probenpuffer Substrate/Chromogen Substrat/Chromogen Stop solution Stopp Lösung - gebrauchsfertig 96 Kavitäten schwarz Lyophilisat 8 ng 3 Stück weiß Konzentrat 20x 30 ml rot Konzentrat 100x 0,1 ml schwarz Konzentrat 100x 0,1 ml weiß Konzentrat 4x 25 ml braun gebrauchsfertig 12 ml gelb gebrauchsfertig 15 ml 6 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21

5. Zusätzlich benötigte Reagenzien erforderliches Zubehör 5.1. Geräte: Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm) Vortex Messpipetten variable 20 µl - 200 µl und 200-1000 µl Mikropipetten Mixer (nur für Käse- und Fleischproben) Schüttler Zentrifuge 5.2. Reagenzien: demineralisiertes Wasser 6. Vorsichtsmaßnahmen Dieser Test ist nur von geschultem Laborpersonal durchzuführen. Die Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Tests ist strikt einzuhalten. Dieses Kit kann gesundheitsgefährdende Substanzen enthalten. Sicherheitshinweise zu den enthaltenen Komponenten entnehmen Sie bitte den Sicherheitsdatenblättern (MSDS) zu diesem Produkt auf unserer Internetseite www.r-biopharm.de. 7. Reagenzien und ihre Lagerung Die Reagenzien bei 2-8 C lagern. Komponenten des Testkits auf keinen Fall einfrieren. Nicht benötigte Kavitäten zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2-8 C lagern. Das Substrat/Chromogen ist lichtempfindlich, deshalb direkte Lichteinwirkung vermeiden. Nach Ablauf des Verfallsdatums (siehe Testkit-Außenetikett unter Expiration) kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Ein Austausch von Einzelreagenzien zwischen Kits verschiedener Chargennummern ist nicht zulässig. RIDASCREEN Penicillin 15-10-21 7

8. Anzeichen für Reagenzienverfall bläuliche Färbung des rötlichen Substrat/Chromogen vor Zugabe in die Kavitäten Extinktion kleiner 0,8 (E 450 nm < 0,8) für Standard 1 9. Probenvorbereitung Die Proben kühl lagern. 9.1. Milch (Roh-, Frisch-, H-Milch) Milchprobe 3 s vortexen 1:2 (1+1) mit Probenpuffer verdünnen (z.b. 1 ml Milch + 1 ml Probenpuffer) 3 s vortexen 50 µl pro Kavität im Test einsetzen 9.2 Kondensmilch, Molke und Fruchtmolke 500 µl Probe 1:10 (1+9) mit Probenpuffer verdünnen (z.b. 0,2 ml Probe + 1,8 ml Probenpuffer) 3 s vortexen 50 µl pro Kavität im Test einsetzen 9.3 Butter 5 g Butter in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen einwiegen 20 ml demineralisiertes Wasser hinzugeben und bei 40 C in einem Wasserbad erwärmen bis die Butter vollständig geschmolzen ist durch Vortexen homogenisieren zentrifugieren: 10 min / 4000 g / 4 C untere wässrige Phase 1:4 (1+3) mit Probenpuffer verdünnen (z.b. 0,5 ml untere Phase + 1,5 ml Probenpuffer) 50 µl pro Kavität im Test einsetzen 9.4. Hart-, Weich- und Schmelzkäse 5 g Käseprobe mit 20 ml demineralisiertem Wasser vollständig in einem Mixer homogenisieren zentrifugieren: 10 min / 4000 g / 4 C untere wässrige Phase 1:4 (1+3) mit Probenpuffer verdünnen (z.b. 0,5 ml untere Phase + 1,5 ml Probenpuffer) 50 µl pro Kavität im Test einsetzen 8 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21

9.5. Quark, Sahne, Saure Sahne, Schmand, Crème fraîche, Naturjoghurt, Fruchtjoghurt und Kefir 20 ml demineralisiertes Wasser zu 5 g Probe geben durch Vortexen homogenisieren zentrifugieren: 10 min / 4000 g / 4 C untere wässrige Phase 1:4 (1+3) mit Probenpuffer verdünnen (z.b. 0,5 ml der unteren Phase + 1,5 ml Probenpuffer) 50 µl pro Kavität im Test einsetzen 9.6. Babynahrung 1 g Babynahrung einwiegen und mit demineralisiertem Wasser auf 10 ml auffüllen Probe vortexen bis die Babynahrung vollständig gelöst ist rekonstituierte Babynahrung 1:2 (1+1) mit Probenpuffer verdünnen (z.b. 1 ml rekonstituierte Babynahrung + 1 ml Probenpuffer) 3 s vortexen 50 µl pro Kavität im Test einsetzen 9.7. Serum (Rind, Schwein) Probe 3 s vortexen 1:4 (1+3) mit Probenpuffer verdünnen (z.b. 100 µl Serum + 300 µl Probenpuffer) 3 s vortexen 50 µl pro Kavität im Test einsetzen 9.8. Fleisch (Geflügel, Schwein, Rind) Probe vollständig homogenisieren 4 ml demineralisiertes Wasser zu 1 g homogenisierte Probe geben vortexen und 15 min über Kopf schütteln zentrifugieren: 10 min / 2000 g / Raumtemperatur (20-25 C) Überstand 1:8 (1+7) mit Probenpuffer verdünnen (z.b. 50 µl Überstand + 350 µl Probenpuffer) 50 µl pro Kavität im Test einsetzen RIDASCREEN Penicillin 15-10-21 9

10. Testdurchführung 10.1. Testvorbereitungen Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20-25 C) bringen. Eventuell vorhandene Präzipitate im Konzentrat vor Verdünnung durch Schütteln bei Raumtemperatur auflösen. Das Waschpufferkonzentrat 1:20 (1+19) mit demineralisiertem Wasser verdünnen (z.b. 2 ml Konzentrat + 38 ml demineralisiertes Wasser, ausreichend für 4 Mikrotiterstreifen). Der endverdünnte Puffer kann bei 2-8 C bis zum Ablauf des Verfallsdatums des Konzentrats gelagert werden. Das enthaltene Pufferkonzentrat wird als Standard-, Antikörper-, Konjugat und Probenpuffer benötigt. Das Konzentrat 1:4 (1+3) mit demineralisiertem Wasser verdünnen (z.b. 10 ml Konzentrat + 30 ml demineralisiertes Wasser). Der endverdünnte Puffer kann bei 2-8 C bis zum Ablauf des Verfallsdatums des Konzentrats gelagert werden. Der anti-ampicillin-antikörper liegt als Konzentrat vor. Da der rekonstituierte Antikörper nur begrenzte Haltbarkeit aufweist, immer nur so viel Antikörper- Konzentrat mit Antikörperpuffer verdünnen, wie unmittelbar benötigt wird. Das Antikörper-Konzentrat vor der Entnahme zentrifugieren (1 min / 1000 g / Raumtemperatur (20-25 C). Um den gebrauchsfertigen Antikörper herzustellen, muss das Konzentrat 1:100 (1+99) mit Antikörperpuffer verdünnt werden (z.b. 10 µl Konzentrat + 990 µl Antikörperpuffer, ausreichend für 4 Mikrotiterstreifen). Das Ampicillin-Konjugat liegt als Konzentrat vor. Da das rekonstituierte Konjugat nur begrenzte Haltbarkeit aufweist, immer nur so viel Konjugat- Konzentrat mit Konjugatpuffer verdünnen, wie unmittelbar benötigt wird. Das Konjugat-Konzentrat vor der Entnahme zentrifugieren (1 min / 1000 g / Raumtemperatur (20-25 C). Um das gebrauchsfertige Konjugat herzustellen, muss das Konzentrat 1:100 (1+99) mit Konjugatpuffer verdünnt werden (z.b. 10 µl Konzentrat + 990 µl Konjugatpuffer, ausreichend für 4 Mikrotiterstreifen). 10 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21

Der Ampicillin Standard liegt als Lyophilisat vor. Das Lyophilisat in 2 ml Standardpuffer rekonstituieren, um Standard 7 mit einer Konzentration von 4 ng/ml zu erhalten. Die Standards 2-6 durch eine serielle Verdünnungsreihe wie folgt herstellen: mit 2 ml Standardpuffer rekonstituierter Standard -> Standard 7 = 4 ng/ml 250 µl Standard 7 + 250 µl Standardpuffer -> Standard 6 = 2 ng/ml 250 µl Standard 6 + 250 µl Standardpuffer -> Standard 5 = 1 ng/ml 250 µl Standard 5 + 250 µl Standardpuffer -> Standard 4 = 0,5 ng/ml 250 µl Standard 4 + 250 µl Standardpuffer -> Standard 3 = 0,25 ng/ml 250 µl Standard 3 + 250 µl Standardpuffer -> Standard 2 = 0,125 ng/ml Standardpuffer als Standard 1 = 0 ng/ml verwenden. Die Standards aliquotieren und bei - 20 C für maximal 1 Woche lagern. Nicht wiederholt einfrieren und auftauen. 10.2. Testdurchführung Sorgfältiges Waschen ist sehr wichtig. Ein Eintrocknen der Kavitäten zwischen den Arbeitsschritten vermeiden. 1. So viele Kavitäten in den Halterahmen einsetzen, wie für alle Standards und Proben in Doppelbestimmung benötigt werden. Die Positionen der Standards und der Proben protokollieren. 2. Je 50 µl der Standardlösung bzw. der vorbereiteten Proben als Doppelbestimmung in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. 3. 25 µl des verdünnten Konjugats in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. 4. 25 µl des verdünnten Antikörpers in die entsprechenden Kavitäten pipettieren, vorsichtig manuell mischen und 1 h bei Raumtemperatur (20-25 C) im Dunklen inkubieren. 5. Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 300 µl Waschpuffer (siehe 10.1) waschen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen. 6. Je 100 µl Substrat/Chromogen in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. Vorsichtig manuell mischen und 30 min bei Raumtemperatur (20-25 C) im Dunkeln inkubieren. 7. Je 100 µl Stopp Lösung in jede Kavität pipettieren und vorsichtig manuell mischen. Die Extinktion bei 450 nm direkt nach Zugabe der Stopp Lösung messen. RIDASCREEN Penicillin 15-10-21 11

11. Auswertung Für die Auswertung ist bei R-Biopharm eine speziell für die RIDASCREEN Enzymimmunoassays entwickelte Software, die RIDA SOFT Win / RIDA SOFT Win.net (Art. Nr. Z9996), erhältlich. Der Verlauf der Standardkurve kann dem beigefügten Analysenzertifikat entnommen werden. Hinweis für die Berechnung ohne Software: Extinktion Standard (bzw. Probe) Extinktion Nullstandard x 100 = B/B 0 (%) Den Nullstandard somit gleich 100 % setzen und die Extinktionswerte in Prozent angeben. Die errechneten Werte für die Standards in einem Koordinatensystem auf halblogarithmischem Millimeterpapier gegen die Ampicillin-Konzentration [µg/kg] auftragen. Um die in den Proben enthaltene tatsächliche Ampicillin-Konzentration in µg/kg (ppb) zu erhalten, muss die aus der Standardkurve abgelesene Konzentration noch mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Beim Arbeiten nach der angegebenen Vorschrift gilt folgender Verdünnungsfaktor: Milch... 2 Kondensmilch, Molke, Fruchtmolke... 10 Butter, Käse, Quark, Sahne, Saure Sahne, Schmand, Crème fraîche, Naturjoghurt, Fruchtjoghurt, Kefir... 20 Babynahrung rekonstituiert... 2 Babynahrung pulverförmig... 20 Serum (Rind, Schwein)... 4 Fleisch (Rind, Schwein, Geflügel)... 40 Für weitere Produktinformationen und Applikationen kontaktieren Sie bitte info@r-biopharm.de. Diese Angaben entsprechen dem heutigen Stand unserer Kenntnisse und sollen über unsere Produkte und deren Anwendungsmöglichkeiten informieren. Sie haben somit nicht die Bedeutung, bestimmte Eigenschaften der Produkte oder deren Eignung für einen konkreten Einsatzzweck zuzusichern. R-Biopharm übernimmt keine Gewährleistung, außer für die standardisierte Qualität der Reagenzien. Defekte Produkte werden ersetzt. Für darüber hinaus gehende direkte, indirekte Schäden oder sonstige Kosten im Zusammenhang mit der Nutzung der Produkte haftet R-Biopharm nicht. 12 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21

RIDASCREEN Penicillin Brief information RIDASCREEN Penicillin (Art. No.: R2921) is a competitive enzyme immunoassay for the quantitative analysis of penicillin antibiotics in milk and dairy products (condensed milk, whey drinks, butter, cheese, curd, cream, sour cream, crème fraiche, yoghurt, kefir), baby food, serum (bovine, porcine) and meat (beef, pork, poultry). All reagents required for the enzyme immunoassay - including standards - are contained in the test kit. The test kit is sufficient for 96 determinations (including standards). A microtiter plate spectrophotometer is required for quantification. Sample preparation: Time requirement: milk: Dilution condensed milk, whey drinks: Dilution butter: Melting, dilution, centrifugation, further dilution cheese: Homogenization, dilution, centrifugation, further dilution curd, cream, sour cream, crème fraîche, yoghurt, kefir: Dilution, centrifugation, further dilution baby food: Reconstitution, dilution serum: dilution meat: homogenization, extraction, centrifugation, dilution sample preparation (for 10 samples) milk, condensed milk, whey drink (plain/with fruits)... approx. 10 min butter... approx. 60 min cheese... approx. 60 min curd, cream, sour cream, crème fraiche, yoghurt (plain/with fruits), kefir... approx. 45 min baby food (reconstituted)... approx. 30 min serum (bovine, porcine)... approx. 10 min meat (beef, pork, poultry)... approx. 30 min test implementation (incubation time)... 1 h 30 min RIDASCREEN Penicillin 15-10-21 13

Detection limit: (corresponding to the standard substance) milk... approx. 0.2 µg/l condensed milk, cream, whey drink... approx. 0.9 µg/l whey drink with fruits... approx. 1.1 µg/l butter, cheese... approx. 2.1 µg/kg curd, sour cream, crème fraiche... approx. 1.1 µg/kg yoghurt (plain/with fruits), kefir... approx. 1.3 µg/kg baby food (reconstituted)... approx. 0.3 µg/l serum (bovine, porcine)... approx. 0.4 µg/l meat (beef, pork, poultry)... approx. 2.6 µg/kg Recovery rate: milk... approx. 96 % (corresponding condensed milk, cream, whey drink... approx. 127 % to Penicillin G)* whey drink with fruits... approx. 152 % butter, cheese... approx. 115 % curd, sour cream, crème fraiche... approx. 101 % yoghurt (plain / with fruits), kefir... approx. 87 % baby food (reconstituted)... approx. 101 % serum (bovine, porcine)... approx. 141 % meat (beef, pork, poultry)... approx. 104 % * Penicillin G is the antibiotic most commonly used in dairy cows. Consequently, the samples were spiked with penicillin G for determination of recovery. These results were not corrected for the cross-reactivity of the antibody to penicillin G in the buffer or in the respective matrix. The specificity of the RIDASCREEN Penicillin test was determined by analyzing the cross-reactivity to corresponding substances in buffer system. In samples, the specificity may deviate from those determined in the buffer system due to matrix effects. Prior to the analysis of cross-reactive substances, the user has to determine the Limit of Detection and the Recovery for the substance in the respective sample matrix. The test cannot discriminate between analytes and cross-reactive substances. 14 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21

Ampicillin (standard substance)... 100 % Azlocillin... approx. 130 % Penicillin G... approx. 115 % Piperacillin... approx. 91 % Penicillin V... approx. 86 % Amoxicllin... approx. 63 % Cloxacillin... approx. 31 % Oxacillin... approx. 30 % Dicloxacillin... approx. 13 % Nafcillin... approx. 6 % Cephalosporine antibiotics... < 1% In order to increase the quality of assessment when performing ELISAprocedures, we refer additionally to our Good ELISA Practice (GEP) Manual in the respective version. Such lists minimum standards concerning the framework conditions when using test-kits of R-Biopharm AG and performing ELISA-analysis. The manual can be retrieved, printed and downloaded under the website www.r-biopharm.com/products/food-feed-analysis. 1. Intended use RIDASCREEN Penicillin is a competitive enzyme immunoassay for the quantitative analysis of penicillin antibiotics in milk and dairy products (condensed milk, whey drinks, butter, cheese, curd, cream, sour cream, crème fraiche, yoghurt, kefir), baby food, serum (bovine, porcine) and meat (beef, pork, poultry). 2. General β-lactam antibiotics which were named after their characteristic five-membered β-lactam ring and form a large group of antibiotics. They are classified by their chemical structure in several subgroups, whereas the most important ones are the penicillins, cephalosporins and carbapenems. The penicillins were discovered accidentally in 1928 by Alexander Fleming and inhibit cell wall synthesis of gram positive bacteria. Despite their early discovery, they are still the most widely used group of antibiotics worldwide. Especially for mastitis, a bacterial infection of the dairy cow udder, they are the first line treatment. For the reasons of consumer protection and process safety in the dairy industry, in Commission Regulation (EU) No 37/2000 Maximum Residue Limits (MRLs) for 7 penicillins in food of animal origin were established. RIDASCREEN Penicillin 15-10-21 15

3. Test principle The basis of the test is the antigen-antibody reaction. The microtiter wells are coated with capture antibodies directed against anti-ampicillin antibodies. Standards or sample, anti-ampicillin antibodies and ampicillin conjugate are added. Free ampicillin and enzyme conjugated ampicillin compete for the antibody binding sites (competitive enzyme immunoassay). Anti-ampicillin antibodies are bound by the immobilized capture antibodies. Any unbound conjugate is then removed in a washing step. Substrate/chromogen is added to the wells and incubated. Bound conjugate converts the chromogen into a blue product. The addition of the stop solution leads to a color change from blue to yellow. The measurement is made photometrically at 450 nm. The absorption is inversely proportional to the ampicillin concentration in the sample. 4. Reagents provided Each kit contains sufficient materials for 96 measurements (including standard analyses). Each test kit contains: Component Cap color Format Volume Microtiter plate - Ready to use 96 wells Standard Black Lyophilisate 8 ng 3 pcs. Wash buffer White Concentrate 20x 30 ml Conjugate Red Concentrate 100x 0.1 ml Antibody Black Concentrate 100x 0.1 ml Standard/conjugate/ antibody/sample buffer White Concentrate 4x 25 ml Substrate/Chromogen Brown Ready to use 12 ml Stop solution Yellow Ready to use 15 ml 16 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21

5. Materials required but not provided 5.1. Equipment: microtiter plate spectrophotometer (450 nm) vortex graduated pipettes variable 20 µl - 200 µl and 200-1000 µl micropipettes mixer (for cheese and meat samples only) shaker centrifuge 5.2. Reagents: demineralized water 6. Warnings and precautions for the users This test should only be carried out by trained laboratory employees. The instruction for use must be strictly followed. This kit may contain hazardous substances. For hazard notes on the contained substances please refer to the appropriate material safety data sheets (MSDS) for this product, available online at www.r-biopharm.com. 7. Storage instructions Store the kit at 2-8 C (35-46 F). Do not freeze any test kit components. Return any unused microwells to their original foil bag, reseal them together with the desiccant provided and further store at 2-8 C (35-46 F). The substrate/chromogen is light sensitive, therefore, avoid exposure to direct light. No quality guarantee is accepted after the expiration date on the kit label. Do not interchange individual reagents between kits of different lot numbers. 8. Indication of instability or deterioration of reagents any bluish coloration of the red stained substrate/chromogen prior to test implementation a value of less than 0.8 absorbance units (A 450 nm < 0.8) for standard 1 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21 17

9. Preparation of Samples The samples should be stored in a cool place. 9.1. Milk (raw, fresh, UHT) vortex milk sample for 3 s dilute milk 1:2 (1+1) with sample buffer (e.g. 1 ml milk + 1 ml sample buffer) vortex for 3 s use 50 µl per well in the test 9.2 Condensed milk, whey drinks (plain/with fruits) dilute 500 µl of sample 1:10 (1+9) with sample buffer (e.g. 0.2 ml sample + 1.8 ml sample buffer) vortex for 3 s use 50 µl per well in the test 9.3 Butter weigh 5 g of butter into a 50 ml centrifugal vial add 20 ml of demineralized water and incubate at 40 C in a water bath until the butter is melted completely homogenize by vortexing centrifuge: 10 min / 4000 g / 4 C dilute lower aqueous phase 1:4 (1+3) with sample buffer (e.g. 0.5 ml of lower phase + 1.5 ml sample buffer) use 50 µl per well in the test 9.4. Hard and soft cheese add 20 ml of demineralized water to 5 g of cheese sample and homogenize completely in a mixer centrifuge: 10 min / 4000 g / 4 C dilute lower aqueous phase 1:4 (1+3) with sample buffer (e.g. 0.5 ml of lower phase + 1.5 ml sample buffer) use 50 µl per well in the test 18 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21

9.5. Curd, cream, sour cream and crème fraiche, yoghurt (plain/with fruits), kefir add 20 ml of demineralized water to 5 g of sample homogenize by vortexing centrifuge: 10 min / 4000 g / 4 C dilute lower aqueous phase 1:4 (1+3) with sample buffer (e.g. 0.5 ml of lower phase + 1.5 ml sample buffer) use 50 µl per well in the test 9.6. Baby food weigh 1 g of baby food and fill up to 10 ml with demineralized water vortex until the baby food is dissolved completely dilute reconstituted baby food 1:2 (1+1) with sample buffer (e.g. 1 ml reconstituted baby food + 1 ml sample buffer) vortex for 3 s use 50 µl per well in the test 9.7. Serum (bovine, porcine) vortex for 3 s dilute 1:4 (1+3) with sample buffer (e.g. 100 µl serum + 300 µl sample buffer) vortex for 3 s use 50 µl per well in the test 9.8. Meat (beef, pork, poultry) homogenize sample completely add 4 ml of demineralized water to 1 g of homogenized sample vortex and mix for 15 min (upside-down shaker) centrifuge: 10 min / 2000 g / room temperature (20-25 C / 68-77 F) dilute supernatant 1:8 (1+7) with sample buffer (e.g. 50 µl supernatant + 350 µl sample buffer) use 50 µl per well in the test RIDASCREEN Penicillin 15-10-21 19

10. Test implementation 10.1. Preliminary comments Bring all reagents to room temperature (20-25 C / 68-77 F) before use. Eventually occurring precipitates in the concentrates have to be dissolved by shaking at room temperature before dilution. Dilute wash buffer concentrate 1:20 (1+19) with demineralized water (e.g. 2 ml concentrate + 38 ml demineralized water, sufficient for 4 microtiter strips). Diluted buffer can be stored at 2-8 C (35-46 F) until the shelflife of the concentrate expires. Please use the contained buffer concentrate as standard, antibody, conjugate and sample buffer. Dilute buffer 1:4 (1+3) with demineralized water (e.g. 10 ml concentrate + 30 ml demineralized water). Diluted buffer can be stored at 2-8 C (35-46 F) until the shelflife of the concentrate expires. The anti-ampicillin antibody is provided as a concentrate. Since the diluted antibody has a limited stability, only the amount which actually is needed should be reconstituted. Before use, centrifuge the antibody concentrate in the vial shortly (1 min / 1000 g / room temperature (20-25 C / 68-77 F). For reconstitution, the concentrate is diluted 1:100 (1+99) in antibody buffer (e.g. 10 µl antibody concentrate + 990 µl antibody buffer, sufficient for 4 microtiter strips). The ampicillin conjugate is provided as a concentrate. Since the diluted conjugate has a limited stability, only the amount which actually is needed should be reconstituted. Before use, centrifuge the conjugate concentrate in the vial shortly (1 min / 1000 g / room temperature (20-25 C / 68-77 F). For reconstitution, the concentrate is diluted 1:100 (1+99) in conjugate buffer (e.g. 10 µl conjugate concentrate + 990 µl conjugate buffer, sufficient for 4 microtiter strips). 20 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21

The ampicillin standard is provided as lyophilisate. Reconstitute the lyophilisate in 2 ml of standard buffer to obtain standard 7 with a concentration of 4 ng/ml. Prepare standards 2-6 by performing a dilution series as follows: Standard, reconstituted in 2 ml standard buffer -> standard 7 = 4 ng/ml 250 µl of standard 7 + 250 µl of standard buffer -> standard 6 = 2 ng/ml 250 µl of standard 6 + 250 µl of standard buffer -> standard 5 = 1 ng/ml 250 µl of standard 5 + 250 µl of standard buffer -> standard 4 = 0.5 ng/ml 250 µl of standard 4 + 250 µl of standard buffer -> standard 3 = 0.25 ng/ml 250 µl of standard 3 + 250 µl of standard buffer -> standard 2 = 0.125 ng/ml Use standard buffer as standard 1 = 0 ng/ml Aliquot standards and freeze at - 20 C (- 4 F) for up to 1 week. Do not repeat freeze-thawing. 10.2. Test procedure Carefully follow the recommended washing procedure. Do not allow microwells to dry between working steps. 1. Insert a sufficient number of wells into the microwell holder for all standards and samples to be run in duplicate. Record standard and sample positions. 2. Add 50 µl of each standard solution or prepared sample to separate duplicate wells. 3. Add 25 µl of diluted conjugate to each well. 4. Add 25 µl of diluted antibody to each well, mix gently by shaking the plate manually and incubate for 1 h at room temperature (20-25 C / 68-77 F) in the dark. 5. Pour the liquid out of the wells and tap the microwell holder upside down vigorously (three times in a row) against absorbent paper to ensure complete removal of liquid from the wells. Fill all the wells with 300 µl of wash buffer (see 10.1.) and pour out the liquid again. Repeat two more times. 6. Add 100 µl of substrate/chromogen to each well. Mix gently by shaking the plate manually and incubate for 30 min at room temperature (20-25 C / 68-77 F) in the dark. 7. Add 100 µl of the stop solution to each well. Mix gently by shaking the plate manually and measure the absorbance at 450 nm. Read immediately after addition of stop solution. RIDASCREEN Penicillin 15-10-21 21

11. Results A special software, the RIDA SOFT Win / RIDA SOFT Win.net (Art. No. Z9996), is available to evaluate the RIDASCREEN enzyme immunoassays. The course of the standard curve is shown in the Quality Assurance Certificate enclosed in the test kit. Remark for the calculation without software: absorbance standard (or sample) absorbance zero standard x 100 = B/B 0 (%) The zero standard is thus made equal to 100 % and the absorbance values are quoted in percentages. The values calculated for the standards are entered in a system of coordinates on semilogarithmic graph paper against the ampicillin concentration [µg/kg]. In order to obtain the ampicillin concentration in µg/kg (ppb) actually contained in a sample, the concentration read from the standard curve must be further multiplied by the corresponding dilution factor. When working in accordance with the regulation stated, the dilution factor is as follows: milk... 2 condensed milk, whey drinks (with fruits)... 10 butter, cheese, curd, cream, sour cream crème fraîche, plain yoghurt, yoghurt with fruits, kefir... 20 baby food reconstituted... 2 baby food solid... 20 serum (bovine, porcine)... 4 meat (bovine, porcine, poultry)... 40 The product information folder with further information is available on request from your local distributor or R-Biopharm AG. 22 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21

The data corresponds to our present state of technology and provides information on our products and their uses. R-Biopharm makes no warranty of any kind, either expressed or implied, except that the materials from which its products are made are of standard quality. Defective products will be replaced. There is no warranty of merchantability of this product, or of the fitness of the product for any purpose. R-Biopharm shall not be liable for any damages, including special or consequential damage, or expense arising directly or indirectly from the use of this product. R-Biopharm AG Postanschrift / Postal Address: An der neuen Bergstraße 17 64297 Darmstadt, Germany Sitz / Corporate Seat: Pfungstadt Tel.: +49 (0) 61 51-81 02-0 Fax: +49 (0) 61 51-81 02-40 E-mail: info@r-biopharm.de www.r-biopharm.com Vorsitzender des Aufsichtsrats / Chairman of Supervisory Board: Dietrich Mollat Vorstand / Board of Management: Dr. Ralf M. Dreher (Vorsitzender / Chairman), Dr. Carsten Bruns, Jochen Hirsch, Dr. Peter Schubert Handelsregister / Commercial Register: Amtsgericht Darmstadt HRB 8321 RIDASCREEN Penicillin 15-10-21 23