Grundlagen der Zellulären Biochemie

Grundlagen der Zellulären Biochemie Proteinstruktur Vorlesung zum Modul BCB P07 im Bachelor-Studiengang Biochemie Hannover Prof. J. Alves, Institut für Biophysikalische Chemie, MHH

Damit liegen die fünf gezeigten Atome in einer Ebene. Die nominelle Drehbarkeit um die C-N-Einfachbindung ist aufgehoben und die Peptidbindung ist starr. Die Peptidbindung Zwei Aminosäuren können unter Wasserabspaltung eine Amidbindung bilden, die man Peptidbindung nennt: Die Peptidbindung ist resonanzstabilisiert, was der C-N-Bindung einen partiellen Doppelbindungscharakter verleiht. Sie ist kürzer als eine Einfachbindung und länger als eine Doppelbindung:

Konformationsmöglichkeiten an der Peptidbindung Eine Drehbarkeit existiert nur noch um die Einfachbindung von und zum C. Dabei sind viele Konformationen aufgrund sterischer Hinderung nicht möglich.

Ramachandran-Plot Diese Zusammenhänge hat G. N. Ramachandran erkannt und die zugänglichen Winkelpaare in einem Plot dargestellt. Nur knapp ein Viertel aller möglichen Winkelpaare sind für die meisten Aminosäuren zugänglich. für Glycin Eine Ausnahme bilden Glycin, das aufgrund der fehlenden Seitenkette deutlich mehr Konformationen einnehmen kann, und Prolin, das sogar noch weiter eingeschränkt ist. In der Graphik sind auch häufig vorkommende Sekundärstrukturen angegeben, bei denen mehrere Aminosäuren nacheinander ähnliche Winkelpaare haben. Die eingezeichnete linksgängige - Helix ist aber wohl eher eine theoretische Möglichkeit für einzelne Aminosäuren, die in Proteinstrukturen nicht beobachtet wird.

Strukturelle Hierarchie Die Abfolge der Aminosäuren geschrieben immer vom N- zum C-Terminus entsprechend der Richtung der Synthese auf dem Ribosom bildet die Primärstruktur. Unter der Sekundärstruktur wird die erste räumliche Anordnung von Aminosäuren im Raum verstanden, die nur durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Peptidbindungen (N-H---O=C) stabilisiert wird. Die Sekundärstrukturen sind also prinzipiell für alle Aminosäuren zugänglich und damit weitgehend unabhängig von der Sequenz. Eine Ausnahmestellung hat dabei das Prolin, das aufgrund der Rückbindung der Seitenkette auf den Stickstoff kein NH und eine spezielle Konformation hat, die in allen Sekundärstrukturen zu einem Knick am Prolin führt. Die Faltung der Sekundärstrukturen in eine dreidimensionale Proteinstruktur nennt man Tertiärstruktur. Für ihre Stabilisierung sind Interaktionen der Seitenketten der Aminosäuren verantwortlich. Besteht ein Protein aus mehreren Untereinheiten unabhängig synthetisierter Polypeptidketten, hat es eine Quartärstruktur, die die Art und Anordnung dieser Untereinheiten untereinander beschreibt. Auch sie wird durch Interaktionen der Seitenketten der Aminosäuren stabilisiert.

-Helix Die -Helix wurde 1951 von Linus Pauling und Robert Corey aufgrund von Modellbildungen vorgeschlagen und dann von Max Perutz in der ersten Röntgenkristallstruktur eines Proteins, des Keratins der Wolle, experimentell bestätigt. Sie stellt eine rechtsgängige Helix dar mit folgenden Parametern: Anstieg pro Rest: 1.5 Å Reste pro Drehung: 3.6 Anstieg pro Drehung: 3.6 x 1.5 Å = 5.4 Å : -60 und : -45 Die Seitenketten ragen nach außen. Alle Peptidbindungen sind auch durch die H-Brücken untereinander entlang der Helixachse ausgerichtet. Da jede einzelne Peptidbindung ein Dipolmoment hat addieren sich alle auf, sodass eine -Helix eine Teilladung + am N-terminalen und - am C-terminalen Ende hat. Animation

-Faltblatt Parallel zur -Helix wurden 1951 von Linus Pauling und Robert Corey auch zwei mögliche -Faltblattstrukturen vorgeschlagen, die sich in der Ausrichtung interagierender Teilpeptide unterscheiden: parallel antiparallel Die Seitenketten sind alternierend oberhalb und unterhalb des Faltblatts. Darstellungsversuche in einer Ebene, auch wenn sie einen gewellten Eindruck erwecken, geben allerdings nicht wieder, dass jeder Faltblattstrang in sich und gegenüber den anderen Strängen verdreht ist, sodass von der Seite eher der Eindruck einer Rosette entsteht. 90

-Turn bzw. -Bend (Schleifenstrukturen) Die -Helices und -Faltblattstränge sind in den Proteinstrukturen durch Schleifenstrukturen verbunden. Davon sind die -Turns dadurch ausgezeichnet, dass sie durch eine Wasserstoffbrücke zwischen Peptidbindungen stabilisiert sind. Sie sind also valide Sekundärstrukturen. Der Name rührt daher, dass in einem antiparallelen Faltblatt die einzelnen Stränge oft durch solche Schleifen verbunden sind. Die beiden häufigsten Typen unterscheiden sich nur dadurch, dass die Peptidbindung zwischen den beiden mittleren Aminosäuren um 180 verdreht ist. Diese beiden Positionen sind auch sehr häufig von kleinen Aminosäuren besetzt. Glycin oder Prolin besetzen gerne diese Positionen, weil es für sie leicht fällt, an einem geknickten Peptidrückgrad zu stehen. Allerdings entscheiden auch hier wie überall in den Proteinstrukturen die Anforderungen an die Tertiärstruktur mit Kontakten zwischen den Seitenketten darüber, welche Seitenkette an welcher Position gebraucht wird.

Wechselwirkungen zur Stabilisierung der Tertiärstruktur Ein Protein ist ähnlich dicht gepackt wie ein Feststoff. Da wundert es nicht, wenn alle Möglichkeiten genutzt werden, um eine energetisch günstige Annäherung der verschiedenen Seitenketten der Aminosäuren zu ermöglichen. Am wichtigsten sind hierbei die schwachen Wechselwirkungen. Im Inneren eines löslichen Proteins sind das hauptsächlich van der Waals-Wechselwirkungen hydrophober Aminosäureseitenketten. Einige Wasserstoffbrücken kommen hinzu. Ionische Wechselwirkungen spielen eine größere Rolle an der Oberfläche der Proteine, an der sich regelrechte Netzwerke ionaler Kontakte ausbilden können. Allerdings wirken Ladungsinteraktionen über größere Distanzen, sodass sie sich prinzipiell durch ein ganzes Protein auswirken. Disulfidbrücken sind als kovalente Bindungen natürlich starke Wechselwirkungen. Sie spielen aber nur unter oxidativen Bedingungen (extrazellulär) eine Rolle.

Die Proteine sind Zelltyp-spezifisch. Sie werden deshalb auch zum Nachweis von Zelltypen genutzt. In den Epithelien werden die -Keratine (50 Gene im Menschen) exprimiert, die dann auch den Hauptbestandteil von Haaren und Nägeln bilden. Strukturproteine, Beispiel Intermediärfilamente Intermediärfilamente kommen in allen unseren Zellen vor und verleihen ihnen Zugfestigkeit und Flexibilität. Sie sind aus Proteinen mit einer sehr langen -Helix und nicht helikalen Endstrukturen aufgebaut, die sich zu Heterodimeren über eine coiled-coil-wechselwirkung der -Helices zusammenlagern. Dafür sind diese Helices amphipatisch, d.h. sie haben hydrophobe Aminosäuren auf einer Seite (Positionen a und d), über die sie sich kontaktieren können, und mehr hydrophile Aminosäuren an den restlichen Positionen. Da die -Helix 7,2 und nicht genau 7 Aminosäuren pro 2 Windungen hat, windet sich diese hydrophobe Seite langsam um die Helixachse herum. Die ca. 90 Windungen langen -Helices der beiden Monomere müssen sich also mehrfach umeinander winden, um die coiled-coil-wechselwirkung über die ganze Länge aufrecht zu erhalten.

Haare Die Festigkeit der Intermediärfilamente entsteht durch die weitere Aneinanderlagerung der Dimere über antiparallelen Tetrameren zu langen Ketten (Protofilament) von denen viele letztendlich die Filamente bilden. Die Haarzellen sind quasi vollgepackt mit diesen Intermediärfilamenten, in und zwischen denen Disulfidbrücken für eine besondere Stabilisierung sorgen. Eine Reduktion mit Thiolen öffnet diese Bindungen. Verformt man das Haar in diesem Zustand und reoxidiert es anschließend wieder, bleibt es dauerhaft in dieser neuen Form Dauerwelle. Allerdings kann man Haare auch durch feuchte Hitze verformen. Allerdings ist dies nicht so dauerhaft, weil nur die schwachen Wechselwirkungen umorientiert werden.

Strukturproteine, Beispiel -Keratine (Fibroin) Unlösliche Strukturproteine können auch aus -Faltblättern aufgebaut sein. In den Fasern der Seide oder der Spinnweben ist -Keratin (Fibroin) ein Hauptbestandteil. Charakteristisch für das Protein sind viele Wiederholungen der Sequenz GSGAGA, die im Faltblatt für eine Seite mit nur Glycinresten und eine andere mit Alanin- und Serinresten sorgt. Diese Faltblätter werden im Monomer schon aufeinander gestapelt. So bilden sich quasi kristalline Teilstrukturen, die durch Addition weiterer -Keratine noch verstärkt werden. In den Spinndrüsen werden noch weitere Proteine beigemischt, die für mehr Elastizität oder auch für eine starke Klebrigkeit sorgen wie sie bei Spinnennetzen vorteilhaft ist.

Strukturproteine, Beispiel Kollagen In der Extrazellulärmatrix erfüllen Kollagene eine wichtige Funktion, indem sie Zugkräften entgegenwirken. Sie kommen in allen multizellulären Organismen vor und finden sich in allen Geweben. Besondere Stabilität verleihen sie den Sehnen, Knochen und Zähnen. Sie werden charakterisiert durch Sequenzabschnitte mit vielen nicht perfekten Wiederholungen des Tripeptids GPX. Dieses Tripeptid widersteht der Ausbildung typischer Sekundärstrukturen. Dafür können sich drei Stränge, die für sich schon eine langgestreckte Helix bilden (Polyprolinhelix) zu einer rechtsgängigen Tripelhelix anordnen, bei der die Glycine innen liegen und die Proline die Biegung umeinander begünstigen. An der Position X steht häufig auch ein Prolin, das dann oft hydroxyliert wird. Es kann dort auch ein Lysin stehen, das auch hydroxyliert werden kann. Über die Tripelstrangbereiche können sich viele Kollagenmoleküle zu dicken langen Fibrillen aneinander lagern, die durch kovalente Verknüpfung oxidierter Lysinreste zu Riesenmolekülen werden.

Pathobiochemie des Kollagens Aufgrund der großen Vielfalt der Kollagene gibt es auch viele Erkrankungen die auf erblichen Defekten oder Störungen der Kollagenbildung beruhen. Osteogensis imperfekta beruht auf meist dominant vererbten Defekten der Bildung von Kollagen I. Dies hat neben anderen vorwiegend eine große Bruchanfälligkeit der Knochen zu Folge. Die schwerste Form führt zum Tod im Mutterleib oder kurz nach der Geburt. Die meisten Mutationen betreffen den Ersatz eines Glycins durch eine größere Aminosäure. Je nach der Position der Mutation sind die Folgen unterschiedlich stark, da die Tripelhelix meistens bis zur Mutation ausgebildet wird. Das Ehlers-Danlos-Syndrom betrifft Defekte in ganz verschiedenen Kollagenen, die mit einer Überdehnbarkeit der Haut und einer Überstreckbarkeit der Gelenke einhergehen. Die Skorbut wird durch eine Unterversorgung mit Vitamin C verursacht. Dies wird benötigt, um die Enzyme, die Prolinund Lysinreste hydroxylieren, aktiv zu halten. Sie enthalten ein Fe 2+ -Ion im aktiven Zentrum, das durch den benötigten molekularen Sauerstoff zu Fe 3+ oxidiert werden kann. Ascorbinsäure kann dieses wieder reduzieren. Typische Kennzeichen von Skorbut sind Zahnfleischbluten sowie später Zahnausfall, Anfälligkeit gegen Infektionskrankheiten, Erschöpfung, Müdigkeit und schlechte Heilung von Wunden.

Membranproteine -Helices sind sehr gut geeignet, eine Membran zu durchspannen. Sie werden schon cotranslational in die Membran des Endoplasmtischen Retikulums eingebaut. Humaner K + -Kanal TREK-2 Der Membran-durchspannende Teil der Helix besteht dann überwiegend aus unpolaren Aminosäuren. An der Primärsequenz kann man solche Membranhelices oft schon an einer ununterbrochenen Abfolge von 20 25 unpolaren Aminosäuren erkennen. Man findet häufig Proteine mit mehreren Transmembranhelices, die dann zum Beispiel Poren oder Kanäle durch die Membran umschließen können, in denen auch hydrophile Aminosäuren vorkommen. 90 E. coli Porin OmpG Proteine, die die Membran mit -Faltblättern durchspannen, kommen seltener vor. Das beste Beispiel sind Porine, die in den äußeren Membranen gramnegativer Bakterien aber auch der äußeren Mitochondrien- und Plastidenmembran vorkommen. Sie werden posttranslational in die Membran eingebaut. Das Faltblatt hat nur außen zur Membran hin unpolare Aminosäuren.

Oft haben Proteine eine Quartärstruktur. Lösliche Proteine Inzwischen sind die Strukturen von ungefähr 40 000 Proteinen bekannt. Überwiegend sind dies lösliche Proteine. Membranproteine kommen erst in letzter Zeit mehr dazu und viele Strukturproteine entziehen sich vielen Methoden der Aufreinigung und Strukturlösung. Die strukturelle Vielfalt ist sehr groß, auch wenn sie vielleicht doch auf gut 1000 Faltungen begrenzt sein könnte. Das Grundprinzip ist der Aufbau eines dicht gepackten hydrophoben Kernbereichs umgeben von hydrophilen Oberflächenstrukturen.

Proteinfaltung Prinzipiell liegt alle Information für die native Struktur der Proteine in ihrer Primärsequenz. Auf der anderen Seite erscheint es unwahrscheinlich, dass ein Protein allein durch ein gezieltes Diffundieren einzelner Bereiche zu der richtigen Struktur findet, da es doch beliebig viele alternative Anordnungen gibt. Die RNAse A ist ein stabiles, extrazelluläres, 124 As langes Protein mit 4 stabilisierenden Disulfidbrücken. Es lässt sich mit 8 M Harnstoff in Gegenwart von Mercaptoethanol vollständig denaturieren. Nach Dialyse gegen harnstoff-freien Puffer in Gegenwart von O 2 faltet es sich selbständig zur aktiven Struktur mit richtig positionierten Disulfidbrücken. Dabei durchläuft es Zwischenstadien, in denen schon erste Sekundärstrukturelemente ausgebildet sind, aber die korrekte Anordnung zueinander noch fehlt Molten Globule Treibende Kraft ist hauptsächlich der Entzug unpolarer Strukturen aus dem wässrigen in ein inneres hydrophobes Milieu. Solange noch unpolare Oberflächen vorhanden sind, droht eine irreversible Aggregation.

Chaperone Auch wenn alle Information zur richtigen Faltung in der Primärsequenz liegt, schaffen es viele Proteine nicht ohne Hilfe, ihre aktive Konformation zu erreichen. Sie benötigen Hilfe durch Chaperone. Chaperone biegen die Proteine nicht aktiv in eine andere Konformation, sondern verhindern eine Aggrega-tion über freie hydrophobe Oberflä-chen und ermöglichen so dem Pro-tein seine native Faltung zu finden. Sie sind in der Regel ATPasen, die die ATP-Spaltung zur obligaten Änderung der eigenen Konformation zwischen einer stark und schwach an hydrophobe Oberflächen bindenden Form. Die ersten Chaperone binden schon an die naszierende Proteinkette, die aus dem Ribosom herauskommt und reichen das fertig synthetisierte Protein dann oft noch an andere Chaperone weiter. Chaperone gehören zu den Hitzeschockproteinen, weil sie vermehrt gebildet werden, wenn viele Proteine bei erhöhter Temperatur beginnen, ihre Konformation zu verlieren.

Struktur der Chaperonine (HSP60 und HSP10) Am besten ist die Arbeitsweise der Chaperonine verstanden, die in allen Organismen vorkommen und an der Faltung vieler Proteine beteiligt sind. Nach Spaltung der 7 ATP (~ 13 s) dissoziiert GroES wieder ab, die Höhlung wird geöffnet und alle ADP werden auch freigesetzt. Die Struktur von GroEL (bakterielles HSP60) ohne gebundenes ATP zeigt einen Ring aus sieben identischen Untereinheiten, der in der Mitte eine Höhlung hat (unten in rot). Auf den kann nach Bindung von 7 ATP das Heptamer von GroES (HSP10, gelb) als Kappe aufgesetzt werden, wodurch die GroEL- Höhlung noch weiter geöffnet wird (oben in blau). Diese Öffnung wird durch eine Rotationsbewegung der apikalen Domäne (rot) erzeugt. Dadurch werden hydrophobe Aminosäuren von der Innenseite der Höhlung nach oben zum GroES hingedreht. Die Höhlung ist jetzt hydrophil ausgekleidet. hydrophob ATP hydrophil

Arbeitsweise der Chaperonine (HSP60 und HSP10) Die Höhlung ist für noch nicht fertig gefaltete Proteine vorgesehen, die über ihre exponierten hydrophoben Oberflächen an GroEL binden. Wenn ein solches Protein auf der geöffneten Seite gebunden hat, führen ATP- Bindung und GroES-Deckelung dazu, dass es in der Höhlung sich selbst zum Falten überlassen bleibt. Dabei wird es sogar erst noch durch die konzertierte Auseinanderbewegung aller GroEL-Domänen auseinander gezogen, was schon bestehende Faltungen teilweise aufhebt. Die Öffnung und ADP-Abgabe führen zur obligaten Abdissoziation des Proteins. Sollte es noch nicht fertig gefaltet sein, kann es anschließend wieder binden und dere Ablauf wiederholt sich. Die beiden Seiten des großen GroEl-GroES-Komplexes arbeiten Hand in Hand. ATP-Bindung auf einer Seite triggert die Öffnung auf der anderen Seite.

Proteinabbau am Proteasom Schaffen es Proteine nicht, ihre native Struktur zu finden, werden sie dem proteolytischen Abbau zugeführt. An dieser Qualitätskontrolle sind auch Chaperone beteiligt, die solche Proteine an Ubiquitin-Ligasen übergeben. Ubiquitin ist ein ubiquitär vorkommendes, nur 76 Aminosäuren kleines, hochkonserviertes Protein, das an abzubauenden Proteinen zu langen Ketten polymerisiert wird. Dazu wird Ubiquitin erst am C-Terminus aktiviert (E1), dann an ein weiteres Protein weitergereicht (E2), um dann von einem Enzym (E3) auf spezifische Zielproteine übertragen zu werden. An dort schon gebundenes Ubiquitin kann über K48 je ein weiteres Ubiquitin gebunden werden. So wird polyubiquitiniert. So markierte Proteine werden zum Proteasom gebracht, das auch wieder eine heptamere Ringstruktur mit Innenhöhlung hat. Nachdem die Ubiquitine abgespalten wurden, müssen die Proteine entfaltet werden (Chaperone), um hineingefädelt werden zu können. Innen haben drei -Untereinheiten Proteaseaktivität nach sauren, basischen oder hydrophoben Aminosäuren. Die gebildeten Peptide werden freigesetzt.

Amyloid-Krankheiten Amyloid-Krankheiten, bei denen sich Ablagerungen fehlgefalteter Proteine Aggregate von -Faltblattstrukturen bilden, zeigen die Folgen, wenn die Qualitätskontrolle nicht funktioniert. Es bilden sich Faltblattstrukturen, die sich zu langen Fibrillen zusammenlagern. Oft enthalten sie nur Teile der Proteinsequenz. Andere Teile wurden abgespalten. Die Sequenzen in den Fibrillen haben in der nativen Proteinstruktur andere Sekundärstrukturen. Sie wurden also umgefaltet und durch die Aggregation stabilisiert. Amyloid-Ablagerungen im Gehirn führen zum Abbau von Nervenzellen. Bei Alzheimer findet sich das Amyloid- - Protein (40-42 As), das aus dem A -precursor protein abgespalten wird. Die Ablagerungen selbst lösen die Krankheit aus und sind somit infektiös. Anscheinend können die Fibrillen Keime für die Umwandlung der nativen Sequenzen sein. Dies zeigte sich auch bei den Prion-Erkrankungen (Scrapie, BSE, Creutzfeld-Jacob), an denen man sich anstecken kann, wenn man entsprechende Fibrillen mit der Nahrung zu sich nimmt.

Der N-Terminus reguliert die Halbwertszeit eines Proteins Alle Proteine werden mit Methionin als erster Aminosäure synthetisiert, da die InitiatortRNA ein Methionin trägt. Dieses Methionin wird in der Regel schnell abgespalten. Ist die zweite Aminosäure eine geladene oder große hydrophobe Aminosäure, wird das Protein schnell über das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut. Bei den anderen Aminosäuren wird erst N-terminal acetyliert, um den Abbau einzuleiten. G und P kennzeichnen langlebige Proteine. Bei den Bakterien gibt es ein ähnliches System mit anderen Spezifitäten, aber auch hier wird die Lebensdauer der Proteine über die N-terminale Aminosäure mit gesteuert.