PRAKTIKUM ALLGEMEINE BIOTECHNOLOGIE

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1 Praktikum Biotechnologie 8. Übung Blatt 1/6 RWTH Aachen, Lehrstuhl für Biotechnologie, Worringer Weg 1, Aachen PRAKTIKUM ALLGEMEINE BIOTECHNOLOGIE 8. Übung Strukturelle Charakterisierung des Membranproteins FhuA Einleitung Membranproteine mit βbarrel Struktur Zellen oder Organellen umschließende Phospholipidmembranen dienen dem Organismus als schützende Barriere zur Außenwelt. Da jeder Organismus jedoch auf einen gewissen Grad von Kommunikation mit der Außenwelt angewiesen ist (z.b. Stofftransport), findet man in jeder Biomembran verschiedene Membranproteine, welche der Membran aufsitzen (peripher) oder sie durchspannen (integral). Die integralen Membranproteine (auch Transmembranproteine) lassen sich aufgrund ihrer Struktur in zwei Klassen einteilen: 1) Die ubiquitär vorkommenden αhelikalen Transmembranproteine, welche in allen Membrantypen, außer der Außenmembran Gram negativer Bakterien, vorkommen. 2) Die spezialisierteren βbarrel Proteine, welche man in der Außenmembran Gram negativer Bakterien, sowie den Membranen von Mitochondrien und Chloroplasten eukaryotischer Zellen findet. Die Klasse der βbarrel Proteine ist eine besonders interessante Proteinklasse, die sich durch eine gerade Anzahl von nebeneinander liegenden, antiparallel verlaufenden βsträngen auszeichnen, die ein mehr oder weniger breites βfaltblatt bilden, welches sich zu einer Fassstruktur schließt. Die kleinsten βbarrel Proteine besitzen nur 8 Stränge und fungieren als Membrananker, während das bisher größte, bekannte β barrel Protein (PapC aus E. coli) aus 24 Strängen besteht und an der PilusSynthese beteiligt ist. Das βbarrel Strukturelement ist ein sehr stabiles und trotzdem flexibles Strukturelement, obwohl die nebeneinanderliegenden βstränge nur über Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert sind. βbarrel Proteine sind daher besonders resistent gegenüber Hitzeeinwirkung, organische Lösungsmittel oder Säuren. Viele βbarrel Proteine falten sich nach teilweiser Denaturierung spontan in ihre eigentliche Struktur zurück. Außerdem toleriert die βbarrel Struktur sehr weitreichende Mutationen (wie z.b. große Deletionen oder Insertionen), die die Struktur und Funktion anderer Proteine beeinträchtigen würden. Aus diesen Gründen sind Proteine dieser Klasse besonders für die Entwicklung biologischer Nanomaterialien oder als Bausteine für den Bereich der synthetischen Biologie geeignet. Als Protein mit besonderem Potential hat sich das FhuA Protein von Escherichia coli herausgestellt.

2 Praktikum Biotechnologie 8. Übung Blatt 2/6 Ferric Hydroxamate Uptake Component A (FhuA) Das Ferric hydroxamate uptake protein (FhuA) ist ein monomers Protein der äußeren Membran von Escherichia coli. Es besteht aus zwei Domänen und hat ein Molekulargewicht von 78.9 kda (s. Abb. 1). FhuA dient der Eisenaufnahme, wobei es an das Siderophor Ferrichrom gebundenes Eisen transportiert. Die Energie für den Transport wird durch das in der inneren Membran befindliche TonB Protein bereitgestellt. Weiterhin dient es als Rezeptor für verschiedene Bakteriophagen (T5, T1, Φ80) und Antibiotika (Colicin M, Albomycin). Röntgenstrukturanalyse des FhuA Proteins zeigte, dass es über eine COOHterminale βbarrel Domäne (Aminosäuren 161 bis 723) und eine NH 2 terminale i n t e r n e Korkendomäne (Aminosäure 1 bis 160) verfügt. Die βbarrel Domäne besteht aus 22 antiparallelen TransmembranβSträngen, die durch kurze periplasmatische turns und lange externe loops verbunden sind. Die Korkendomäne besteht überwiegend aus einem 4Strängigen βfaltblatt, sowie einer kurzen αhelix. Mit einer Höhe von 68 Å und einem elliptischen Durchmesser von 39 x 46 Å, ist das FhuA Protein eines der größten Proteine der PorinFamilie. D i e FhuA Variant FhuA 1159 wurde mittel genetic engineering entwickelt, wobei die ersten 159 Aminosäuren der Korkendomäne deletiert wurden. Diese Deletion macht aus dem aktiven Eisentransporter einen passive Diffusionskanal. Abbildung 1. Sitz des FhuA Proteins in der äußeren Membran von E. coli und detailliertes CartoonModell (nach Fioroni, Dworeck, RodriguezRopero., 2013). Die βbarrel Domäne ist in gelb dargestellt. Am Institut für Biotechnologie der RWTH, Aachen wird an der Entwicklung verschiedener FhuA basierter Anwendungen geforscht. Zwei Beispiele sind: 1) Nanocontainer Technologie (Polymersome, Synthosome); FhuA mit Kanalfunktion 2) HybridKatalysatoren für enantioselektive Syntheseraktionen; FhuA als Halterung und chirale Umgebung für Übergangsmetallkatalysatoren Beide Anwendungen machen eine Behandlung des Proteins mit organischen Lösungsmitteln und/oder Hitze nötig. Daher ist eine Untersuchung der Effekte dieser Außeneinflüsse auf dieproteinstruktur und Funktion notwendig. Im Rahmen dieses Praktikums soll die Sekundärstruktur des FhuA Proteins mittels Circular Dichroism (CD)

3 Praktikum Biotechnologie 8. Übung Blatt 3/6 Spektroskopie untersucht werden. Hierbei soll zudem der Einfluss verschiedener Temperaturen auf die Sekundärstruktur des Proteins, sowie dessen Rückfaltungsfähigkeit geprüft werden. Circular Dichroism Spektroskopie Der generelle Aufbau eines CD Spektrometers ist in Abbildung 2 gezeigt Abbildung 2. Aufbau eines CDSpektrometers (1= Lampenkühlung, 2 = LampenEnergiequelle, 3 = CD Unit (Monochromator filtert Lich einer definierten Wellenlänge, Polarisator polarisiert das Licht, Modulator moduliert das Licht, es entsteht eine rechts und eine linkspolarisierte zirkulierende Welle, 4 = Probenhalter, 5 = Computer). In zirkulär polarisiertem Licht, hat der Vektor des elektrischen Felds eine konstante Länge, rotiert aber in der LichtAusbreitungsrichtung. Die zirkulär polarisierte Lichtwelle formt also eine dreidimensionale Helix während der Ausbreitung, wobei diese Helix links oder rechtsdrehend sein kann. Optisch aktive Strukturen (z.b. chirale αc Atome der Peptide), die mit zirkulär polarisiertem Licht bestrahlt werden, absorbieren nun die beiden zirkülären Anteile des Lichts (rechts und links) unterschiedlich stark. Da bei der CD Spektroskopie gleiche Anteile des links und rechtszirkülär polarisierten Lichts einer bestimmten Wellenlänge in die Probe eingestrahlt werden, ergibt sich ein Signal nur dann, wenn die Probe chiral (optisch aktiv) ist (eine nicht chirale Probe absorbiert beide Anteile gleich stark, es ergibt sich kein Signal). Bei Peptiden und Proteinen, wird jedes der Sekundärstrukturelemente αhelix, βsheet und random coil durch ein Idealspektrum repräsentiert (siehe Abbildung 3). Ein für ein Protein erhaltenes CD Spektrum (gemessen im Wellenlängenbereich von nm) muss als Summespektrum alles enthaltenen Sekundärstrukturanteile gesehen und dementsprechend interpretiert werden. Zur Auswertung Refeneznproteinen und vergleicht Peptiden, Sekundärstrukturelements zu berechnen. man um mit so Hilfe den spezieller jeweiligen Programme prozentualen mit bekannten Anteil eines

4 Praktikum Biotechnologie 8. Übung Blatt 4/6 Abbildung 3. Ideale CD Spektra der puren Sekundärstrukturelemente αhelical, βsheet und random coil. 2 Versuchsbeschreibung 2.1 Vorversuche (durch Versuchsbetreuer durchgeführt) Für die Expression des FhuA 1159 Proteins wurden E. coli Zellen mit dem zugehörigen Plasmid transformiert. Die Zellen wurden in Flüssigkultur kultiviert und die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG (IsopropylβDthiogalactopyranosid) induziert. Das Protein wurde dann nach Zellernte und Aufschluss mittels Extraktion und differentielle Zentrifugation gewonnen. Die Reinheit des erhaltenen Proteins wurde über SDSPAGE abgeschätzt (siehe Abbildung 4). Dieser Teil des Versuchs wird von den Betreuern durchgeführt, da die Aufreinigung integraler Membraneproteinen nicht trivial ist. Denn Transmembranproteine sind aufgrund ihrer natürlichen Lokalisation in der Lipidmembran äußerst hydrophob und daher nicht wasserlöslich. Sie können nicht wie cytoplasmatische Proteine in das Medium sekretiert werden oder einfach über Chromatographische Verfahren (z.b. Affinitätschromatographie) aufgereinigt werden. Zur Isolation müssen sie zunächst aus der Lipidmembran gelöst werden, dies geschieht meist durch Extraktion mit Detergenzien (amphiphile, Membranlipidähnliche Stoffe). Mittels sequenzieller sehr hochtouriger Ultrazentrifugation werden die in Detergenzienlösung gelösten Membranproteine dann von den übrigen Bestandteilen der Membran getrennt.

5 Praktikum Biotechnologie 8. Übung Blatt 5/6 kda Marker FhuA Abbildung 4. SDSGel des extrahierten FhuA 1159 (61.5 kda) nach Färbung mit Coomassie 2.2 Praktikumsversuche a) Analyse der Sekundärstruktur des FhuA 1159 Proteins Initiierungssequenz des CDSpektrometers: a) Kühleinheit anschalten b) Anschalten des Power supply c) Stickstoffbegasung öffnen(stickstoff wird benötigt, um Sauerstoff im Probenraum und an der Lampe zu entfernen, da O 2 an der Lampe zu O 3 umgesetzt wird, was die Optik des Geräts beschädigen kann) d) Start der CD unit e) Einschalten des Computers Die Software wird während des Experimentes durch die Betreuer erklärt. Probenvorbereitung: Die Quartzküvetten (Abb. 5) müssen zunächst gereinigt (A. dest und Aceton) und getrocknet ( KimWipe Tücher) werden, bevor before 50µL Puffer (als a Blank) in die 0.1 mm Küvette gefüllt werden. Die Küvette wird dann vorsichtig zusammengesetzt und in das Spektrometer gestellt und ein Wellenlängenscan ( nm) wird durchgeführt (eine Messung). Nach Aufnahme der PufferBasislinie wird eine zweite Küvette mit 50µL FhuA 1159Lösung gefüllt, die Konzentration sollte 500µg/mL b e t r a g e n ( e v t l. m i t P u f f e r v e r d ü n n e n ). Erneut wird ein Wellenlängenscan durchgeführt, diesmal wird die Messung dreimal wiederholt. Die Aufnahme der Werte für das unbehandelte Protein erfolgt einmal für alle Gruppen.

6 Praktikum Biotechnologie 8. Übung Blatt 6/6 Beschreiben sie das erhaltene Spektrum und vergleichen Sie es mit den Idealspektren in Abbildung 3. Inwieweit stimmt es mit dem für das Protein FhuA 1159 erwarteten Spektrum überein? Abbildung 5. Quartzküvette für die CDSpektroskopie b) Analyse der Sekundärstruktur des FhuA 1159 Proteins unterschiedlichen Temperaturen und nach erneutem Abkühlen nach Behandlung mit Um den Effekt von erhöhter Temperatur auf die Sekundärstruktur eines βbarrel Proteins zu untersuchen, werden 100µL des Proteins (500µg/mL) in ein 1.5 ml EppendorfReaktionsgefäß gegeben. Das Gefäß wird anschließend im Thermoblock für 20 min bei 60 C bzw. 95 C inkubiert. Unmittelbar nach der Inkubation werden dann je 50 µ l in eine vorher vorbereitete Küvette gegeben und vermessen (wie oben beschrieben). Es ist darauf zu achten, das zwischen Thermoinkubation und Vermessung nicht zuviel Zeit vergeht, in der die Proben bereits wieder abkühlen können. Der Rest der jeweiligen Probe wird 12h lang bei RT stehen gelassen (in dieser Zeit kühlen die Proben ab und wenn möglich faltet sich das Protein teilweise zurück) und anschließend im Spektrometer vermessen. Gruppe 1: 95 C, direkte Messung im Anschluss Gruppe 2: 95 C; Messung nach 12h Gruppe 3: 60 C; direkte Messung im Anschluss Gruppe 4: 60 C; Messung nach 12h Es sollen die Ergebnisse von allen Gruppen gesammelt und ausgewertet werden. Hierbei sollen Sie die Spektren erneut beschreiben und mit den Idealspektren vergleichen. Gehen Sie darauf ein, ob und wenn wie sich die jeweilige Inkubationstemperatur auf die Sekundärstruktur des Proteins auswirkt (Vergleichen Sie also mit dem unter a) aufgenommenen Spektrum für das unbehandelte Protein.). Was geschieht nach längerem Abkühlen der Probe? Erklären Sie die Ergebnisse unter Berücksichtigung der Strukturklasse zu welcher das FhuA 1159 Protein gehört.