Das erste vollständige Proteom Mann, Matthias Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried Abteilung Proteomics und Signaltransduktion (Mann) Korrespondierender Autor E-Mail: mmann@biochem.mpg.de Zusammenfassung Die Gene eines Organismus sind lediglich die Blaupausen für die eigentlichen Funktionsträger der Zelle, die Eiweiße (Proteine). Leider konnte man Proteine bisher nicht in der gleichen Genauigkeit und in der gleichen Tiefe messen wie die DNA. Am Max-Planck-Institut für Biochemie ist es nun zum ersten Mal gelungen, die Gesamtheit der Proteine eines Organismus sein Proteom zu messen. Mögliche Anwendungen reichen von fast allen Gebieten der biologischen Grundlagenforschung bis hin zur Krebsdiagnose. Abstract The genes of an organism are only the blueprint for the real functional entities of the cell the proteins. So far it was unfortunately not possible to analyse proteins with the same accuracy and depth as the genetic material, the DNA. Scientists at the Max-Planck Institute of Biochemistry have now measured the totality of all proteins of an organism its proteome for the fi rst time. Possible applications of this technology include almost all areas of basic biology and may include cancer diagnosis in the future. Die Verarbeitung der Erbinformation In jeder Zelle wird Erbinformation, die in der DNA kodiert und gespeichert ist, in Eiweißmoleküle übersetzt. Die daraus entstehenden Proteine unterscheiden sich voneinander durch die Reihenfolge von 20 verschiedenen Aminosäurebausteinen. Proteine gehören zu den aktiven Molekülen der Zelle, während die DNA lediglich als Informationsspeicher dient. Proteine sind zum Beispiel dafür zuständig, der Zelle Struktur zu geben, Nahrung enzymatisch zu spalten und den Informationsfluss der Zelle zu steuern. Während umfassende DNA-Analysen in der Biologie mittlerweile Routine sind und die komplette Erbanlage vieler Arten und Lebewesen bekannt ist, steckt die ebenso wichtige Gesamtanalyse der Proteine eines Organismus vergleichsweise noch in den Kinderschuhen. Massenspektrometrie als grundlegende Technik der Proteomik Die Massenspektrometrie ermöglicht es, ein Signal von allen Stoffen zu erhalten, die vorher in das Vakuum des Massenspektrometers überführt und ionisiert wurden. Im Jahre 1988 gelang es John Fenn, Proteine mithilfe des von ihm entwickelten Elektrosprays zu verdampfen und zu ionisieren [1], wofür er 2002 den Nobelpreis in Chemie erhielt. Damit schuf er eine der wichtigsten Voraussetzungen für die Proteomik. Abbildung 1 stellt den Arbeitsgang der modernen Proteomik dar.
Tätigkeitsbericht 2009/2010 Mann, Matthias Daserste vollständige Proteom Wir arbeiten intensiv daran, die auf Massenspektrometrie basierte Proteomik leistungsstärker zu machen. So werden beispielsweise Proteine in der Regel mithilfe von Verdauungsenzymen in kurze Proteinbruchstücke verwandelt, die sich dann nachfolgend wesentlich einfacher massenspektrometrisch analysieren lassen. Im vergangenen Jahr entwickelten wurde eine Methode entwickelt, die die Effizienz, mit der Proteine aus Zellen extrahiert und verdaut werden können, stark verbessern konnte ( Filter-aided sample preparation, FASP [2]). Die Massenspektrometer in unserer Abteilung sind sogenannte Orbitraps. Hier umkreisen die Ionen eine Spindel im Hochvakuum, und die gemessene Frequenz ergibt hochaufgelöste und sehr genaue Massenspektren. Im Rahmen von Netzwerken, die von der Europäischen Union gefördert werden, trägt unsere Gruppe zusätzlich zur Weiterentwicklung der Massenspektrometrie bei. Abb. 1: Analysevorgang der modernen Massenspektrometrie bei der Proteom Analyse. Die Gesamtheit der Proteine wird aus Zellen oder Gewebe, zum Beispiel aus Blut, extrahiert. Das Proteom wird nachfolgend mit der FASP-Methode zu Peptiden verdaut. Die Peptide werden mit Flüssigkeitschromatographie aufgetrennt, mit Elektrospray ionisiert und dann mit hochaufl ösender Massenspektrometrie gemessen. Am Ende werden die Ergebnisse mit Datenbanken verglichen, woraus man bereits Erkenntnisse über die Funktion des jeweiligen Proteins erhalten kann. Vergleich biologischer Zustände mit quantitativer Massenspektrometrie Die Identifikation von Proteinen allein ist nicht sehr aussagekräftig erst der quantitative Vergleich erlaubt es, biologisches oder medizinisches Wissen zu gewinnen. Unsere Gruppe hat die bisher genaueste Methode der quantitativen Massenspektrometrie entwickelt, das Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture (SILAC) [3]. Im SILAC-Verfahren wird eine Aminosäure durch eine isotopmarkierte, schwere Variante ersetzt zum Beispiel das normale Lysin durch 13 C 6 -Lysin. Vermischt man nun Extrakte von Zellen, deren Proteine die herkömmliche Aminosäure enthalten, mit Extrakten von solchen Zellen, deren Proteine die schwere Aminosäure enthalten, kann man die Signale ihrer Peptide im Massenspektrum eindeutig zuordnen. Dadurch können mehrere biologische Zustände in einer einzigen Messung mit größtmöglicher Genauigkeit miteinander verglichen werden. Die SILAC-Methode wird ständig weiterentwickelt und inzwischen weltweit in vielen Labors angewendet ( Abb. 2 ). www.mpg.de 2009/2010 Max-Planck-Gesellschaft
Abb. 2: Die SILAC-Methode. Zellen wachsen in Petrischalen entweder mit herkömmlichen oder mit schweren, isotopenmarkierten Aminosäuren. Die Peptide, die aus der Zellkultur A kommen, können somit leicht von denen aus B unterschieden werden. Die relativen Signalhöhen quantifi zieren das Protein im Zustand A gegen-über Zustand B. Das erste Gesamtproteom Die Analyse von vielen Proteinen gleichzeitig ist wesentlich schwieriger als die Analyse von DNA oder RNA. Deshalb galt es auch bis vor kurzem als unmöglich, alle Proteine einer Zelle zu messen. Mithilfe der Technologien unserer Abteilung insbesondere der von Dr. Jürgen Cox entwickelten mathematischen Verfahren, die in die MaxQuant Software einfließen [4], ist es zum ersten Mal gelungen, die Gesamtheit der Proteine eines Lebewesens zu analysieren. Wir verglichen Hefezellen mit einfachem und doppeltem Chromosomensatz (hapliod und diploid) und quantifizierten mehr als 4.000 Proteine [5]. Das US Wissenschaftsjournal Science beschrieb dieses erste Gesamtproteom 12 Jahre nach der DNA-Sequenzierung des ersten Genoms als einen der zehn wissenschaftlichen Durchbrüche des Jahres ( Abb. 3 ).
Tätigkeitsbericht 2009/2010 Mann, Matthias Daserste vollständige Proteom Abb. 3: Das quantifi zierte Proteom der Hefe. Über 4.000 Proteine sind mit ihrem absoluten Signal ( summed peptide intensity, y-achse) und dem Verhältnis ihres Vorkommens zwischen haploider und diploider Hefe (x-achse) dargestellt. Bestimmung von Proteinmodifikationen Zusätzliche Modifikationen von Proteinen können deren Funktion stark beeinflussen. Eines der wichtigsten Anwendungsgebiete der Proteomik ist die Charakterisierung dieser Modifikationen. Wir haben die SILAC-Methode benutzt, um beispielsweise mehr als 6.000 Proteinphosphorylierungen zu quantifizieren, nachdem die Zellen einem Wachstumsfaktor ausgesetzt worden waren [6]. Kürzlich bestimmten wir auch mehr als 20.000 Phosphorylierungsstellen in Krebszellen während des Zellzyklus. Damit konnten wir neue Einblicke in dieses komplexe Regulationssystem gewinnen, das die Teilung der Zelle kontrolliert [7]. Der Zellzyklus spielt unter anderem eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Krebs. Mögliche Anwendungen in der Diagnostik Ein Teil der Abteilung beschäftigt sich auch mit klinischer Proteomik. Hier geht es darum, aus dem Expressionsmuster der Proteine oder aus ihren Modifikationen Vorhersagen über das Entstehen oder den Ablauf von Krankheiten zu gewinnen. Da ein Einsatz der SILAC-Strategie für menschliche Gewebeproben nicht zugänglich ist, wird eine Variante benutzt, in der mehrere markierte Zelllinien zusammengemischt werden und die deshalb Super-SILAC genannt wird. Mit der Super-SILAC- Methode kann effizient das Proteinmuster von Krebsgeweben oder normalen Geweben quantifiziert www.mpg.de 2009/2010 Max-Planck-Gesellschaft
werden, und wir hoffen, dass diese Methode in der Zukunft Anwendung finden wird für die Diagnostik vieler Krankheiten. Ausblick In den nächsten Jahren wird weiter an der Verbesserung der proteomischen Methoden geforscht. In vielen Bereichen, wie Empfindlichkeit, Durchsatz und Genauigkeit, sind noch mindestens Verbesserungen um das Zehnfache möglich. Ein besonderer Fokus wird zudem auf der Untersuchung anderer Proteinmodifikationen, wie der Acetylierung und Glycosilierung, liegen [8]. Wir erwarten, dass die Technologie zukünftig wesentlich breiter eingesetzt wird und sich zu einem wichtigen Eckpfeiler der modernen Biologie, möglicherweise auch der Medizin, entwickelt. Literaturhinweise [1] J. B. Fenn, M. Mann, C. K. Meng, S. F. Wong, C. M. Whitehouse: Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science 246, 64 71 (1989). [2] J. R. Wisniewski, A. Zougman, N. Nagaraj, M. Mann: Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods 6, 359 362 (2009). [3] S. E. Ong, B. Blagoev, I. Kratchmarova, D. B. Kristensen, H. Steen, A. Pandey, M. Mann: Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics 1, 376 386 (2002). [4] J. Cox, M. Mann: MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology 26, 1367 1372 (2008). [5] L. M. de Godoy, J. V. Olsen, J. Cox, M. L. Nielsen, N. C. Hubner, F. Frohlich, T. C. Walther, M. Mann: Comprehensive mass-spectrometry-based proteome quantification of haploid versus diploid yeast. Nature 455, 1251 1254 (2008). [6] V. Olsen, B. Blagoev, F. Gnad, B. Macek, C. Kumar, P. Mortensen, M. Mann: Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell 127, 635 648 (2006). [7] J. V. Olsen, M. Vermeulen, A. Santamaria, C. Kumar, M. L. Miller, L. J. Jensen, F. Gnad, J. Cox, T. S. Jensen, E. A. Nigg, S. Brunak, M. Mann: Quantitative phosphoproteomics reveals widespread full phosphorylation site occupancy during mitosis. Science Signaling 3, ra3 (2010). [8] C. Choudhary, C. Kumar, F. Gnad, M. L. Nielsen, M. Rehman, T. C. Walther, J. V. Olsen, M. Mann: Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science 325, 834 840 (2009).