Identifizierung von Algen mit der MALDI- TOF-Massenspektrometrie

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1 Identifizierung von Algen mit der MALDI- TOF-Massenspektrometrie Dipl. Ing. (FH) Michaela Winzer, M. Sc. oec-troph. Doreen Leske, Elisabeth Müller, Prof. Dr. Christiana Cordes, Prof. Dr. Ingo Schellenberg Hochschule Anhalt (FH), Bernburg; Institute of Bioanalytical Sciences (IBAS), Bernburg; Institute of Molecular Biology (IMB), Bernburg Einleitung Algen sind an unterschiedlichsten Standpunkten der Erde zu finden, an denen ausreichend Licht zur Verfügung steht. Die wirtschaftliche Bedeutung von Makroalgen ist bereits bekannt, denn diese finden schon zahlreich Anwendung z.b. als Emulgatoren oder Dickmittel u.a. in der Nahrungsmittel, Textil- und Farb- sowie der Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie. Die Nutzung von Mikroalgen bietet ebenfalls ein weites Feld. Mikroalgen besitzen eine große und interessante Zahl an Wirkstoffen, die u.a. als antiviral, antioxidativ oder immunstimulierend beschrieben werden [1]. Derzeit werden durch strukturelle, biochemische und genetische Untersuchungen die Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb der Algenpopulationen untersucht und eingeordnet. Diese Untersuchungen sind oftmals zeit- und arbeitsintensiv. Eine einfache und schnelle Identifizierung von Umweltproben (z.b. Algen) gewinnt in der Forschung zunehmend an Bedeutung. Mit der MALDI-TOF- MS-Technik (Matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry) ist eine schnelle und präzise Identifizierung unbekannter Algen möglich. Die Algenproben werden hierbei auf ein MALDI-Target übertragen und mit einer Matrix überschichtet, welche die Ionisierung im MALDI-TOF- Gerät ermöglicht. Die daraus resultierenden Massenspektren, so genannte Protein-Fingerprints, sind charakteristisch für jede Probe. Die Massenspektren werden in einer entsprechenden Auswertesoftware bearbeitet und anschließend gegen Referenzspektren in der SARAMIS-Datenbank (Anagnostec, Postdam/ Golm) verglichen. Da in der Datenbank derzeit noch keine Referenzspektren von Algen zur Verfügung stehen, ist es Aufgabe unserer Arbeitsgruppe Spektren von Algenproben zu erstellen und anschließend mit herkömmlichen Methoden (z.b. Mikroskopie, Sequenzierung) zu bestimmen. Die auf diese Weise identifizierten Proben werden als Referenzspektren in die Datenbank geladen. Durch den Ausbau der Datenbank ist eine schnelle und eindeutige Identifizierung von Algen möglich. Fachhochschule Schmalkalden 1

2 Material und Methoden Die in dieser Arbeit verwendeten Algen wurden von der Arbeitsgruppe Biochemie/ Algenbiotechnologie (Hochschule Anhalt (FH), FB 7, Frau Prof. Griehl) zur Verfügung gestellt. Die Algen wurden in speziellem Algenmedium (Bold s Basal) sowohl in Flüssig- als auch auf Festkultur (Zugabe von 3% Agar-Agar) im Labor angezogen und unter definierten Temperatur- und Lichtbedingungen kultiviert (Abb. 1). Abb.1 Kultivierung der Algenproben am Standort Bernburg Zur Optimierung der DNA-Extraktion aus Algen wurden verschiedene Aufschlussmethoden bezüglich ihrer Eignung, Zeitaufwand und Qualität der isolierten DNA untersucht. Die so isolierte DNA diente als Template für die PCR-Amplifikation. Nach umfangreicher Literaturrecherche konnte ein phytospezifisches Primerpaar in Kombination mit 16SrDNA Universalprimer für die PCR optimiert werden [2]. Die generierten PCR-Fragmente wurden anschließend sequenziert und in der BLAST- Datenbank (Basic Local Alignment Search Tool) analysiert. Die MALDI-TOF Massenspektrometrie wird in der Routineanalytik zur Identifizierung von Peptiden und Proteinen eingesetzt. Als Ergebnis einer Analyse erhält man ein Massenspektrum das für jedes Protein/Peptid individuell ist. Die Identifizierung von Mikroorganismen mit der MALDI-TOF Massenspektrometrie ist eine relativ junge Methodik, die jedoch in zunehmendem Maße, vor allem im medizinischen Bereich in der Routineanalytik eingesetzt wird. Die MALDI-TOF Analysen wurden mit dem Voyager DE Pro (Applied Biosystems, Forster, USA) durchgeführt. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde etwas Probe entnommen und auf das MALDI- Target übertragen und 11. Nachwuchswissenschaftlerkonferenz 14. April

3 mit DHB- Matrix (2,5-Dihydroxy-Benzoesäure) überschichtet. Während des Trocknungsprozesses erfolgt die Co-Kristallisation von Probenmaterial und Matrix. Anschließend wird der Probenteller (Target) in das Voyager DE PRO System eingeschleust und mit Laserenergie beschossen. Die Matrix verdampft dabei explosionsartig und die Analytmoleküle werden in die Gasphase überführt. Bevor die Ionisierten Moleküle zur Analyse in das Vakuum eintreten, werden diese bei einer Spannung von 20 kev beschleunigt (siehe Abb.2). Im Massenanalysator werden die Analytionen entsprechend ihres Masse/Ladungsverhältnisses getrennt. Dabei wird die Flugzeit ermittelt, die ein Ion benötigt um eine definierte Driftstrecke (hier 1,2 m) zu durchfliegen. Molekülionen mit kleinerem Masse/ Ladungsverhältnis durchfliegen den TOF- Analysator schneller als Moleküle mit größerem Masse/Ladungsverhältnis [3]. Abb. 2 Messung der Flugzeit (Time of Flight): Linearer Modus; Quelle: Am Detektor werden die ankommenden Ionen in elektrische Signale umgewandelt und in Form von Massenspektren dargestellt. Unmittelbar werden die erstellten Spektren in der Analysensoftware Data Explorer 4.0 (Applied Biosystems, Forster, USA) mittels Basislinienkorrektur, Peakglättung bearbeitet und die Peaks beschriftet. Anschließend werden die Massenspektren mit Hilfe des Softwareprogramms SARAMIS (AnagnosTec, Postdam/Golm) ausgewertet [4]. Ergebnisse Für die DNA-Extraktion erwies sich der Zellaufschluss mit Glasperlen (d=4,0 mm) und die anschließende DNA-Isolierung mit dem DNeasy Plant Mini Kit als erfolgreich. Nachdem mit entsprechenden Voruntersuchungen die optimale Primerkombination definiert werden konnte wurde die PCR erfolgreich durchgeführt (siehe Abb. 3). Fachhochschule Schmalkalden 3

4 M M Abb. 3 Algen-PCR mit phyto-spezifischem Primerpaar Bande 1 Scenedesmus falcatus, Bande 2 Chlorella vulgaris, Bande 3 Chlorella protothecoides, Bande 4 Desmodesmus costato-granulatus, Bande 5 Eustigmatos vischeri, Bande 6 Mougeotia, Bande 7 unbekannt Bande 8 Coelastrum, Bande 9 Negativkontrolle, Bande M DNA-Marker (1k bp DNA-Ladder, Fermentas) Bei der sich anschließenden Sequenzierung der Algenproben wurden die gewonnenen Sequenzen gegen die BLAST- Datenbank abgeglichen. Die Analysen mit der MALDI-TOF MS Methode zeigen, dass von allen untersuchten Algenproben problemlos Spektren generiert werden konnten (siehe Abb. 4). Allerdings konnte festgestellt werden, dass für die Vermessung der Algen ein Wachstum von fünf Tagen nicht überschritten werden sollte. Wurden die Algen länger kultiviert, konnten keine Spektren mit dem MALDI- TOF Gerät erstellt werden. Grund dafür kann der mit zunehmendem Alter der Zelle ansteigende Chlorophyllgehalt sein. Das Chlorophyll und andere Pigmente können sich bei der Co- Kristallisation von Analyt und Matrix als störend erweisen und den Messvorgang somit hindern. Die untersuchten Algen konnten nicht mittels SARAMIS- Datenbank (AnagnosTec, Potsdam/Golm) identifiziert werden, da keine Referenzspektren von den entsprechenden Algen in der Datenbank vorhanden sind. Mit der SARAMIS- Software konnte eine Clusteranalyse mit den generierten Algenspektren durchgeführt werden. Diese weißt auf eine verwandtschaftliche Beziehung der Grünalgen an. Die Blaualgen (z.b. Nostoc commune) bilden eine eigenes Cluster und heben sich von den Clustern der Grünalgen ab. 11. Nachwuchswissenschaftlerkonferenz 14. April

5 Abb. 4 Beispielspektrum einer Algenvermessung (Chlorella vulgaris) Zusammenfassung und Ausblick Mit der Entwicklung einer Zellaufschlussmethode konnte die Algen- DNA erfolgreich isoliert werden. Mit dem Einsatz eines phyto-spezifischen Primerpaars konnten die Organismen teilweise anhand ihrer Gensequenz bestimmt werden. Die Erstellung von Massenspektren der vorliegenden Algenproben mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie ist problemlos möglich. Eine Identifizierung mit der SARAMIS- Datenbank ist derzeit noch nicht möglich. Die unidentifizierten Algenproben werden in der SARAMIS- Software hinterlegt und gesammelt. Weitere Spektren der jeweiligen Algenproben müssen archiviert und mittels Sequenzanalyse zur Absicherung der Daten bestimmt werden. Sind genügen Daten generiert wurden, können Referenzspektren der Algenproben erstellt und in die Datenbank eingepflegt werden. Sind entsprechende Referenzspektren in der Datenbank vorhanden ist eine schnelle und einfache Methode zur Bestimmung unbekannter Algen möglich. Fachhochschule Schmalkalden 5

6 Literatur [1] Linne von Berg, K.-H., Melkonian, M. (2004). Der Kosmos Algenführer: Die wichtigsten Süßwasseralgen im Mikroskop. Kosmos Verlags, Stuttgart. [2] Stiller, J. W., McClanahan, A. (2005). Phyto-specific 16S rdna PCR primers for recovering algal and plant sequences from mixed samples. Molecular Ecology Notes, 5, 1-3. [3] Hortin, Glen L. (2006) The MALDI-TOF Mass Spectrometric View of the Plasma Proteome and Peptidome. Clinical Chemistry, Vol. 52/7, [4] Anagnostec, Gesellschaft für Analytische Biochemie und Diagnostik mbh, Potsdam/ Golm, am [5] Leske, D. (2009): Identifizierung von Schimmelpilzen und Algen mit der MALDI-TOF Massenspektrometrie. Masterarbeit 11. Nachwuchswissenschaftlerkonferenz 14. April