Diss. ETH No. 14307 Generation and Analysis of the Myelinand Lymphocyte Protein-deficient Mouse A dissertation submitted to the EIDGENOESSISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE (ETH) ZUERICH for the degree of Doctor ofnatural Seiences presented by Annick Bonnet Diplom- Biologin, Universität Basel Born February 16, 1972 in Rheinfelden, Germany Citizen ofgermany Accepted on the recommendation of Prof. Dr. Ulrich Suter, examiner Prof. Dr. Martin Schwab, co-examiner Juli 2001
Zusammenfassung ZUSAMMENFASSUNG Myelin- und Lymphozytenprotein (MAL) ist ein Protein, welches vermutlich in die Klasse der Proteine mit vier transmembranären Domänen gehört. MAL gehört zu einer wachsenden Familie MAL-verwandter Proteine. Diese Familie ist charakterisiert durch eine ca. 40% Identität in der Aminosäuresequenz zwischen den einzelnen Mitgliedern, sowie eine Konsensussequenz, die bei allen Mitglieder zu finden ist und gewisse biochemische Eigenschaften. Die funktionelle Charakterisierung dieser neuen Proteine ist wichtig, um unser Verständnis der strukturellne Erhaltung und des Metabolismus des Nervensystems besser zu verstehen und zu erweitern. Im ersten Teil meiner Doktorarbeit habe ich die Funktion des Myelin- und Lymphozytenproteins MAL untersucht. MAL ist ein kleines hydrophobes Molekül, welches im kompakten Myelin der myelinisierenden Zellen des peripheren und des zentralen Nervensystems vorkommt. Ausserhalb des Nervensystems ist MAL an der apikalen Oberfläche von Epithelzellen exprimiert, die die distalen Tubuli der Nierennephrone, die Schilddrüse und den glandulären Teil des Magens bilden. MAL ist das erste Protein, für das eine direkte Funktion im apikalen Transport in vitro nachgewiesen wurde. Myelinisierende Zellen polarisieren ihre Membranen - analog zu Epithelzellen - in eine den Zellkörper umgebende Membran und die Myelinscheide. Daraus ergab sich die Hypothese, dass die intrazellulären Sortierungs- und Transportmechanismen in beiden Zelltypen ähnlich sein könnten. Um die Funktion von MAL im zellulären Verband in vivo besser zu verstehen, habe ich eine Maus generiert, die gen-defizient ist für MAL. Dabei wurde neben der Deletion des Mal Gens eine lacz Kassette eingefügt, die vom endogenen Mal Promoter kontrolliert wird. Die Analyse der ß-Galaktosidaseexpression in der adulten Mat/- Maus ergab ein Expressionsmuster in verschiedensten Epithelgeweben, woraus man schliessen kann, dass MAL eine generelle Funktion in diesem Zelltyp einnimmt. Während der Entwicklung begann die ß Galaktosidaseexpression im peripheren Nervensystem in unreifen Schwann Zellen, wurde hingegen im Zentralnervensystem niemals vor der Geburt beobachtet. Interesanterweise begann die ß-Galakosidaseexpression schon sehr früh in der metanephrischen Niere. Untersuchungen der MAL defizienten Maus ergaben jedoch keine morphologischen Veränderungen in der Niere. Die Lokalisation apikaler und basolateraler Proteine in den distalen Nierensegmenten war identisch zwischen Wildtyp und Mal defizienten Mäusen. Diese Daten deuten daraufhin, dass MAL entweder in vivo keine Rolle spielt oder seine Abwesenheit kompensiert werden kann. Dies könnte auch I
Zusammenfassung für das periphere Nervensystem zutreffen, indem bisher keine morphologischen Veränderungen festgestellt werden konnten. In den Myelinscheiden des zentralen Nervensystems wurde jedoch eine interessante Beobachtung gemacht: Die kompakten Myelinscheiden enthielten zytoplasmatische Einschlüsse. Nähere Untersuchungen ergaben, dass diese Einschlüsse Oligodendrozytenfortsätze enthielten. Dies könnte möglicherweise durch eine lokale Dekompaktierung der Myelinscheide oder durch die Ausbildung lateraler Einstülpungen entstanden sein. In manchen Fällen korrelierten diese Einschlüsse auch mit einer Aenderung der Spirallisierung der Myelinschichten, was durch eine Doppelmyelinisierung hervorgerufen werden könnte. Diese Daten deuten darauf hin, dass MAL bei der Kompaktierung oder der Spiralrichtung der Myelinscheide und/oder im Erkennungsprozess zwischen Axon und Oligodendrozyt vor und während der Myelinisierung eine Rolle spielt. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit habe ich ein neues Familienmitglied der MAL Familie kloniert. Mit Hilfe von Computerdatenbanken wurde der Teil einer Ratten cdna identifiziert, der homolog ist zu dem menschlischen EST Klon mit der Nummer H09290. Dieser Klon wurde früher schon der MAL Familie zugewiesen. Durch "Screenen" einer cdna Bibliothek aus Rattenhirn wurde die gesamte kodierende cdna identifiziert. Diese cdna kodierte für ein Gen mit einem molekularen Gewicht von 19 kda und wurde MAL-verwandtes Protein (engl. MRP) getauft. Mit Hilfe von Hydrophobizitätsanalysen wurde für MRP eine Struktur mit VIer Transmembrandomänen vorgeschlagen, ähnlich der von MAL. Weitere Untersuchungen bestätigten die Expression von Mrp Transkripten im Rattengehirn und identifizierten neue Expression im Rückenmark, Ischiasnerv und der Niere. Im Gegensatz zu MAL zeigten die Mrp Transkripte ein neuronales Expressionsmuster. Die Daten einer Ueberexpressionanalyse emes GFP-MRP Fusionskonstruktes weisen auf die Lokalisation von MRP entlang des endozytotischen Weges hin. Eine solche Funktion wurde auch schon für MAL beschrieben. In der Zukunft wird es sehr interessant sein zu untersuchen, ob MRP ähnliche Funktionen wie MAL in Neuronen ausübt. II
Summary SUMMARY A few years ago, a new putative tetraspan protein has been identified, the myelin- and lymphocyte protein (MAL) (Alonso and Weissman, 1987). MAL belongs to a growing family ofrelated proteins that is defined on the basis ofan approx. 40% homology within the primary structure, a consensus sequence shared by all family members, and by biochemical features (Magyar et al., 1997; Perez et al., 1997). The functional characterization of these new proteins is important to complete our understanding of structural maintenance and metabolism ofthe nervous system. In the first part of my project I investigated the function of MAL. MAL is a small, hydrophobic protein that is expressed in compact myelin of myelinating cells of the central and peripheral nervous system (Schaeren-Wiemers et al., 1995b). Outside the nervous system it is expressed on the apical membrane of epithelial cells, forming the distal kidney tubules, the thyroid, and the glandular parts of the stomach (Frank et al., 1998). MAL is the first protein that was shown to be involved in apical transport in MDCK and FRT cells in vitro (Cheong et al., 1999; Puertollano et al., 1999a; Martin Belmonte et al., 2000). It was suggested that the transport mechanisms operating in myelinating cells are likely to be related. To elucidate the in vivo function of MAL, a Mal-deficient mouse was generated with the concomitant integration ofan in frame lacz cassette. Analysis of ß-galactosidase expression in adult mice confirmed the endogenous MAL expression and revealed a broad expression of MAL in various epithelial tissues, supporting a general function of MAL in this type of cells. During development, ß galactosidase expression in the peripheral nervous system started in immature Schwann cells prior to differentiation but was not present in the CNS before birth. Interestingly, the embryonie expression of ß-galactosidase started very early in the metanephric development. However, analysis of the Mal-deficient animals did not reveal any morphological abnormalities in the kidney. Moreover, kidney proteins were correctly located at the apical and basolateral surface. These data suggest that MAL might either not be necessary for the suggested function or its absence can be compensated by redundant molecules or mechanisms. The peripheral nervous system ofuat': mice also showed no abnormalities with respect to the morphology. However, the central nervous system displayed an interesting phenotype: The compact myelin sheath was interrupted by the inclusion ofcytoplasmic islands. Closer investigation revealed that the inclusions contained oligodendrocyte processes suggesting either the presence of lateral invaginations or a focal decompaction. Sometimes cytoplasmic inclusions occurred III
Summary together with an alteration in the spiralling direction of the myelin sheaths suggesting a myelination by two separate myelin sheaths. Together these data suggest an involvement of MAL in the compaction process, the spiralling of the myelin sheaths and/or recognition ofaxons during myelination. In the second part of my project I cloned a new member of the the MAL-family. Database search identified parts of a rat cdna similar to a human EST clone, H09290, which had been assigned to the MAL-family (Magyar et al., 1997). Screening of a rat cerebrum cdna library identified a full-iength cdna encoding a small protein with a calculated molecular weight of 19 kda, named MAL-related protein (MRP). Hydrophobicity plots suggested the presence of four transmembrane domains for MRP as for MAL. Further investigation ofthe Mrp transcripts confirmed expression in the rat brain, and identified additional expression in the spinal cord, the sciatic nerve, and the kidney. In contrast to Mal, Mrp transcripts displayaneuronal expression pattern. Overexpression of GFP-MRP fusion proteins revealed a similar subcellular distribution as MAL, suggesting an expression along the endocytic pathway. Thus, MRP might serve functions similar to those ofmal. IV