Moderne Methoden der Lichtmikroskopie Vorwort 11 Verzeichnis der verwendeten Symbole 12 Übersicht über die wichtigsten im Text gegebenen Definitionen 14 1. Grundlagen der mikroskopischen Abbildung 18 1.1 Gaußsche Abbildung oder fehlerfreie Abbildung 18 1.1.1 Abbildungsmaßstab, Winkelverhältnis, Vergrößerung... 19 1.1.2 Das zweistufig zusammengesetzte Mikroskop mit Endlich-Optik. 22 1.1.3 Das dreistufig zusammengesetzte Mikroskop mit Unendlich- Optik 24 1.1.4 Meßgrößen der Öffnung von Mikroskopobjektiven 24 1.1.5 Meßgrößen des Feldes 26 1.1.6 Betrachtungsvergrößerung und Endvergrößerung 26 1.1.7 Die»förderliche Vergrößerung«27 1.2 Die Beugungstheorie der mikroskopischen Abbildung 29 1.2.1 Licht als Wellenbewegung... 30 1.2.1.1 Kohärenz des Lichtes 33 1.2.2 Die AiRYsche Betrachtungsweise der Abbildung von Selbstleuchtern und Nichtselbstleuchtern... 34 1.2.2.1 Selbstleuchter 34 1.2.2.2 Kohärente und partiell kohärente Beleuchtung nichtselbstleuchtender Objekte 38 1.2.2.3 Typische Objektdetails mikroskopischer Objekte bei inkohärenter und partiell kohärenter Beleuchtung 40 1.2.3 Die AßBEsche Betrachtungsweise der Bildentstehung im Mikroskop 47 1.2.3.1 Grenzen der Auflösung eines Amplitudengitters 49 1.2.3.2 Besonderheiten bei der Auflösung eines Verzögerungsgitters... 50 1.2.4 Grenzen des lichtmikroskopischen Auflösungsvermögens und der Erkennbarkeit 52 1.2.5 Steigerung der Leistungsfähigkeit des Lichtmikroskops 52 1.2.6 Schärfentiefe und Schärfentiefeerweiterung der mikroskopischen Abbildung 54 1.3 Abbildungsfehler 58 1.3.1 Monochromatische Abbildungsfehler 58 1.3.1.1 Öffnungsfehler 58 1.3.1.2 Koma 59 1.3.1.3 Astigmatismus 59 1.3.1.4 Bildfeldwölbung 59 1.3.1.5 Verzeichnung (Distorsion)... 60 1.3.2 Chromatische Abbildungsfehler 60 1.3.2.1 Chromatische Längsabweichung (chromatische Längsaberration) 60 1.3.2.2 Farbvergrößerungsfehler. Chromatische Vergrößerungsdifferenz 61 1.3.2.3 Chromatische Variation der monochromatischen Fehler.. 61 1.3.3 Kontrastverluste durch Reflexion 61 2. Optischer und mechanischer Aufbau von Mikroskopen.. 63 2.1 Die optischen Bauteile des Mikroskops 63 2.1.1 Mikroskopobjektive 63 2.1.1.1 Abgleichlänge 63 2.1.1.2 Vergrößerung, Abbildungsmaßstab, numerische Apertur. 64 2.1.1.3 Präparateschutz, Korrektionsfassung 64 2.1.1.4 Objektive für Präparate mit und ohne Deckglas 65 2.1.1.5 Endlich- oder Unendlich- Objektive? 65 http://d-nb.info/881125792
6 Inhalt 2.1.1.6 Kennzeichnung der Objektive. 68 2.1.2 Einteilung der Mikroskopobjektive nach ihrer Korrektion... 68 2.1.2.1 Achromate 68 2.1.2.2 Planachromate 68 2.1.2.3 Fluorite 69 2.1.2.4 Apochromate 69 2.1.2.5 Planapochromate 69 2.1.2.6 Objektive für spezielle Anwendungen 70 2.1.3 Okulare und Projektive 71 2.1.3.1 Anpassungsmaße 71 2.1.3.2 Aufbau von Okularen 71 2.1.3.3 Bildfeldgröße des Okulars und Objektfeldgröße 73 2.1.3.4 Kennzeichnung der Okulare.. 73 2.1.3.5 Projektive 73 2.1.4 Die richtige Objektiv-Okular- Kombination 74 2.1.5 Aufbau von Kondensoren... 75 2.2 Mechanische Bauteile des Mikroskops 77 2.2.1 Das klassische Baukastensystem 77 2.2.1.1 Das Stativ 78 2.2.1.2 Die Beleuchtung 78 2.2.1.3 Der Kondensorträger 78 2.2.1.4 Der Tischträger mit wechselbaren Objekttischen 79 2.2.1.5 Objektivwechseleinrichtungen. 79 2.2.1.6 Der Schrägeinblick (Tubus).. 80 2.2.1.7 Zwischentuben 80 2.2.2 Mikroskope umgekehrter Bauart 81 2.2.2.1 Auflichtmikroskope 81 2.2.2.2 Durchlichtmikroskope 82 2.2.3 Das Baukastensystem der modernen Mikroskope mit Unendlich-Optik 82 3. Lichtquellen und Lichtfilter 84 3.1 Glühlampen 84 3.2 Entladungslampen 84 3.3 Bogenlampen 85 3.4 Lichtfilter 85 3.4.1 Eigenschaften der Lichtfilter.. 85 3.4.2 Einteilung der Lichtfilter... 86 3.4.2.1 Kontrastfilter 87 3.4.2.2 Kompensationsfilter 87 3.4.2.3 Korrektionsfilter 89 3.4.2.4 Selektionsfilter 89 4. Qualitätsmerkmale des Mikroskops 91 4.1 Mechanische Qualitätsmerkmale 91 4.2 Prüfung von Mikroskopobjektiven auf Bildfehler (Restfehler) 92 4.2.1 Testplatten 92 4.2.2 Prüfung auf monochromatische Bildfehler 93 4.2.2.1 Öffnungsfehler 93 4.2.2.2 Komafehler 94 4.2.2.3 Astigmatismus schiefer Bündel 94 4.2.2.4 Bildfeldwölbung 95 4.2.2.5 Verzeichnung 95 4.2.3 Prüfung auf herstellungsbedingte Fehler 95 4.2.3.1 Zentrierfehler 95 4.2.3.2 Spannungsfehler 96 4.2.4 Prüfung auf chromatische Bildfehler 96 4.2.4.1 Chromatische Längsabweichung 96 4.2.4.2 Chromatische Vergrößerungsdifferenz 97 4.2.5 Überprüfung des Auflösungsvermögens von Objektiven... 97 5. Durchlicht-Hellfeldmikroskopie 103 5.1 Das Köhlersche Beleuchtungsverfahren 103 5.1.1 Durchführung des Köhlerschen Beleuchtungsverfahrens 104 5.1.2 Konjugierte Ebenen 106 5.1.3 Fehler beim Köhlerschen Beleuchtungsverfahren 106 5.2 Kritische Beleuchtung 107 5.3 Schräge Hellfeldbeleuchtung. 108 5.4 Helligkeit des Bildes 109 5.5 Wahl der optischen Ausrüstung 110 5.6 Anwendung der Durchlicht- Hellfeldbeleuchtung 112 6. Kontrastmethoden 113 6.1 Methoden der Durchlicht- Dunkelfeldmikroskopie 113 6.1.1 Durchlicht-Dunkelfeldkondensoren 114
Inhalt 7 6.1.2 Die richtige Einstellung des Kardioidkondensors 116 6.1.3 Ultramikroskopie 116 6.1.4 Dunkelfeldmikroskopie gefärbter Präparate 117 6.1.5 Dunkelfeldmikroskopie mit monochromatischem Licht.. 117 6.1.6 Grenzdunkelfeld 117 6.1.7 Leuchtbildmethode 117 6.1.8 Bestimmung von Brechzahlen im Durchlicht-Dunkelfeld... 117 6.1.9 Optische Färbungen 118 6.1.9.1 Rheinbergbeleuchtung 118 6.1.9.2 Dunkelfeldbeleuchtung mit farbigem Licht 119 6.1.9.3 Kontrastfarbenbeleuchtung.. 119 6.1.9.4 Komplementärfarbenmethode 120 6.1.10 Der»3-D-Kondensor«120 6.1.11 Anwendung der Durchlicht- Dunkelfeldmikroskopie 122 6.2 Methoden der Phasenkontrastmikroskopie 122 6.2.1 Das Phasenkontrastverfahren nach ZERNIKE 122 6.2.1.1 Aufbau der Phasenkontrasteinrichtung 123 6.2.1.2 Bildverfälschung durch Haloerscheinungen 125 6.2.2 Einfluß der Phasenringplatte auf den Kontrast. Positiver und negativer Phasenkontrast... 126 6.2.3 Anoptralkontrast 129 6.2.4 Veränderlicher (variabler) Phasenkontrast 130 6.2.5 Stereoskopischer Phasenkontrast 131 6.2.6 Farbiger Phasenkontrast... 134 6.2.7 Phasenkontrast außerhalb des sichtbaren Spektrums 134 6.2.8 Besonderheiten des Phasenkontrastverfahrens. Monochromatisches oder weißes Licht? 135 6.2.9 Erkennbarkeitsgrenze und Auflösungsvermögen beim Phasenkontrastverfahren 135 6.2.10 Anwendung der Phasenkontrastverfahren 137 6.3 Zentrales Dunkelfeld 138 6.4 Amplitudenkontrast nach PLUTA 140 6.5 Modulationskontrast nachhoffman 142 6.6»Dispersion Staining«143 7. Das Schlierenmikroskop. Mikroskopische Schlierenverfahren 145 8. Methoden der Durchlicht- Interferenzmikroskopie.... 147 8.1 Aufgaben der Interferenzmikroskopie 147 8.2 Einteilung der Interferenzmikroskope 147 8.3 Interferenzmikroskopische Methoden 148 8.4 Interferenzanordnungen... 149 8.4.1 Interferenzmikroskope mit nur einem Wollastonprisma im abbildenden Strahlengang... 149 8.4.2 Interferenzmikroskop mit zwei Wollastonprismen im abbildenden Strahlengang. Interferenzmikroskop nach PLUTA 152 8.4.3 Differentieller Interferenzkontrast mit nur einem Nomarski-Prisma im abbildenden Strahlengang. 154 8.4.4 Differentieller Interferenzkontrast nach JAMIN und LEBEDEFF... 154 8.4.5 Interferenzokular nachfrancon 156 8.4.6 Interferenzanordnung nach SMITH 156 8.4.7 Interferenzanordnung nach NOMARSKI 157 8.4.8 Interferenzmikroskop INTERPHAKO nach BEYER und SCHÖPFE 157 8.5 Messung von Gangunterschieden mit dem Interferenzmikroskop 160 8.5.1 Messung im Streifenfeld... 160 8.5.1.1 Eichung des Prismas 160 8.5.1.2 Durchfuhrung der Messung.. 161 8.5.2 Messung im homogenen Feld bei totaler Bildverdoppelung... 161 8.5.2.1 Eichung des Prismas 161 8.5.2.2 Durchführung der Messung.. 163 8.6 Berechnung von Brechzahl und Dicke des Objekts aus dem Gangunterschied 165 8.7 Messung der Doppelbrechung mikroskopischer Objekte.... 167 8.7.1 Messung im Streifenfeld... 167 8.7.2 Messung bei totaler und differentieller Bildaufspaltung im homogenen Feld 169
8 Inhalt 8.8 Messung der Lichtdurchlässigkeit (Transmission) 169 8.9 Bestimmung der Trockenmasse von Zellen 170 8.10 Bestimmung der Brechzahl kleinster Flüssigkeitsmengen.. 173 8.11 Vor- und Nachteile des differentiellen Interferenzkontrastes. Vergleich mit dem Phasenkontrast 175 9. Methoden der Durchlicht- Polarisationsmikroskopie.. 180 9.1 Polarisiertes Licht und Polarisatoren 180 9.2 Aufbau von Polarisationsmikroskopen 181 9.2.1 Orthoskopischer und konoskopischer Strahlengang... 183 9.3 Polarisationsoptische Untersuchungen mit linear polarisiertem Licht 183 9.3.1 Vorbereitung des Mikroskops. 183 9.3.2 Versuche mit dem Polarisationsmikroskop 184 9.3.3 Unterscheidung optisch isotroper und anisotroper Objekte... 187 9.3.4 Bestimmung der Lage der Indexellipse und des relativen Vorzeichens der Doppelbrechung. 188 9.4 Messungen mit dem Polarisationsmikroskop 192 9.4.1 Messung von Winkeln, Längen, Flächen und Dicken 192 9.4.2 Messung von Brechzahlen... 192 9.4.3 Bestimmung der Doppelbrechung 193 9.4.4 Bestimmung von Auslöschungswinkeln (Auslöschungsschiefe) 197 9.4.5 Polarisationsoptische Untersuchungen im indirekten Strahlengang 198 9.4.6 Bestimmung des optischen Charakters im indirekten Strahlengang 198 9.4.7 Messung des Achsenwinkels.. 199 9.4.8 Messungen mit dem Universaldrehtisch 200 9.5 Polarisationsmikroskopie in der Biologie 200 9.5.1 Qualitative Untersuchungen.. 202 9.5.2 Quantitative Untersuchungen. 207 9.5.3 Ursachen der optischen Anisotropie biologischer Objekte.. 207 10. Methoden der Fluoreszenzmikroskopie 210 10.1 Das Fluoreszenzmikroskop.. 211 10.2 Lichtquellen für die Fluoreszenzmikroskopie 212 10.3 Erregerfilter, Sperrfilter, Strahlenteiler 214 10.4 Kombinationsmethoden... 219 10.4.1 Kombination von Dunkelfeld und Fluoreszenz 219 10.4.2 Kombination von Phasenkontrast und Fluoreszenz (simultane Kontrastfluoreszenz) 220 10.4.3 Kombination von Interferenzkontrast und Fluoreszenz... 221 10.4.4 Kombination von polarisiertem Licht und Fluoreszenz 223 11. Methoden der Auflichtmikroskopie 226 11.1 Beleuchtungseinrichtungen für die Auflichtmikroskopie... 226 11.1.1 Auflicht-Hellfeld 226 11.1.2 Auflicht-Phasenkontrast... 230 11.1.3 Auflicht-Dunkelfeld 232 11.1.4 Auflicht-Interferenzmikroskopie 233 11.1.4.1 Auflicht-Interferenzeinrichtungen, bei denen der Vergleichsstrahlengang vom Objekt nicht beeinflußt wird 233 11.1.4.2 Auflicht-Interferenzeinrichtungen, bei denen der Vergleichsstrahlengang vom Objekt beeinflußt wird 234 11.1.5 Auflicht-Polarisationsmikroskopie 235 11.1.5.1 Untersuchungen mit dem Auflicht-Polarisationsmikroskop.. 236 11.1.6 Reflexmikroskopie, Reflexionskontrastmikroskopie und Spiegelreflexmikroskopie - Sonderfälle der Auflichtmikroskopie... 238 12. Mikroskopie mit unsichtbaren Strahlen.... 241 12.1 Infrarotmikroskopie 241 12.2 Ultraviolettmikroskopie 246 12.3 Röntgenmikroskopie... 247
Inhalt 9 13. Methoden der Mikrofotografie und anderer Verfahren zur Wiedergabe mikroskopischer Bilder 248 13.1 Mikrofotografische Einrichtungen 248 13.1.1 Einfache mikrofotografische Geräte 248 13.1.2 Die Aufsetzkamera 251 13.1.3 Variotubus mit positiven und negativen Projektiven 252 13.1.4 Mikrofotografie mit dem Kameramikroskop 253 13.1.5 Belichtungszeitautomatik für die Mikrofotografie 255 13.1.6 Einfluß von Beleuchtung und abbildender Optik auf die Qualität von Mikroaufnahmen 256 13.1.7 Der Elektronenblitz in der Mikrofotografie 257 13.1.8 Die fotografische Technik der Mikrofotografie 260 13.1.8.1 Aufnahmen auf Schwarzweißfilm 260 13.1.8.2 Aufnahmen auf Farbfilm... 265 13.2 Mikrokinematografie 267 13.3 Fernsehmikroskopie 270 13.4 Mikroprojektion 273 13.4.1 Aufprojektion 273 13.4.2 Rückprojektion 274 13.5 Das Zeichnen mikroskopischer Bilder 275 13.5.1 Projektionszeichnen 275 13.5.2 Nachzeichnen des virtuellen Bildes 276. 14. Messen, Zählen und Mengenanalyse mit dem Mikroskop 278 14.1 Längenmessung und Tiefenmessung 278 14.2 Winkelmessung 282 14.3 Flächenmessung 282 14.4 Mengenanalyse 283 14.5 Teilchenzählung 284 14.6 Bestimmung der Korngrößenverteilung 285 14.7 Spezielle Meßeinrichtungen für die Auflichtmikroskopie... 286 14.8 Automatische Bildverarbeitung und Bildanalyse 287 15. Mikroskop-Fotometrie un< ; Mikroskop-Spektralfotometrie 290 15.1 Grundlagen der Durchlichtmikroskop-Fotometrie 290 15.2 Grundlagen der Auflichtmikroskop-Fotometrie 292 15.3 Aufbau des Mikroskop- Fotometers 293 15.4 Aufbau des Mikroskop-Spektralfotometers 294 15.5 Verarbeitung der fotometrischen Meßwerte mit Computern... 296 15.6 Berechnungsgrundlagen mikrofotometrischer Mengenbestimmungen 297 15.7 Anwendungsmöglichkeiten der Mikroskop-Fotometrie und Mikroskop-Spektralfotometrie 298 16. Videotechnik und Lichtmikroskopie, Lasermikroskopie, Laser-Scan-Mikroskopie, neue Wege der Stereomikroskopie und Stereo- Mikrofotografie 301 16.1 Video-Enhanced Contrast Microscopy 301 16.1.1 AVEC-DIC-Microscopy... 301 16.1.2 AVEC-POL-Microscopy... 303 16.2 Schärfentiefeerweiterung durch digitale Bildverarbeitung... 303 16.3 Fluoreszenzmikroskopie mit Restlichtverstärkern und digitaler Bildverarbeitung. Fluoreszenz-Analog- Cytochemie (FAC) 304 16.4 Das Lasermikroskop 305 16.5 Das Laser-Scan-Mikroskop.. 307 16.6 Räumliches Sehen in der Mikroskopie 310 16.6.1 Konstruktionsmerkmale von Stereomikroskopen 311 16.6.2 Stereoskopische Beobachtung mit dem monobjektiven Mikroskop 312 16.6.3 Stereo-Mikrofotografie 315 16.6.4 Räumliche Wiedergabe von Stereobildern 316 16.6.5 Mikroholografie 319
10 Inhalt 17. Mikroskopie unter besonderen Temperatur- und Umweltbedingungen 321 17.1 Heiz-und Kühltische mit erweitertem bis mittlerem Temperaturbereich 321 17.2 Hoch-und Tieftemperaturkammern 321 17.3 Einrichtungen für die Oberflächen-Hoch- und Tieftemperaturmikroskopie 323 17.4 Ferngesteuerte Mikroskope für die Atomforschung 324 Literatur 326 Register 332