Nachweis von BHV-1-Antikörpern aus (Tank)milchproben Martin Beer Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere Insel Riems Friedrich-Löffler-Institute Institut für Virusdiagnostik NRL für BHV-1
Vorschau Warum BHV-1-(Tank-, Sammel-, Pool-)Milchserologie? Geeignete Diagnostika und ihre Verwendung Testmaterial und Poolgrößen Zusammenfassung und Ausblick MB 10.03
BHV-1-Nachweis aus Milch: Wann und warum?
Strategien der BHV-1-Eradikation konventionelles Konzept Marker-Konzept - Serologische Untersuchung auf Vollvirus - oder gb-antikörper - Poolmilch-Screening - Einzelblutproben und epidemiologische Analyse Impfung mit markierten (gedeletierten) Vakzinen + serologische Untersuchung von Einzelblutproben auf markerspezifische Antikörper Diagnostik + Abschaffen seropositiver Tiere keine Vakzinierung (Ausnahmen: Mastbestände, Reagenten) Selektion BHV-1-negativer Betriebe und Tiere Markervakzinierung und Markerdiagnostik Verdrängen von Feldvirus Selektion markernegativer Tiere MB 09.03
Situation in der EU (2) BHV-1-frei BHV-1 durchseucht + Bekämpfung BHV-1 durchseucht MB 09.03
BHV-1-Markervakzine (ge-deletionsvakzine) gc gb IR TR 5 UL US 3 BHV-1-Genom (136kb) Wildtyp ge-minus gg gd gi ge US9 Deletion Rhinobovin -Marker (leb./inakt.) Bovillis IBR GK/D (leb.) Ibraxion (inakt.) Neue Bezeichnung (EU): DIVA-Vakzine (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) Identifizierung von Feldvirus-infizierten Tieren durch den Nachweis von ge-antikörpern = Markerdiagnostik (DIVA-Diagnostik) MB 09.03
Situation in Deutschland (2) T K/M K/M T T K/M T K/M K/M 82% K/M M M M 97% M/K M/K K 88% M = Markerkonzept K = konventionelles Konzept M/K = Kombination, Schwerpunkt M K/M = Kombination, Schwerpunkt K T T T = Tankmilchserologie MB 09.03
BHV-1-Tankmilchserologie ist besonders geeignet für Gebiete mit geringer Herdenprävalenz ohne Markerimpfung (<70%) oder zur Bestimmung der Herdenprävalenz MB 09.03
BHV-1-Milchserologie: Womit testen und wie? MB 10.03
BHV-1-Diagnostik (1) Konventionelle Diagnostik: - indirekte ( Vollvirus ; Komplex ) ELISAs - Glykoprotein B (gb)-blocking ELISAs - Neutralisationstest ( Goldstandard?) Markerdiagnostik: - Glykoprotein E (ge)-blocking ELISAs MB 10.03
Wichtige BHV-1-Antikörper-induzierende Proteine BHV-1 humorale Immunantwort gb gd gc gg ge Antikörper nach 8-10 Tagen nachweisbar neutralisierende Antikörper Antikörper nach 10-14 Tagen nachweisbar neutralisierende Antikörper Antikörper nach 10-14 Tagen nachweisbar Antikörper nach 14-35(?) Tagen nachweisbar Stärke der humoralen Immunantwort MB 11.02
BHV-1-Diagnostik (2) ELISA-Werte in % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0-20 Markerimpfung Testinfektion -30-20 -10 0 10 20 30 Tage nach Testinfektion Impfgruppe: ge-elisa Impfgruppe: gb-elisa Grenze gb-elisa Kontrollgruppe: ge-elisa Kontrollgruppe: gb-elisa Grenze ge-elisa MB 09.03
BHV-1-Diagnostik (3) Hohe Spezifität und Sensitivität der markerunabhängigen Tests: - gb-elisa, indirekter ELISA, Neutralisationstest Unterscheidung markergeimpft oder infiziert: - ge-elisa Seronegative latente Trägertiere können nicht erkannt werden (SNLC) Geringere Spezifität und Sensitivität des ge-elisa (25%- 95%, Frische phänomen, Vakzinephänomen, späte ge-immunantwort bei Impflingen) Bei markergeimpften Tieren keine Alternative zum ge-ak-nachweis MB 10.03
Nationaler BHV-1-Ringtest 2001 Milchproben Probe Herkunft/Art BHV-1-AK BHV-1-gE-AK R26 1:256-Verdünnung Positivserum in Negativpoolmilch ++ ++ R27 1:1024 Verdünnung Positivserum in Negativpoolmilch + + R28 1:4 Verdünnung Positivmilch in Negativpoolmilch ++ - R29 1:16 Verdünnung Positivmilch in Negativpoolmilch + - R30 Negativmilch - - Verschiedene ELISA-Tests zugelassen: - indirekte ELISAs, - gb-blocking-elisas - ge-blocking-elisas Kein Nicht-ELISA Test!
indirekter BHV-1-ELISA "Trachitest" 1st generation, Fa. Dr. Bommeli AG Ringtestmilch 26 27 28 29 30 Charge Lab.-Code % 162-782 BFAV 1 1 1 1 0 100% 0703-872 (Platte) U 1 1 1 0,5 0 80% 1301-782 M 1 1 1 1 0 100% 1427-787 I 1 1 1 0,5 0 80% 142-684 E 1 1 1 1 0 100% 874 (Platte) AA 1 1 1 0,5 0 80% IBR 1123 D MM 1 1 1 0,5 0 80% 142-782 G 1 1 1 1 0 100% 881 (Platte) K 1 1 1 1 0 100% 0205-877 (Platte) O 1 1 1 1 0 100% 782 (Platte) C 1 1 1 1 0 100% 142-782 S 1 1 1 1 0 100% 930 JJ 1 1 1 1 0 100% 142-782 X 1 1 1 1 0 100% 0510-844 D 1 1 1 1 0 100% 0305-880 BB 1 1 1 1 0 100% 142-782 LL 1 1 1 0 0 80% R 1 0,5 0 0 0 20% 2081-865 HH 1 1 1 1 0 100% 0305-880 V 1 1 1 1 0 100% 142-782 W 1 1 1 1 0 100% 0205-877 Z 1 1 1 0,5 0 80% 0205-877 Z 1 1 1 0 0 80% 0703-872 (Platte) N 1 1 1 0,5 0 80% 142-787 J 1 1 1 1 0 100% Probenstatus 1 1 1 1 0 90% - 90 % richtig bewertet (Mittelwert) - 16x 100% richtig bewertet
Milchproben:gB-blocking-ELISA BHV-1-gB-blocking -ELISA Fa. IDEXX Ringtestmilch 26 27 28 29 30 Charge Lab.-Code % 40262-1357 /-1134BFAV 1 1 1 1 0 100% 40262-1134 U 1 1 1 0,5 0 80% 40262-1357 KK 1 1 1 1 0 100% 40262-1134 M 1 1 1 0,5 0 80% 40262-1019 Q 1 0 1 0 0 60% 40262-1134 Y 1 1 1 1 0 100% 40262-1357 AA 1 1 1 1 0 100% 40262-1357 W 1 1 1 0,5/0 0 80% 40262-1231 II 1 1 1 1 0 100% 40262-1231 X 1 1 1 1 0 100% 40256-1328 L 1 1 1 0 0 80% P 1 1 1 1 0 100% D 1 1 1 1 0 100% 40262-1357 F 1 0,5 1 0 0 60% 40262-1357 N 1 0,5 1 0 0 60% Probenstatus 1 1 1 1 0 87% - 87 % richtig bewertet
BHV-1-gE-blocking -ELISA Fa. IDEXX Milchproben:gE-blocking-ELISA Ringtestmilch 26 27 28 29 30 Charge Lab.-Code 09537-710 CU BFAV 1 1 0 1 0 80% 09537-620 FU U 1 0 0 0,5 0 40% 09537-710 CU KK 1 0 0 0 0 40% 09537-710 CU CC 1 0 0 0 0 40% 09537-076 HAT Q 0 0 0 0 0 20% 710 CU Y 1 0 0 0 0 40% 09537-710 CU E 1 0 0 0 0 40% 09537-331 AU I 1 0 0 0 0 40% 09537-706 CT II 1 0 0 0 0 40% 05131-647 CU O 1 1 1 1 0 100% 09537-331 AU C 1 0 0 0 0 40% 09537-710 CU S 1 1 1 1 0 100% 05133-110 MT JJ 1 0 0 0 0 40% 04-01952-02 X 1 0 0 0 0 40% D 1 0 0 0 0 40% 09537-620 FU R 1 0 1 0 0 60% 09538-470 FU F 1 0 0 0 0 40% 09537-710 CU N 1 0 0 0 0 40% 09537-331 AU J 0 0 0 0 0 20% Probenstatus 1 1 0 0 0 47% - 47 % richtig bewertet
EU-Ringtest 2001: Milchproben Table 4. Overall results of milk tests different tests used per type number of labs overall sens. n = 4 gb-spec. ELISA n = 8 0.81 (26/32) n = 7 indirect ELISA n = 7 0.98 (39/40) n = 3 ge-spec. ELISA n = 5 0.58 (7/12) overall spec. 0.83 (20/24) 0.93 (28/30) 0.88 (14/16) range of highest pos. dilution (average, log2) 3.0 3.5 3.0 repeatab. 92.3% (96/104) 95.4% (124/130) 96.2% (50/52)
Indirekte BHV-1-Antikörper-ELISAs besitzen beste Eignung für BHV-1- Milchserologie
Gesetzliche Vorgaben und Probenmaterial
Gesetzliche Vorgaben in Deutschland esetzgebung: 1986: Leitlinien für den Schutz von Rinderbeständen vor IBR/IPV 1997: BHV-1-Infektion als anzeigepflichtige Tierseuche 1997: Verordnung zum Schutz der Rinder vor einer Infektion mit dem Bovinen Herpesvirus Typ 1 2001: Erste Verordnung zur Änderung der BHV-1-Verordnung 2003: Zweite Verordnung zur Änderung der BHV-1-Verordnung?
BHV-1-VO vom Februar 2002: Milchserologie (1) 2a Untersuchungen (1) Der Besitzer hat, soweit sein Rinderbestand nicht bereits nach 1 Abs. 2 Nr. 1 BHV1-frei ist, alle Zucht- und Nutzrinder im Alter von über neun Monaten im Abstand von längstens zwölf Monaten nach näherer Anweisung der zuständigen Behörde, 1. sofern die Rinder des Bestandes nicht gegen eine BHV1-Infektion geimpft worden sind, blutoder milchserologisch auf Antikörper gegen das Virus der BHV1-Infektion, 2. sofern die Rinder des Bestandes mit Impfstoffen nach 2 Abs. 1 Nr. 1 geimpft worden sind, blutserologisch auf Antikörper gegen das ge-glykoprotein des Virus der BHV1-Infektion untersuchen zu lassen. Satz 1 gilt nicht für Reagenten. Die zuständige Behörde kann im Einzelfall Ausnahmen von Satz 1 zulassen, wenn unter Berücksichtigung des seuchenhygienischen Risikos des Bestandes und der Seuchensituation ihres Zuständigkeitsgebietes Belange der Seuchenbekämpfung nicht entgegenstehen und die Rinder des Bestandes regelmäßig entsprechend den Empfehlungen des Impfstoffherstellers geimpft werden. (2) Die zuständige Behörde kann, soweit es aus Gründen der Seuchenbekämpfung erforderlich ist, die Untersuchung aller Rinder eines Bestandes oder ihres Zuständigkeitsgebietes einschließlich der Entnahme von Blutproben anordnen.
BHV-1-VO vom Februar 2002: Milchserologie (2) Anlage 1, Abschnitt I und II: MB 10.03
Probenmaterial: Einzelmilch, Poolmilch, Sammelmilch nativ - konzentriert BHV-1-VO: 1. Einzelmilch 2. Pool von bis zu 5 Einzelmilchen 3. Sammelmilch (> 30% laktierende Kühe im Betrieb) von bis zu 50 Kühen Zugelassene ELISAs: 1. Einzelmilch (nativ) 2. Sammelmilch bis? Tiere (nativ) 3. Sammelmilch bis 50 Tiere (Konzentrat) Problem: Grenzwerte und Validierung
Zusammenfassung (Tank)milchserologie ist ein wichtiges und kostengünstiges Diagnostikum für die BHV-1-Bekämpfung (Prävalenz!) Indirekte ELISAs Mittel der Wahl Gesetzliche Bestimmungen und Testvalidierung/-zulassung müssen besser aufeinander abgestimmt werden (Nativmilch, Milchkonzentrat, Einzel- oder Poolmilch) Referenzmilch (NRL für BHV-1, R-Panel) Zukünftige Entwicklungen: - Milchtest für ge-antikörper-nachweis - neue Konzentrierungsverfahren