Nutzpflanzenpraktikum

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1 Nutzpflanzenpraktikum Biologielehre Kurs 4 Materialien Folien Vorlesung Grüne Gentechnik. Evolution der Nutzpflanzen. Globalisierung botanik.kit.edu/botzell/949.php Erstellung von Evolutionären Stammbäumen botanik.kit.edu/botzell/947.php Bachelor Biologie Angewandte Biologie Bachelor Lebensmittelchemie Grüne Gentechnik, Evolution Nutzpflanzen Kursprogramm 1. Worum geht es bei der Antimatsch-Tomate 2. Pflanzliche Zellkultur: Tabaklinie VBI-0 (nur Angewandte Biologie / LCH: Demo) 3. Aufbau eines Getreidekeimlings (Reis versus Weedy Red Rice) 4. Lichtkeimung von Salatachänen (Demo) 5. Vergleich Blattformen der Europäischen Wildrebe (5A Angewandte Biologie) / Botanische Lebensmittelanalyse: Authentifizierung von eingelegten Weinblättern der Kulturrebe (5B LCH) 1. Worum geht es bei der Antimatsch-Tomate? Chromoplastenhaltiges Parenchym aus dem Fruchtfleisch (Perikarp) der unreifer und reifer Tomaten (Solanum lycopersicum Solanaceae). Querschnitt, Detailzeichnung. Bei der Reifung wird das Enzym Polygalacturonidase (PG) aktiviert. Dieses Enzym verdaut Pectine. Dadurch löst sich die Mittellamelle auf und die Zellen des Perikarps weichen auseinander. Die Tomate wird matschig. Der biologische Sinn: die Samen im Innern (die Tomate ist eine Beere), werden so freigesetzt. Pflück- und Verpackungsmaschinen können mit matschigen Tomaten nicht gut umgehen. Daher versuchte man, über gentechnische Veränderung die Polygalacturonidase abzuschalten. Was ist zu sehen? Das Perikarp besteht aus stark vakuolisierten parenchymatischen Zellen (Grundgewebe). Im unreifen Zustand sind in der Zellperipherie grüne Chloroplasten zu erkennen. Im reifen Zustand haben sich die Chloroplasten vollständig in Chromoplasten umgewandelt, die orange bis rot erscheinen, weil sie viel Carotinoide (vor allem Lycopin) akkumuliert haben. Beim Reifen wird das Enzym Polygalacturonidase induziert, das nun die Mittellamelle auflöst. Dadurch runden sich die Zellen etwas ab, rücken auseinander und die Zellwände erscheinen faltig im lichtmikroskopischen Bild (Zellwände sind so dünn, dass sie durch die Präparation kollabieren). Die entstehenden Interzellularen sind dafür verantwortlich, dass das Gewebe lockerer wird. Dieses "Matschigwerden" hat den biologischen Sinn, die Samen im Innern der Tomatenbeere freizusetzen, ist aber für Transport und Verkauf der Tomaten von Nachteil. Bei der Antimatschtomate wird daher die Produktion der Polygalacturonidase unterdrückt, so dass das Perikarp länger fest bleibt. Dadurch können die Tomaten länger auf der Pflanze belassen werden, wodurch die Bildung von Carotinoiden und Aromastoffen weiter fortschreiten kann. Durch neuartige Erntetechniken (sogenannte Strauchtomaten) wird jedoch dasselbe erreicht, so dass die Antimatschtomate nur noch gelegentlich in USA und Großbritannien im Handel zu finden ist.

2 2. Pflanzliche Zellkultur Kalluszellen aus Markparenchym von Tabak (Nicotiana tabacum, cv. 'Virginia Bright Italia (VBI-0)' - Solanaceae). Übersichtszeichnung eines Zellfadens, Detailzeichnung Vierzelliger Zellfaden der Tabak-Zell-Linie VBI-0. Man erkennt deutlich eine Richtung (Polarität) des Fadens. Die beiden Polzellen unterscheiden sich. Der Faden verhält sich als Ganzes, die Zellen synchronisieren ihre Teilung über einen gerichteten Transport des Pflanzenhormons Auxin. Wir untersuchen an diesen Zellen, wie sich aus Zellen von selbst ein Organismus bildet. Durchführung: Tabakgewebe ist sehr regenerationsfreudig - wenn man Gewebsstückchen auf Agarplatten bringt, die das Pflanzenhormon Auxin und Zucker als Kohlenstoffquelle enthalten, entsteht leicht und schnell ein sogenannter Kallus. Das sind weitgehend differenzierte Zellen, die sich intensiv teilen. Wenn man solche Kalli mit Cytokininen behandelt, regenerieren zahlreiche kleine Pflänzchen (sogenannte somatische Embryogenese). Aufgrund seiner Regenerationsfreudigkeit war Tabak die erste Pflanze, die gentechnisch verändert werden konnte. Dazu wird einfach Kallus mit Agrobacterium tumefaciens kokultiviert, dem vorher das Gen von Interesse in die T-DNS eingesetzt wurde. Bei der Zellkultur muss steril gearbeitet werden (warum wohl?). Die im Kurs benutzten Kallusplatten werden hinterher aber ohnehin verworfen, können also unter unsterilen Bedingungen geöffnet werden. Man entnimmt eine Spatelspitze Kallus und verrührt ihn vorsichtig mit Kulturmedium (Murashige-Skoog oder MS-Medium, eine mineralische Mischung, die alles enthält, was eine Pflanzenzelle zum Leben braucht). Wenn die Zellfäden zu dicht sind, muss die Suspension mit mehr Medium vermischt werden, so dass nicht zu viele Zellfäden übereinander liegen. Zunächst wird von einem einzelnen, freiliegenden Zellfaden eine Übersichtszeichnung angefertigt und dann eine einzelne Zelle gezeichnet. Durch Schliessen der Kondensorblende treten die Cytoplasmafäden zutage, an denen der Zellkern im Innern der Vacuole aufgehängt ist. Was ist zu sehen? Der Kallus besteht aus einem Gewirr von mehrzelligen Fäden, die Teilung und das Wachstum der Zellen erfolgt genau in einer Achse, die, wie wir inzwischen wissen, durch einen Fluss des Pflanzenhormons Auxin ausgerichtet wird. Die Zellen "erinnern" sich an ihren Ursprung und durchlaufen ein einfaches Entwicklungsprogramm wie es bei der Differenzierung von Markparenchym zu Leitbündelgewebe stattfindet. Im Detail sieht man, dass der Zellkern vom Rand in die Mitte gerückt ist. Zahlreiche Cytoplasmastränge scheinen den Zellkern an dieser Position zu verankern. Das Innere ist jedoch weitgehend durch die Vacuole ausgefüllt, die Cytoplasmastränge durchziehen die Vacuole tunnelartig und müssen aktiv durch Energieerzeugung gegen den Vacuolendruck aufrechterhalten werden - hierfür ist das pflanzliche Cytoskelett (Mikrotubuli und Actinfilamente) verantwortlich, dass die Struktur der Cytoplasmastränge aufrechterhält. Die Zellen eines Fadens erscheinen auf den ersten Blick als unabhängige und autonome Einheiten. In der Tat bilden sie jedoch einen einfachen Organismus - dies zeigt sich, wenn man eine Häufigkeitsverteilung der Zellzahl pro Faden erstellt. Dabei wird eine wellenartige Verteilung sichtbar - geradzahlige Fäden sind häufiger als ungeradzahlige. Diese "Wellen" zeigen, dass die Zellteilung innerhalb eines Fadens synchronisiert wird.

3 3. Aufbau eines Getreidekeimlings Aufbau von gekeimten Karyopsen vom Reis (Oryza sativa ssp. japonica) und Weedy Red Rice (Oryza spec.) - Poaceae. Übersichtszeichnung. Durchführung: Die Karyopsen werden für eine Woche auf schwimmenden Schaumstoffnetzchen (Reis ist eine Sumpfpflanze) auf Wasser im Dunkeln bei 25 C angezogen. Die Koleoptile ist ein Jugendorgan, dessen Aufgabe darin besteht, die jungen und empfindlichen Blätter sicher durchs Erdreich an die Oberfläche zu geleiten.beim Kontakt mit dem Sonnenlicht stellt die Koleoptile ihr Wachstum ein und reisst entlang einer vorgefertigten Naht auf, so dass die Primärblätter sich entfalten können. Gleichzeitig wachsen aus dem Knoten in horizontaler Richtung die Kronwurzeln aus, die das spätere Wurzelsystem bilden. Ebenso wie die Blätter ist die Keimwurzel von einer Hülle, der Koleorhiza umgeben. Was ist zu sehen? Die Koleoptile ist nun fast vollständig elongiert und bei manchen Keimlingen schon geöffnet, so dass die Primärblätter austreten können. Am Knoten sind bei einigen Keimlingen (vor allem bei denen, wo die Öffnung der Koleoptile schon sehr fortgeschritten ist) die seitlich auswachsenden Kronwurzeln zu sehen. Diese bilden später das gesamte Wurzelsystem aus, da die Primärwurzel später verkümmert. Der Teil des Sprosses unterhalb des Knotens heisst Mesokotyl. Beim Rundkornreis (ssp. japonica) bleibt es kurz, während es beim Langkornreis (ssp. indica) sich in die Länge streckt, wenn sich der Keimling im Dunkeln entwickelt (im Licht bleibt es bei beiden Unterarten vom Reis kurz). Dieser Grundaufbau ist bei allen Getreiden erhalten, wobei sich die Dimensionen der einzelnen Keimlingsorgane unterscheiden. Beim Weedy Red Rice ist zum Beispiel das Mesokotyl verlängert, was damit zusammenhängt, dass dieser Kulturparasit den Kulturreis überwuchern kann. 4. Lichtkeimung von Salatachänen Gekeimte Achaenen des Kopfsalats (Lactuca sativa Asteraceae). Demonstration der Lichtkeimung Durchführung. Die Achaenen werden auf feuchtem Filterpapier ausgesät und über Nacht bei 25 C inkubiert. Eine Probe wird im Dunkeln gehalten, eine zweite wird am nächsten Morgen 10 min mit starkem Rotlicht bestrahlt, eine dritte Probe wird mit 10 min Rotlicht, gefolgt von 10 min Dunkelrot behandelt. Das Ergebnis wird 3-4 Tage später ausgewertet. Achtung: Dunkel bedeutet hier photobiologisches Dunkel - selbst Spuren von Licht können das Phytochromsystem induzieren. Die kuriose R/DR Schaltbarkeit der Keimung von Salat führte zur Entdeckung des Phytochromsystems Was ist zu sehen? Im Dunkeln ist die Keimung stark gehemmt - Salat ist ein Lichtkeimer und hat hier eine Wildpflanzeneigenschaft beibehalten. Durch Rotlicht wird die Dormanz gebrochen (Anregung des Phytochromsystems). Bei nachfolgender Dunkelrotbestrahlung wird das Phytochrom jedoch von der aktiven Pfr-Form in die inaktive Pr-Form zurück"geschossen", so dass die Achänen von der Belichtung "nichts mitbekommen" und dann, wie im Dunkeln, nicht keimen. Dieses klassische Experiment demonstrierte übrigens diese seltsame Eigenschaft des Phytochroms und war letztlich dafür verantwortlich, dass man dadurch Phytochrom als ersten pflanzlichen Photorezeptor isolieren und identifizieren konnte.

4 5A. Diversität von Wildformen (Angewandte Biologie) Blätter von Kultur- und Wildreben (Vitis vinifera Vitaceae). Übersichtszeichnung von Blättern Die Wildrebensammlung im Botanischen Garten wurde zunächst zum Artenschutz (exsitu Erhaltung der fast ausgestorbenen Wildrebe) angelegt. Inzwischen ist sie zu einer wichtigen genetischen Resource geworden. Gerade auch morphologische und strukturelle Unterschiede der Blätter sind für die Resistenz gegenüber Pathogenen sehr wichtig. Hintergrund. Die Europäische Wildrebe (Vitis vinifera ssp. silvestris) ist die Stamm-Mutter der Kulturrebe (Vitis vinifera ssp. vinifera) und fast ausgestorben. In einem vom BMVEL geförderten Projekt wird die letzte zusammenhängende Wildpopulation auf der Halbinsel Ketsch in-situ im Botanischen Garten des KIT erhalten. Bei der Untersuchung dieser Population zeigten sich starke Resistenzen gegenüber Pathogenen der Weinrebe. Diese Pathogene wurden im 19. Jahrhundert aus Nordamerika eingeschleppt und treffen in Europa also auf einen "naiven Wirt", der sich nicht wehren kann. Die Folgen waren verheerend - in Baden brach der Weinbau in den 1880ern komplett zusammen, was zu einer Massenauswanderung nach USA führte - die Bevölkerung sank um ein Drittel ab! Der Grund, warum die Europäische Wildrebe, die ja ebenfalls ein "naiver Wirt" sein sollte, resistent ist, ist noch unklar - es gibt Hinweise auf Veränderungen in Blattbau und -oberfläche, z.b. zusätzliche Cuticularleisten in den Spaltöffnungen, die hierfür eine Rolle spielen könnten. Im Experiment geht es zunächst einmal darum, Unterschiede in der Morphologie zu betrachten und festzustellen. Durchführung: Blätter von verschiedenen Kultursorten (z.b. 'Müller- Thurgau'), Europäischen Wildreben aus Ketsch und von als Unterlagssorten im Weinbau eingesetzten amerikanischen Wildreben (z.b. Vitis rupestris oder Vitis riparia) werden gezeichnet. Im Zentrum stehen Form, Blattaderung, Färbung (im Herbst findet man bei Vitis vinifera eine ausgeprägte Bildung von Anthocyanen) und Oberfläche (z.b. Haare, Wachs). Können Sie Kultur- und Wildrebe unterscheiden? Wie unterschiedlich sind die Blätter eines Genotyps untereinander? 5A. Diversität von Wildformen (Lebensmittelchemie) Lebensmittelanalyse: Authentifizierung von eingelegten Weinblättern der Kulturrebe (Vitis vinifera Vitaceae) anhand von morphologischen Merkmalen. Übersichtszeichnung von Blättern Ausdifferenziertes Blatt einer Kulturrebe (Vitis vinifera - Vitaceae), Frischpräparat, Übersichtszeichnung Durchführung: Beschreiben und beschriften Sie in Ihrer Zeichnung die morphologischen Merkmale der Blattspreite mittels der vorliegenden Bestimmungsliteratur (D. Aichele, Die Blütenpflanzen Mitteleuropas Band 1, Franckh-Kosmos Verlag), d.h. die Blattform, das Aussehen des Blattrandes, der Verlauf der Hauptleitbündel (= Blattnerven) und die Farbe der Blattober- und Blattunterseite. Nun vergleichen Sie die für Blätter der Kulturrebe (Vitis vinifera - Vitaceae) charakteristischen morphologischen Merkmale mit den Blättern des Handelsprodukts. Können Sie anhand der morphologischen Merkmale nachweisen, dass das Handelsprodukt Blätter von Vitis vinifera als Zutat enthält?

5 Zur Nachbereitung Weiler, E., Nover, L. Allgemeine und molekulare Botanik, Thieme, Kapitel 17