Ein neues stärke-relevantes Enzym in Arabidopsis thaliana: Die Phosphoglukan-Wasser-Dikinase

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1 Ein neues stärke-relevantes Enzym in Arabidopsis thaliana: Die Phosphoglukan-Wasser-Dikinase RHOMBOS-VERLAG

2 Bibliografische Information Der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, daß solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutzgesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürfen. Forschung Politik RHOMBOS VERLAG 2005 RHOMBOS-VERLAG, Berlin Printed in Germany Das Werk ist in allen seinen Teilen urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung außerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ist ohne Zustimmung des Verlages unzulässig und strafbar. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeisung und Verarbeitung in elektronischen Systemen. Umschlag: Garip Sari VK-Nr RHOMBOS-VERLAG, Kurfürstenstr. 17, Berlin Druck: dbusiness GmbH, Berlin, Eberswalde ISBN

3 Oliver Kötting Ein neues stärke-relevantes Enzym in Arabidopsis thaliana: Die Phosphoglukan-Wasser-Dikinase Diese Arbeit wurde als Dissertation in der Wissenschaftsdisziplin Molekulare Pflanzenphysiologie von Februar 2002 bis Juni 2005 an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Potsdam angefertigt. Gutachter: Prof. Dr. M. Steup (Universität Potsdam) Prof. Dr. U.-I. Flügge (Universität Köln) Prof. Dr. N. Amrhein (Eidgenössisch Technische Hochschule Zürich) Datum der mündlichen Prüfung: RHOMBOS-VERLAG

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5 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Einleitung Struktur der Stärke Metabolismus der Stärke Stärkesynthese Stärkeabbau Stärke-Phosphorylierung Regulation des Stärkemetabolismus Zielsetzung der Arbeit Material und Methoden Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterial Geräte Medien Bakterienstämme E. coli-stämme Agrobacterium tumefaciens-stamm Antikörper Primäre Antikörper Sekundäre Antikörperkonjugate Plasmide Oligonukleotid-Primer Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen Pflanzenmaterial Anzucht von Arabidopsis thaliana auf Erde Oberflächensterilisierung von Samen Anzucht von Arabidopsis thaliana in Sterilkultur Molekularbiologische Standardmethoden Anzucht von Bakterien Anzucht von Escherichia coli Anzucht von Agrobacterium tumefaciens Herstellung von kompetenten Bakterien Herstellung von kompetenten E. coli Herstellung von kompetenten Agrobacterium tumefaciens Transformation von Bakterien

6 INHALTSVERZEICHNIS Transformation von E. coli Transformation von Agrobacterium tumefaciens Lagerung von Bakterien Isolierung von genomischer DNA aus Blättern Isolierung von RNA aus Blättern Transformation von Arabidopsis thaliana Screening nach homozygoten T-DNA-Insertionslinien Klonierungen Klonierung der OK1-cDNA Der OK1-Expressionsvektor Die Gateway-Technologie Die Konstruktion des Expressionsvektors OK1-pDEST RNAi-Pflanzen Klonierung von OK1-R1-pHANNIBAL Klonierung von OK1-R1-pART Biochemische Standardmethoden Herstellung von Proteinextrakten aus pflanzlichem Gewebe Proteinbestimmung Denaturierende diskontinuierliche SDS-PAGE Coomassie-Färbung von Proteinen im Gel Transfer von Proteinen aus dem Gel auf Nitrocellulose (Western-Blot) und immunchemischer Nachweis (Immunoblot) Trocknung von Polyacrylamidgelen Autoradiographie Nicht-wässrige Fraktionierung von Pflanzenmaterial Herstellung von nicht-wässrigen Fraktionen Native PAGE und Aktivitätsfärbung Heterologe Expression von OK1/ PWD in E. coli und Reinigung Heterologe Expression von R1/ GWD in E. coli und Reinigung Isolierung von Stärkegranula aus Blättern von Arabidopsis thaliana Isolierung von Stärkegranula mit gebundenen Proteinen Isolierung von Stärkegranula für Aktivitäts-/ Bindungstests sowie zur Analyse des gebundenen Phosphates... 60

7 INHALTSVERZEICHNIS Photometrische Bestimmung des Stärkegehaltes in Stärkesuspensionen Semiquantitative Stärkebestimmung Quantitative Bestimmung der Stärkegehalte von Arabidopsis-Blättern Saure Hydrolyse von Stärke Herstellung einer Mischung aus [ - 33 P]ATP und [ - 33 P]ATP (Randomisierung) In vitro-phosphorylierung von Stärkegranula durch GWD Bindung von Proteinen an Stärkegranula Massenspektrometrische Analyse von Peptiden Präparation und Analyse von Protoplasten- und Chloroplasten-Extrakten Herstellung eines polyklonalen anti-ok1-/ PWD-Antikörpers Reinigung von OK1/ PWD aus Blättern der Arabidopsis sex1-3-mutante Radioaktiver Stärkephosphorylierungstest Autokatalytische Phosphorylierung von OK1/ PWD Chromatographische Analyse von Glukosephosphaten durch HPAEC-PAD Trennung von Monosacchariden Bestimmung der Radioaktivität in den aufgefangenen Fraktionen Bestimmung von [ 32 P]- und [ 33 P]-Orthophosphat Glukanketten-Abspaltung von in vitro phosphorylierter Arabidopsis-Stärke Isolierung von Phosphoglukanen mittels Anionenaustauschchromatographie Ergebnisse Identifizierung von Phosphoglukan-bindenden Proteinen Bindung von Proteinen an phosphorylierte und nicht-phosphorylierte Stärkegranula OK1, ein bisher unbekanntes Protein, das bevorzugt an phosphorylierte Stärke bindet Funktionelle Charakterisierung des rekombinanten OK1-Proteins Klonierung und heterologe Expression von OK1 in E. coli Lokalisierung von OK

8 INHALTSVERZEICHNIS Intrazelluläre Lokalisierung von OK Organspezifische Expression von OK In vitro-phosphorylierung von Phosphoglukanen durch OK Ein autophosphoryliertes Protein ist Zwischenprodukt der OK1-Reaktion OK1 ist eine Phosphoglukan-Wasser-Dikinase Simultane Phosphorylierung von Stärkegranula durch PWD und GWD Charakterisierung der Phosphoglukansubstrate nach in vitro-phosphorylierung durch PWD PWD phosphoryliert Glukosyleinheiten in Phosphoglukanen bevorzugt an der C-3-Position Anionenaustauschchromatographie von Phospho-Oligosacchariden In vitro-charakterisierung der Aktivität von aus Arabidopsis-Blättern angereichertem PWD-Protein Transgene Arabidopsis-Pflanzen mit verminderter PWD-Proteinmenge Eine PWD-Knockout-Mutante RNAi-Pflanzen mit vermindertem PWD-Proteingehalt Stärkegehalte der transgenen Pflanzen mit verringerter PWD-Proteinmenge Semiquantitative Analyse des Stärkegehaltes von Arabidopsis WT und pwd mittels Iodfärbung Stärkegehalte von Arabidopsis WT- und pwd-pflanzen im Tagesverlauf Stärkegehalte von Arabidopsis WT- und PWD-RNAi- Pflanzen am Ende von Licht- und Dunkelphase Direkter Vergleich der Stärkegehalte von Arabidopsis WT-, PWD-RNAi- und pwd-pflanzen Stärkephosphatgehalte der transgenen Pflanzen mit vermindertem PWD-Proteingehalt PWD bindet an Blattstärkegranula während des Netto-Abbaus der Stärke im Dunkeln Diskussion Bindung von Proteinen an phosphorylierte Stärke Charakterisierung der PWD-Aktivität

9 INHALTSVERZEICHNIS 4.3 Physiologische Bedeutung von PWD Zusammenfassung Summary Abkürzungsverzeichnis Literaturverzeichnis Anhang Struktur des PWD-Lokus (At5g26570) Abgeleitete Aminosäuresequenz des PWD-Proteins Aminosäuresequenz des rekombinanten PWD-Proteins Vergleich der Aminosäuresequenzen von PWD und GWD aus Arabidopsis thaliana und GWD aus Solanum tuberosum Organspezifische Expression von PWD und GWD Entwicklungsspezifische Expression von PWD und GWD