GUTACHTERLICHE BEURTEILUNG
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- Alma Haupt
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1 DR. JOCHEN STEINMANN Direktor am Landesuntersuchungsamt für Chemie, Hygiene und Veterinärmedizin Fachbereich Med. Mikrobiologie und Hygiene Bremen St.-JÜrgen-Straße Tel.: (0421) Fax.: (0421) Dr. Stlsbe Henkel-Ecolab GmbH & Co. OHG Postfach Düsseldorf Hepatitis B-Wirksamkeit von INCIDIN FOAM im DNS-Polymerase Test GUTACHTERLICHE BEURTEILUNG Da die DNS-Polymerase einen guten Marker für die strukturelle Integrität des Hepatitis B Virus darstellt, kann sie als indirekter Marker für die Infektiosität herangezogen werden. Deshalb ist das Flächendesinfektionsmitlel INCIDIN FOAM der Firma Henkel-Ecolab GmbH & Co. OHG gemäß Auftrag auf seine Hepatitis B-inaktivierenden Eigenschaften im DNS-Polymerase Test untersucht worden. Nach unseren Untersuchungsergebnissen zeigte INCIDIN FOAM eine ausgeprägte Viruzidie gegenüber dem Hepatitis B-Virus. Bei Überprüfung der 80,0 %igen Lösung sind nach fünf Minuten Restaktivitäten gefunden worden, die im Bereich der Desinfektionsmitteikontrollen lagen. Zusammenfassend können aufgrund unserer Untersuchungsergebnisse für das FlächendesinfektionsmittellNCIDIN FOAM folgende Anwendungsempfehlungen zur Inaktivierung des Hepatitis B-Virus gegeben werden: konz. 5 Minuten Mit der weiteren Verbreitung von AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) ist wiederholt die Frage diskutiert worden, welche Stabilität das HIV (Human Immunodeficiency Virus) aufweist und mit welchen Maßnahmen eine Inaktivierung dieses Erregers erreicht werden kann. Mittlerweile existieren eine Reihe von experimentellen Studien, die die Inaktivierung von HIV durch chemische und physikalische Noxen behandeln. Diese
2 Vj[!!zjdje-pn01fllog (HBV) von INC!D!N EOAM Seite 2/2 Ergebnisse sind in einem Bericht der Kommission für Fragen der Virusdesinfektion in der Humanmedizin der Deutschen Vereinigung zur Bekämpfung der Viruskrankheiten (DVV) und des Bundesgesundheitsamtes (BGA) zusammengefaßt worden (Deutsches Ärzteblatt 84, Heft 18, S. B 874 vom ). Darin wird zu diesem Fragenkomplex eindeutig Stellung bezogen. Der Schlußsatz dieses Artikels lautet: "Da Hepatitis B-Virus wie HIV übertragen wird, jedoch stabiler und infektiöser als HIV ist, sind alle Vorsichtsmaßnahmen gegen eine Übertragung von Hepatitis B auch präventiv gegen HIV".,:;//2 Dr. J. ~nmann
3 DR. JOCHEN STEINMANN Landesuntersuchungsamt für Chemie, Hygiene und Veterinärmedizin Fachbereich Med. Mikrobiologie und Hygiene Bremen St.-JÜrgen-Straße Tel.: (0421) Fax.: (0421) Dr. Stlsbe Henkel-Ecolab GmbH & Co. OHG Postfach Düsseldorf Hepatitis B-Wirksamkeit von INCIDIN FOAM im DNS-Polymerase Test UNTERSUCHUNGSBERICHT Das Flächendesinfektionsmittel INCIDIN FOAM der Firma Henkel-Ecolab GmbH & Co. OHG ist gemäß Auftrag auf seine Hepatitis B-inaktivierenden Eigenschaften im DNS Polymerase Test untersucht worden. Die Untersuchungen wurden im Suspensionsversuch bei 20 C durchgeführt. Da in-vitro Vermehrungssysteme für das Hepatitis B-Virus (HBV) bislang nicht zur Verfügung stehen, ist die Bestimmung der HBV-Infektiosität bei diesen Versuchen mit dem DNS-Polymerase Test vorgenommen worden. Die DNS-Polymerase stellt einen guten Marker für die strukturelle Integrität des Virus dar und kann deshalb als indirekter Marker für die Infektiosität herangezogen werden. 1. Material und Methoden 1.1. Charakteristik des Präparates Wirkstoffe laut Angabe (in 100 g Lösung) Aussehen des Präparates Geruch des Präparates Chargennummer ph-wert der 2,0 %igen Lösung Ethanol, Isopropanol Benzalkoniumchlorid klare, farblose Flüssigkeit alkoholisch MD ,60 (Glaselektrode)
4 Vjnlzjdje-priifilng (HBV) von INCIDIN FOAM Seite 214 Das Flächendesinfektionsmittel INCIDIN FOAM wurde bei den Inaktivierungsversuchen unverdünnt eingesetzt. Bedingt durch die Serum- und Eiweißzugabe resultierte eine 80,0 %ige Prüfkonzentration Präparation der Dane-Partikel Suspension Für die Konzentrierung und partielle Reinigung der eingesetzten Dane-Partikel wurden 240 ml Serum von einem Probanden mit chronischem HBsAg-Trägerstatus und Nachweis von HBeAg und der DNS-Polymerase im SW 28 Rotor bei UpM für 16 h bei 4'C zentrifugiert. Das Sediment wurde in 2 ml 0,01 M PBS mit 0,1 % (w/v) Serumalbumin aufgenommen und jeweils ein Milliliter mit 4 ml einer 20 %igen (w/w) Saccharose-Lösung unterschichtet. Eine Zentrifugation im SW 60 Ti Rotor bei UpM für 2 h schloß sich an. Nach dem Dekantieren wurden die Dane-Partikel in 0,01 M Tris-Puffer (ph 7,4) aufgenommen. Als Maß für die Konzentration der Dane-Partikel erfolgte die Bestimmung der DNS-Polymerase Aktivität nach der von KAPLAN und Mitarbeiter beschriebene Methode. Hierbei wird nach Zugabe aller vier Desoxyribonukleosid-triphosphate die neu synthetisierte DNS gemessen, indem die Radioaktivität im Flüssigkeitszintillationszähler bestimmt wird Desinfektionsmittelversuche Die Desinfektionsmiltelversuche wurden in Polyallomer-Röhrchen in einem Wasserbad mit den Volumenverhältnissen entsprechend der Richtlinie des Bundesgesundheitsamtes und der Deutschen Vereinigung zur Bekämpfung der Viruskrankheiten ev durchgeführt. Der Versuchsansatz bestand aus einem Teil Dane-Partikel Suspension, einem Teil 0,01 M Tris-Puffer und acht Volumenteilen Desinfektionsmittel-Lösung. Bei den Versuchen mit Eiweißbelastung ist der Tris Puffer durch eine 2 %ige Rinderserum-Albumin-Lösung (bovine serum albumin, BSA, Behringwerke) bzw. durch foetales Kälberserum (FKS, Boehringer Mannheim) ersetzt worden. Ferner folgte ein Versuchsansatz ohne Viruszugabe, urn auf diese Weise gegebenenfalls eine Unspezifität irn DNS-Polyrnerase Test durch vorhandenes Desinfektionsrnittel zu erkennen.
5 Vin Izidie-priifuog (HBV) von INCIOfN EOAM Seite 3/4 Als positive Kontrolle wurde eine 1,75 %ige Formaldehyd-Lösung (ph 7,0) mitgeführt. Diese Lösung hatte in früheren Versuchen eine HBV-Wirksamkeit im DNS Polymerase Test gezeigt. Unmittelbar nach Ablauf der Einwirkzeit wurde mit 2,4 ml 0,01 M Tris-Puffer verdünnt, um durch Verdünnung die Wirkung des Desinfektionsmittels aufzuheben, und mit 2 ml einer 20 %igen Saccharose-Lösung unterschichtet. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation im SW 60 Ti Rotor bei UpM bei 4 C für 2 Stunden. Die Sedimente wurden nach Dekantieren des Überstandes und nach Trocknung im Exsikkator in 50 ~I 0,01 M Tris-Puffer resuspendiert und 25 ~I für die Bestimmung der DNS-Polymerase Aktivität in diesem Test eingesetzt. 2. Ergebnisse Die Ergebnisse der Inaktivierungsversuche mit partiell gereinigten Dane-Partikeln sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt. Die eingesetzte Dane-Partikel Suspension war so eingestellt, dass 100 ~I dieser Lösung ca Counts pro Minute (cpm) ergaben. Damit war sichergestellt, dass sich die HBV-Konzentration im Versuchsansatz auf ~ 10 8 Dane-Partikel/ml belief. Zur Kontrolle ist eine 1,75 %ige Formaldehyd-Lösung bei den Inaktivierungsversuchen mitgeführt worden. Bei früheren Versuchen hatte sich ergeben, dass die 0,7 %ige Lösung, die nach der Richtlinie des Bundesgesundheitsamtes (BGA) und der Deutschen Vereinigung zur Bekämpfung der Viruskrankheiten ev (DW) zur Prüfung von chemischen Desinfektionsmitteln auf Wirksamkeit gegen Viren vorgesehen ist, nicht in der Lage war den HBV-Titer innerhalb von 60 Minuten Einwirkzeit deutlich zu reduzieren. Die Untersuchungsergebnisse der Formaldehyd-Versuche finden sich in der Tabelle 1. Daraus ist ersichtlich, dass die Einwirkzeit eine Stunde betragen mußte, um die HBV-Aktivität, wie sie im DNS-Polymerase Test gemessen wird, vollständig zu eliminieren. Die Tabelle 2 zeigt, dass das Flächendesinfektionsmittel INCIDIN FOAM eine ausgeprägte Viruzidie gegenüber dem HBV besitzt. Bei der Überprüfung der 80,0 %igen Lösung sind nach fünf Minuten Countzahlen gefunden worden, die mit denen bei den Kontrollansätzen identisch waren. Sie beliefen sich auf 29 cpm, 31
6 VjrtJzjdje-prÜftmg (HBV) von!nc!din EOAM Seite 4/4 cpm und 26 cpm in den drei gewählten Ansätzen. Nach zehn Minuten ergaben sich nahezu identische Werte. Zusammenfassend kann nach den in der Tabelle 2 genannten Werten folgende Anwendungsempfehlung und Einwirkzeit für das Flächendesinfektionsmittel INCIDIN FOAM zur Inaktivierung des Hepatitis B-Virus gegeben werden: konz. 5 Minuten
7 Ausgewählte Literatur 1. Howard, G.R, I. Dixon, P. Young, P. van Eerd, and H. Schellekens: Ghemical investigations of Hepatitis B-Virus: the effects of disinfectants on virus-associated DNA-polymerase-activity, morphology and infectivity. J. Viral. Meth. 7,1983, Kaplan, P.M., RL. Greenman, I.L. Gerin, RH. Purcell, and W.S. Robinson: DNA-Polymerase associated with human Hepatitis B antigen. J. Viral. 12, 1973, Nath, N., G.T. Fang, and RY. Dodd: Inactivation of DNA-Polymerase associated with Hepatitis B-Virus. J. med. Virol. 10, 1982, Richtlinien des Bundesgesundheitsamtes und der Deutschen Vereinigung zur Bekämpfung der Viruskrankheiten ev. zur Prüfung von chemischen Desinfektionsmitlein auf Wirksamkeit gegen Viren. Bundesgesundheitsblatt 25, 1982, Siegert, W.: Die Dane-Partikel-assoziierte DNS-Polymerase: Biochemische Grundlagen und klinische Bedeutung in der Beurteilung der Hepatitis B. Lab. med. 6, 1982,77 6. Steinmann, J., A. Böse und W. Arnold: HBV-Wirksamkeit von chemischen Desinfektionsmitteln im DNS-Polymerase Test. Hyg. + Med. 10, 1985,255
8 Tabelle 1: HBV-inaktivierende Eigenschaften von Formaldehyd. Angegeben sind die Counts pro Minute (cpm). Einwirkzeit Formaldehyd (Minuten) (1,75%) 5 n.d n.d. = nicht durchgeführt
9 Tabelle 2: Hepatitis B-inaktivierende Eigenschaften von INCIDIN FOAM (80,0%) im DNS-Polymerase Test bei 20 C. Dargestellt sind die Counts pro Minute (cpm). Erläutert werden die Ansätze in der beiliegenden Legende. Dane-Partikel- Desinfektionsmittel- INCIDIN FOAM Einwirkzeit Kontrollen Kontrollen (80,0%) (Minuten)
10 Erläuterung der Ansätze: Dane-Partikel-Kontrollen Dane-Partikel + Aqua bidest. + Tris-Puffer 11 Dane-Partikel + 2% Albumin + Tris-Puffer 111 Dane-Partikel + FKS + Tris-Puffer Desinfektionsmittel-Kontrollen Tris-Puffer + Aqua bidest. + Desinfektionsmittel 11 Tris-Puffer + 2% Albumin + Desinfektionsmittel 111 Tris-Puffer + FKS + Desinfektionsmittel Inaktivierungsansatz Dane-Partikel + Aqua bidest. + Desinfektionsmittel 11 Dane-Partikel + 2% Albumin + Desinfektionsmittel 111 Dane-Partikel + FKS + Desinfektionsmittel Volumenverhältnis bei allen Ansätzen I Volumenteil + 1 Volumenteil + 8 Volumenteile
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