Enzymimmunoassay für den Nachweis von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli in Lebensmitteln

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1 RIDASCREEN Campylobacter Enzymimmunoassay für den Nachweis von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli in Lebensmitteln Enzyme immunoassay for the detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in food Art. No.: R4204 In vitro Test Lagerung bei 2-8 C Storage at 2-8 C R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 Anschrift: R-Biopharm AG An der neuen Bergstraße 17 D Darmstadt Für weitere Fragen stehen Ihnen gerne zur Verfügung: Telefon: Zentrale / Auftragsannahme ( ) Telefax / Auftragsannahme ( ) orders@r-biopharm.de Marketing ( ) info@r-biopharm.de RIDA und RIDASCREEN sind eingetragene Warenzeichen der R-Biopharm AG Hersteller: R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland R-Biopharm AG ist ISO 9001 zertifiziert. RIDA and RIDASCREEN are registered trademarks of R-Biopharm AG Manufacturer: R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany R-Biopharm AG is ISO 9001 certified. 2 RIDASCREEN Campylobacter

3 Kurzinformation RIDASCREEN Campylobacter (Art. Nr.: R4204) ist ein Sandwich-Enzymimmunoassay zum Nachweis von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli in Lebensmitteln. Alle Reagenzien für die Durchführung des Enzymimmunoassays sind im Testkit enthalten. Ein Kit ist ausreichend für 48 Bestimmungen. Probenvorbereitung: Zeitbedarf: Nachweisgrenze: homogenisieren und anreichern Probenanreicherung Stunden Testdurchführung (ELISA)... 1 h 45 min Testdurchführung gesamt...ca Stunden (inklusive Anreicherung) 1 KBE Campylobacter aus 25 g Probe, entsprechend mindestens 10 4 Campylobacterzellen/ml nach Anreicherung. RIDASCREEN Campylobacter

4 1. Verwendungszweck Der RIDASCREEN Campylobacter (Art. Nr.: R4204) ist ein Sandwich-Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von C. jejuni und C. coli aus Anreicherungskulturen von Lebensmittelproben. Die Voranreicherung muss nach geeigneten Selektivmethoden zur Anreicherung von Campylobacter spp. (z. B.: Bolton-Selektiv-Anreicherung, gemäß ISO, FDA-BAM) durchgeführt werden. 2. Allgemeines Die Campylobacteriose zählt mittlerweile weltweit neben der Salmonellose zu den häufigsten lebensmittelbedingten Durchfallerkrankungen des Menschen. Die starke Häufung der Campylobacter-Enteritis ist begünstigt durch die weite speziesübergreifende Verbreitung des Bakteriums unter Wild-, Nutz- und Haustieren (Vögel und Säugetiere). Als Kommensale im Darmtrakt von Geflügel gelangt Campylobacter insbesondere über diese Tiere in die Nahrungskette des Menschen. Aber auch andere Lebensmittel wie Milch, Hackfleisch und Trinkwasser sind Vehikel der Übertragung des Erregers. Campylobacter wird von den zahlreichen Wirten in großen Mengen in die Umwelt freigesetzt und gelangt letztlich über kontaminierte Nahrung in den Menschen. Die Infektionsdosis für eine Campylobacter-Enteritis ist mit 500 Keimen relativ gering. Von den etwa 15 bekannten Campylobacter-Spezies sind hauptsächlich C. jejuni und C. coli Auslöser der Gastroenterititen des Menschen. Für den erfolgreichen Nachweis der sensiblen Campylobacter-Spezies aus Lebensmittelproben, ist eine selektive Voranreicherung der Probe (z.b. in Bolton- Selektiv-Anreicherungsbouillon) unter mikroaeroben Bedingungen erforderlich. Die in der Anreicherung vermehrten C. jejuni und C. coli können mit dem Antigennachweisverfahren des RIDASCREEN Campylobacter erfasst und nachgewiesen werden. 3. Testprinzip Im RIDASCREEN Campylobacter-Test werden spezifische Antikörper in einem Sandwich-Verfahren eingesetzt. An der Oberfläche der Vertiefung der Mikrotiterplatte sind Campylobacter spezifische Antikörper gegen Antigene von C. jejuni und C. coli gebunden. 4 RIDASCREEN Campylobacter

5 Eine Suspension der zu untersuchenden vorangereicherten Lebensmittelprobe sowie die Kontrollen werden bei Raumtemperatur zur Inkubation in die Vertiefung der Mikrotiterplatte pipettiert. Nach einem Waschschritt werden mit Peroxidase konjugierte Antikörper gegen Antigene von C. jejuni und C. coli dazu gegeben und bei Raumtemperatur inkubiert. Bei Anwesenheit von Campylobacter-Antigenen in der Probe bildet sich ein Sandwich-Komplex aus immobilisierten Antikörpern, Campylobacter-Antigen und konjugierten Antikörpern. Nicht gebundene enzymmarkierte Antikörper werden in einem weiteren Waschschritt entfernt. Nach der Zugabe der Substrat-Lösung wandelt gebundenes Enzym bei positiven Proben die farblose Lösung in eine blaue Lösung um. Die Zugabe des Stopp-Reagenzes führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm; Die Extinktion ist proportional zur Konzentration des in der Probe vorhandenen Campylobacter-Antigens. 4. Packungsinhalt Jeder Testkit enthält alle Reagenzien für 48 Tests: 1 x Mikrotiterplatte mit 48 Kavitäten (6 Streifen à 8 Einzelkavitäten) beschichtet mit Antikörpern gegen Antigene von C. jejuni und C. coli 1 x Positivkontrolle (1 ml)... roter Verschluss enthält inaktivierte C. jejuni-zellen enthält 0,1% Kathon gebrauchsfertig 1 x Negativkontrolle (1 ml)... weißer Verschluss blau gefärbt, enthält 0,1% Kathon gebrauchsfertig 1 x Konjugat (5 ml)... roter Verschluss Peroxidase-konjugierte Antikörper gegen Campylobacter rötlich gefärbt, enthält 0,1% Kathon gebrauchsfertig 1 x Substratlösung (13 ml)... brauner Verschluss enthält Harnstoffperoxid und Tetramethylbenzidin, gebrauchsfertig 1 x Stopp-Reagenz (13 ml)... weißer Verschluss enthält 1 N Schwefelsäure gebrauchsfertig 1 x Waschpuffer, (100 ml),... brauner Verschluss Phosphat-gepufferte NaCl-Lösung (10fach Konzentrat) enthält 0,1% Thimerosal RIDASCREEN Campylobacter

6 5. Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör 5.1. Geräte: Laborwaage Stomacher oder Äquivalent (zum Homogenisieren der Probe) Stomacher-Beutel oder Äquivalent (optional mit Filtereinsatz) Anaerobentopf (z.b. AnaeroJar, Oxoid) Inkubationsbeutel zur Erzeugung einer mikroaeroben Atmosphäre (z.b.: CampyGen, Oxoid) Mikropipette für μl und 1 ml saubere Einmal-Pipettenspitzen 10 ml Pipetten (steril) 15 ml Falconröhrchen (steril) Inkubator, einstellbar auf 37 ± 1 C und 42 ± 1 C Multikanalpipette (300 µl) oder Mikrotiterplatten-Washer (optional) Messzylinder (1000 ml) Stoppuhr Filterpapier (Labortücher) Abfallbehälter mit einer 0,5%igen Hypochloritlösung (optional) Wasserbad (100 C) oder Vergleichbares zur Erhitzung der Probenvoranreicherung (empfohlen) Mikrotiterplatten-Photometer mit 450 ± 10 nm/620 ± 10 nm Filtern 5.2. Reagenzien: destilliertes Wasser Bolton-Bouillon (z. B.: Oxoid, CM0983); Zusätze: lysiertes Pferdeblut (z. B.: Oxoid, SR0048), Campylobacter-Selektiv-Supplement (nach Bolton, z. B. Oxoid, SR0183) 6. Vorsichtsmaßnahmen Der RIDASCREEN Campylobacter Test ist nur von geschultem Laborpersonal durchzuführen. Die Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Tests ist strikt einzuhalten. Generell empfehlen wir für Probenvorbereitung, Testdurchführung und Entsorgung die Einhaltung der allgemeingültigen GLP-Richtlinien (gute Laborpraxis). Alle Proben müssen als potentiell infektiös behandelt werden. Alle verwendeten Reagenzien, Waschlösungen und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben in Berührung kommen, müssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder mindestens 15 min bei 121 C autoklaviert werden. 6 RIDASCREEN Campylobacter

7 Die Positiv-Kontrolle enthält inaktivierte Campylobacterzellen. Dennoch sollte sie als potentiell infektiös behandelt werden. Das Stopp-Reagenz enthält 1 N Schwefelsäure (R36/38, S2-26). Hautkontakt vermeiden. Positivkontrolle, Negativkontrolle und Konjugat enthalten 0,1% Kathon. Eine Berührung mit der Haut oder Schleimhaut ist zu vermeiden. Der Waschpuffer enthält 0,1% Thimerosal. Eine Berührung mit der Haut oder Schleimhaut ist zu vermeiden. Harnstoffperoxid kann zu Verätzungen führen. Vorsichtig handhaben! 7. Reagenzien und ihre Lagerung Die Reagenzien bei 2-8 C lagern. Komponenten des Testkits auf keinen Fall einfrieren! Nicht benötigte Mikrotiterstreifen zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2-8 C lagern. Die Substratlösung ist lichtempfindlich, deshalb direkte Lichteinwirkung vermeiden. Nach Ablauf des Verfalldatums (siehe Außenetikett unter Expiry) kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Ein Austausch von Einzelreagenzien zwischen Kits verschiedener Chargennummern ist nicht zulässig. 8. Anzeichen für Reagenzienverfall bläuliche Färbung der Substratlösung vor Zugabe in die Kavitäten Extinktion der Positiv-Kontrolle kleiner 0,8 (E 450/620 nm < 0,8) RIDASCREEN Campylobacter

8 9. Probenvorbereitung Da die Anreicherung von Campylobacter aus kontaminierten Lebensmittelproben generell schwierig ist, wird die Durchführung einer strikt mikroaeroben Anreicherungsmethode, wie die unten beschriebene Selektivanreicherung nach Bolton (F. J. Bolton, 1995), für die Vorbereitung der Proben empfohlen. Alternativ kann eine vergleichbare, geeignete Methode (nach USDA, BAM, ISO, etc.) zur Voranreicherung verwendet werden Anreicherung nach Bolton Boltonbouillon nach Herstellerangabe zubereiten und autoklavieren. Auf 50 C abkühlen lassen. Lysiertes Pferdeblut und Campylobacter-Selektiv-Supplement nach Herstellerangabe aseptisch zugeben. 25 g Probe in einen Stomacherbeutel einwiegen, 225 ml Bolton-Selektiv- Bouillon zugeben und homogenisieren Oberseite des Stomacherbeutels umfalten und mit Klebeband oder Beutelverschluss verschließen Beutel unter mikroaeroben Bedingungen für 4 h bei 37 ± 1 C inkubieren, anschließend die Inkubationstemperatur auf 42 ± 1 C erhöhen und für weitere 20 h inkubieren nach Ende der Gesamtinkubationszeit (24 h) 0,1 ml der Kultur in ein Falconröhrchen mit 10 ml frischer Bolton-Selektiv-Bouillon überführen Röhrchen unter mikroaeroben Bedingungen für h bei 42 ± 1 C inkubieren Bitte beachten: Es wird dringend empfohlen, die Anreicherung unter mikroaerober Atmosphäre durchzuführen. Geeignete Gefäße und Gasgenerierungssysteme (s. 5.2.) sind dazu einzusetzen. Die Zeitabstände zwischen dem Überführen des 0,1 ml Aliquots in frische Bouillon, dem erneuten Einsetzen in einen Anaerobentopf, aktivieren des Gasgenerierungssystems und verschließen des Topfes sollten so gering wie möglich gehalten werden. 8 RIDASCREEN Campylobacter

9 10. Testdurchführung Testvorbereitung Ein geeignetes Aliquot der Probenvoranreicherung entnehmen und für entsprechende Campylobacter-Bestätigungstests aufbewahren. Die restliche Voranreicherung sollte vor Einsatz in den Test für 10 min im Wasserbad auf 100 C erhitzt werden. Das Abkochen der Probe reduziert die potentielle Infektionsgefahr beim Arbeiten mit Anreicherungen potentiell pathogener Bakterien. Alle Reagenzien und Probenvoranreicherungen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20-25 C) erwärmen oder abkühlen lassen. Der Waschpuffer liegt als 10fach Konzentrat vor und muss vor Gebrauch 1:10 (1+9) mit dest. Wasser verdünnt werden (z. B. 10 ml Pufferkonzentrat + 90 ml dest. Wasser). Vor dem Verdünnen darauf achten, dass evtl. gebildete Kristalle vollständig durch Erwärmen im Wasserbad bei 37 C gelöst werden. Der gebrauchsfertige Puffer hat eine Haltbarkeit von ca. vier Wochen bei 2-8 C Testdurchführung Sorgfältiges Waschen ist sehr wichtig. Ein Eintrocknen der Kavitäten zwischen den Arbeitsschritten vermeiden. 1. Plattenvorbereitung: so viele Kavitäten in den Halterahmen einsetzen, wie für die Kontrollen und alle Proben benötigt werden. Nicht benötigte Mikrotiterstreifen zurück in den Folienbeutel geben und gut verschließen. 2. Probenzugabe: jeweils 100 µl der vorangereicherten Probe, der Negativkontrolle und der Positivkontrolle in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. Dabei jeweils eine neue Pipettenspitze verwenden. Die Positionen der Kontrollen und Proben protokollieren. Die Platte abdecken und für 60 min bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. 3. Erster Waschschritt: bei Verwendung von frischer, nicht abgekochter Probenvoranreicherung müssen die Kavitäten in einen Abfallbehälter für infektiöses Material (zur Dekontamination 0,5 % Hypochloritlösung im Behälter vorlegen) entleert werden. Ansonsten die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 300 µl Waschpuffer (siehe 10.1.) waschen. Diesen Vorgang viermal wiederholen. RIDASCREEN Campylobacter

10 Der Vorgang kann manuell (Multikanalpipette) oder mittels Mikrotiterplatten- Washer mit entsprechender Programmierung durchgeführt werden. Gründliches Waschen der Kavitäten ist wichtig und notwendig für eindeutige Resultate. 4. Konjugatzugabe: je 100 µl Konjugat in die vollständig entleerten Kavitäten pipettieren. Die Platte abdecken und für 30 min bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. 5. Zweiter Waschschritt: die Kavitäten entleeren und 5-mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen (gleiche Vorgehensweise wie bei Punkt 3.). 6. Substratzugabe: je 100 µl Substratlösung in die vollständig entleerten Kavitäten pipettieren. Die Platte abdecken und 15 min bei Raumtemperatur (20-25 C) im Dunkeln inkubieren. 7. Stoppen der Reaktion: jeweils 50 µl Stopp-Reagenz in die Kavitäten pipettieren und vorsichtig manuell mischen. 8. Messung: die Extinktion bei 450 ± 10 nm / 620 ± 10 nm (Referenzwellenlänge) innerhalb von 30 min nach Zugabe des Stopp-Reagenzes messen. 11. Auswertung Für die Auswertung ist bei R-Biopharm die speziell für die RIDASCREEN Enzymimmunoassays entwickelte Software RIDA SOFT Win (Art. Nr. Z9999), erhältlich Qualitätskontrolle des Tests Der Extinktionswert der Positivkontrolle sollte größer oder gleich 0,8 sein. Der Extinktionswert der Negativkontrolle sollte kleiner 0,2 sein. Falls diese Kriterien nicht erfüllt werden, sollten die folgenden Arbeitsschritte überprüft und evtl. korrigiert werden. Anschließend den Test wiederholen. überprüfen des Haltbarkeitsdatums des Testkits sicherstellen, dass alle Reagenzien des Testkits vor Gebrauch auf Raumtemperatur gebracht wurden Verwendung von neuen Pipettenspitzen beim Pipettieren der Proben und Kontrollen (Vermeidung von Kreuzkontamination) überprüfen der Sterilität des Wassers für das Ansetzen des Waschpuffers unzureichendes Waschen/zu wenige Waschschritte ( ) kontaminierte Pipetten (regelmäßig reinigen) 10 RIDASCREEN Campylobacter

11 11.2. Grenzwertberechnung Zur Festlegung des Grenzwertes werden zum gemessenen Extinktionswert der Negativkontrolle 0,15 Extinktionseinheiten hinzu addiert. Beispiel: Negativkontrolle = 0,042 Grenzwert = 0, ,15 = 0, Interpretation der Ergebnisse Als positiv werden solche Proben beurteilt, deren Extinktionswert mehr als 10 % über dem errechneten Grenzwert liegt. Als grenzwertig werden solche Proben bezeichnet, deren Extinktionswert im Bereich von 10 % ober- oder unterhalb des Grenzwertes liegt. In diesem Fall ist die Untersuchung mit frischer Voranreicherung zu wiederholen. Fällt eine Wiederholungsuntersuchung wieder in den Grenzbereich, so ist die Probe als negativ zu beurteilen. Proben, deren Extinktionswert mehr als 10 % unter dem errechneten Grenzwert liegt, sind als negativ zu bewerten. Diese Angaben entsprechen dem heutigen Stand unserer Kenntnisse und sollen über unsere Produkte und deren Anwendungsmöglichkeiten informieren. Sie haben somit nicht die Bedeutung, bestimmte Eigenschaften der Produkte oder deren Eignung für einen konkreten Einsatzzweck zuzusichern. R-Biopharm übernimmt keine Gewährleistung, außer für die standardisierte Qualität der Reagenzien. Defekte Produkte werden ersetzt. Darüber hinaus gehende Ansprüche für direkte oder indirekte Schäden oder Kosten aus der Nutzung der Produkte entstehen nicht. RIDASCREEN Campylobacter

12 RIDASCREEN Campylobacter Brief information RIDASCREEN Campylobacter (Art. No.: R4204) is a sandwich enzyme immunoassay for the detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in foods. All reagents required for the enzyme immunoassay are contained in the test kit. Each kit contains sufficient reagents for 48 tests. Sample preparation: Time requirement: Detection limit: homogenization and enrichment sample enrichment hours test implementation (ELISA)... 1 h 45 min test implementation, total...approx h (including enrichment) 1 cfu Campylobacter in 25 grams of sample, equal to 10 4 Campylobacter cells/ml at least after enrichment. 12 RIDASCREEN Campylobacter

13 1. Intended use The RIDASCREEN Campylobacter (Art. No.: R4204) is a sandwich enzyme immunoassay for the qualitative detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from enrichment cultures of food samples. The pre-enrichment has to be performed using appropriate selective enrichment methods for Campylobacter spp. (e.g. Bolton-Selective-Enrichment method, according to ISO, FDA-BAM). 2. General Campylobacteriosis is among Salmonellosis one of the most significant diarrhoeal diseases worldwide. The strong increase of Campylobacter enteritis is encouraged by the broad spread of the bacterium in different species as wild or farm animals as well as pets (birds and mammalians). As a commensal in the gut of poultry Campylobacter reaches the food chain of humans via these animals. Additionally other food stuffs as milk, ground meat and drinking water can act as transmission pathways for the pathogens. Campylobacter is released by numerous hosts in high quantities to the environment and reaches the human body via contaminated foods. The infective dose to get to a Campylobacter enteritis is relatively low. It doesn t need more than 500 germs to get to an infection. From approximately 15 known Campylobacter species mainly C. jejuni and C. coli are known to be causes for human gastroenteritis. For the successful detection of the extremely sensitive Campylobacter species which could occur in foods a specific selective enrichment of the samples (e.g. in Bolton-Selective-Enrichment broth) using micro aerobic conditions is necessary. Cells of C. jejuni and C. coli multiplied during the enrichment procedure will be captured and detected by the antibody based system of RIDASCREEN Campylobacter. 3. Test principle Within the test format of RIDASCREEN Campylobacter specific antibodies were used in a typical sandwich system. The specific antibodies against the antigens of C. jejuni and C. coli are bound to the surface of the wells of a microplate. RIDASCREEN Campylobacter

14 A suspension of the pre-enriched food sample as well as the control solutions are added to the wells and incubated at room temperature. Subsequently to a washing step the added peroxidase conjugated antibodies against C. jejuni and C. coli are incubated at room temperature again. If Campylobacter antigens are present in the sample a sandwich complex of immobilized antibodies, Campylobacter antigen and enzyme conjugated antibodies is formed. Any unbound enzyme conjugate is then removed in a further washing step. After adding the substrate solution the bound enzyme converts the colorless substrate into a blue product if the sample was positive. The addition of the stop solution leads to a color change from blue to yellow. The measurement is made photometrically at 450 nm. The absorption is proportional to the concentration of Campylobacter antigen in the sample. 4. Reagents provided Each kit contains sufficient reagents for 48 tests: 1 x Microplate with 48 wells (6 strips with 8 wells each) coated with antibodies against antigens of C. jejuni and C. coli 1 x Positive control (1 ml)... red cap contains inactivated (non viable) C. jejuni cells contains 0.1% Kathon ready-to-use 1 x Negative control (1 ml)... white cap stained blue, contains 0.1% Kathon ready-to-use 1 x Conjugate (5 ml)...red cap peroxidase conjugated antibodies against Campylobacter stained red, contains 0.1% Kathon ready-to-use 1 x Substrate solution (13 ml)...brown cap contains urea peroxide and tetramethylbenzidine, ready-to-use 1 x Stop solution (13 ml)... white cap contains 1 N sulfuric acid ready-to-use 1 x Wash buffer (100 ml)... brown cap phosphate buffered NaCl-solution (10fold concentrated) contains 0.1% thimerosal 14 RIDASCREEN Campylobacter

15 5. Materials required but not provided 5.1. Equipment: laboratory scale blender or equivalent (for sample homogenization) blender bags or equivalent (filter optional) anaerobic jar (e.g. AnaeroJar, Oxoid) incubation bags for generation of micro aerobic atmosphere (e.g. CampyGen, Oxoid) micro pipettes for µl and 1 ml clean, disposable pipette tips 10 ml pipettes (sterile) 15 ml falcon tubes (sterile) incubator adjustable to 37 ± 1 C (98 F) and 42 ± 1 C (107.6 F) multi channel pipette (300 µl) or microplate washer (optional) measuring cylinder (1000 ml) timer filter paper (laboratory tissues) waste bin with 0.5% hypochlorite solution (optional) water bath (100 C/202 F) or equivalent for heat treatment of sample preenrichment (recommended) microplate reader with 450 ± 10 nm/620 ± 10 nm filters 5.2. Reagents: distilled water Bolton broth (e.g. Oxoid, CM0983), additives: laked horse blood (e.g. Oxoid, SR0048), Campylobacter selective supplement (according to Bolton, e.g. Oxoid, SR0183) 6. Warnings and precautions The RIDASCREEN Campylobacter test should only be carried out by trained laboratory employees. The instruction for use must be strictly followed. For sample preparation, test performance and waste disposal the compliance of GLP guidelines is recommended. All samples have to be treated as they could be potentially infectious. RIDASCREEN Campylobacter

16 All materials as reagents, washing solutions or lab ware coming into contact with potentially infectious samples have to be treated with suitable decontaminating agents or have to be autoclaved for 15 min at 121 C (249.8 F) at least. The positive control contains inactivated Campylobacter cells. However it should be treated as it could be potentially infectious. The stop solution contains 1 N Sulphuric Acid (R36/38, S2-26). Avoid contact with the skin. Positive control, negative control and conjugate contain 0.1% Kathon. Avoid contact to skin and mucosa. The wash buffer contains 0.1% Thimerosal. Avoid contact to skin and mucosa. Urea peroxide causes burns. Handle with care! 7. Storage instructions Store the kit at 2-8 C. Do not freeze any test kit components! Return any unused micro wells to their original foil bag reseal them together with the desiccant provided and further store at 2-8 C. The substrate solution is light sensitive, therefore, avoid exposure to direct light. No quality guarantee is accepted after expiry of the kit (see kit label). Do not interchange individual reagents between kits of different lot numbers. 8. Indication of instability and deterioration of reagents any bluish coloration of the substrate solution prior to test implementation a value of less than 0.8 absorbance units (A 450/620 nm < 0.8) for the positive control 9. Preparation of samples As it is known that enrichment of Campylobacter from contaminated food samples is difficult it is recommended to follow a protocol for strictly micro aerobic enrichment as the Bolton-selective-enrichment (F. J. Bolton 1995) which is described below. Alternatively a comparable sufficient method (according to USDA, BAM; ISO, etc.) can be used for pre-enrichment. 16 RIDASCREEN Campylobacter

17 9.1. Bolton enrichment method Prepare and autoclave Bolton broth according to manufacturers instructions. Let the broth cool down to 50 C. Add laked horse blood and Campylobacterselective-supplement aseptically according to manufacturer s instructions. weigh 25 g of sample into a blender bag, add 225 ml Bolton-selective-broth and homogenize fold over the top of the blender bag and seal the bag using a tape or bag closure incubate bag under micro aerobic conditions for 4 h at 37 ± 1 C (98 F), subsequently increase temperature to 42 ± 1 C (107.6 F) and further incubate for 20 h after total incubation time (24 h) is ended transfer 0.1 ml of the culture to a falcon tube containing 10 ml of fresh Bolton-selective-broth incubate tube under micro aerobic conditions for h at 42 ± 1 C Important note: It is strongly recommended to perform the enrichment under micro aerobic conditions. Use appropriate vessels and gas generating systems (s. 5.2.). Keep time frames between transfer of 0.1 ml culture into fresh broth, the reinsertion of tubes into an anaerobic jar, activation of gas generating system and closure of jar as short as possible. 10. Test implementation Test preparation Take an appropriate aliquot of sample enrichment and store it for possible Campylobacter confirmation tests. The remaining sample pre-enrichment should be heat treated for 10 min at 100 C (212 F) in a water bath prior to test implementation. The boiling of sample reduces the potential danger of infection while working with potentially pathogenic bacteria. Bring all reagents and sample pre-enrichments to room temperature (20-25 C / F) before use. The wash buffer is provided as a 10fold concentrate and has to be diluted 1:10 (1+9) with distilled water prior to use (e.g. 10 ml concentrated buffer + 90 ml distilled water). Before dilution precipitated salt crystals in the concentrate have to be resolved completely by warming up in a water bath at 37 C (98.6 F). The ready-to-use buffer is storable for 4 weeks at 2-8 C ( F). RIDASCREEN Campylobacter

18 10.2. Test procedure Carefully follow the recommended washing procedure. Do not allow micro wells to dry between working steps. 1. Plate preparation: insert as many micro wells into the micro well holder as needed for all samples and controls. Return any unused micro wells to their original foil bag and reseal. 2. Adding Sample: using a new pipette tip for each sample, transfer 100 µl aliquots of pre-enriched sample, negative control and positive control into individual wells, recording the position of each sample. Cover the wells and incubate for 60 min at room temperature (20-25 C / F). 3. First washing: using fresh, non-boiled sample enrichment the wells have to be emptied into a waste bin for hazardous material (for decontamination apply 0.5 % hypochlorite solution to the bin). Otherwise pour the liquid out of the wells and tap the microwell holder upside down vigorously (three times in a row) against absorbent paper to ensure complete removal of liquid from the wells. Fill all the wells with 300 µl washing buffer (see 10.1.) and pour out the liquid again. Repeat four more times. The procedure can be performed manually (multi channel pipette) or by use of an automated plate washer. Thorough washing of the wells is a critical step and is essential for a clear interpretation of results. 4. Adding conjugate: pipette 100 µl of conjugate into the completely emptied wells. Cover the wells and incubate for 30 min at room temperature (20-25 C / F). 5. Second washing: empty the wells and wash five times with 300 µl of wash buffer (same procedure as point 3.). 6. Adding substrate: pipette 100 µl of substrate into the completely emptied wells. Cover the wells and incubate for 15 min at room temperature (20-25 C / F) in the dark. 7. Stopping of reaction: pipette 50 µl stop solution to each well and mix gently by shaking the plate manually. 8. Measurement: measure the absorbance at 450 ±10 nm / 620 ±10 nm (reference wave length). Read within 30 min after addition of stop solution. 18 RIDASCREEN Campylobacter

19 11. Results A special software, the RIDA SOFT Win (Art. No. Z9999), is available to evaluate the RIDASCREEN enzyme immunoassays Quality control for the test to be valid Positive control must have reached an absorbance of 0.8 or higher. Negative control must have an absorbance of less than 0.2. If these criteria have not been met, the following steps should be checked and corrected before repeating the test: check kit expiry date ensure that kit components have reached room temperature prior to use a new pipette tip must be used for each sample or control to avoid cross contamination contaminated wash buffer (use sterile water for preparation) inadequate washing of wells/insufficient wash steps ( ) contaminated pipettes (clean regularly) Determination of threshold values For the determination of the threshold value 0.15 absorbance units have to be added to the absorbance value of the negative control. Example: Negative control = Interpretation of results Threshold value = = Samples which lead to an absorbance value of more than 10 % over the threshold value are considered as positive. Samples with an absorbance value in the range of 10 % higher or lower as the threshold are considered as borderline. In this case the analysis has to be repeated using fresh pre-enrichment. If the repeated analysis leads to a borderline result again the sample is considered as negative. If the absorbance value of a sample is more than 10 % below the threshold value the sample has to be considered as negative. RIDASCREEN Campylobacter

20 R-Biopharm makes no warranty of any kind, either expressed or implied, except that the materials from which its products are made are of standard quality. If any materials are defective, R-Biopharm will provide a replacement product. There is no warranty of merchantability of this product, or of the fitness of the product for any purpose. R-Biopharm shall not be liable for any damages, including special or consequential damage, or expense arising directly or indirectly from the use of this product. 20 RIDASCREEN Campylobacter