Gebrauchsanleitung. Die Multiparameter PCR-Analytik zur Identifikation chromosomaler Aberrationen der Akuten Myeloischen Leukämie

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1 Gebrauchsanleitung Die Multiparameter PCR-Analytik zur Identifikation chromosomaler Aberrationen der Akuten Myeloischen Leukämie In-vitro-diagnostisches Medizinprodukt xxx* Chargenbezeichnung Biotype Diagnostic GmbH Moritzburger Weg 67 D Dresden Deutschland *xxx definiert die Packungsgröße Made in Germany

2 2 Biotype Diagnostic GmbH entwickelt, produziert und vertreibt PCR-basierte Anwendungen für die medizinische Diagnostik. Unsere Mentype Test Kits garantieren höchste Qualitätsstandards für Klinik und Forschung. Für Informationen und Anregungen stehen wir Ihnen gerne zur Verfügung. Kontaktieren Sie uns oder besuchen Sie unsere Homepage

3 3 Produktbeschreibung Der Nachweis spezifischer chromosomaler Aberrationen ist von großer prognostischer Bedeutung und daher unerlässlich für die Diagnostik akuter Leukämien. Die Identifikation der spezifischen genetischen Translokationen erlaubt die Klassifizierung der Subtypen der Leukämie und unterstützt somit die risikoadaptierte Therapie der Patienten. Das Kit erlaubt die robuste, in der Routinediagnositik leicht durchzuführende, Identifizierung therapierelevanter chromosomaler Aberrationen, die der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) zu Grunde liegen. Der identifiziert in einem Multiparameteransatz 34 Transkriptvarianten der im Folgenden aufgeführten Fusionsgene: AML1-ETO, BCR-ABL, CALM-AF10, CBFB-MYH11, DEK-CAN, MLL-AF6, MLL-AF9, MLL-ELL, MLL-PTD, NPM1-MLF1 und PML-RARA (vlg. auch Tabelle1). Die Ergebnisse des sind durch zwei interne Kontrollen gesichert. Die interne PCR-Kontrolle (Quality Sensor QS-Control ) zeigt den Erfolg der Amplifikationsreaktion an; eine cdna Kontrolle (ABL-Control) ist dem Kit beigefügt, um die Qualität der eingesetzen cdna abzubilden. Bei diesem Test handelt es sich um eine Fragmentlängenanalyse mittels Kapillargelelektrophorese. Die Primer sind mit den Fluoreszenzfarbstoffen 6-FAM, BTG oder BTY markiert. Das Kit wurde auf folgenden Geräten validiert: GeneAmp 9700 Silber Thermocycler, Eppendorf Mastercycler ep-s, Biometra T1, ABI PRISM 310, ABI PRISM 3130 und 3500 Genetic Analyzer mit POP-4 und POP-7. Die Entwicklung, die Herstellung und der Vertrieb der Produkte ist nach DIN EN ISO zertifiziert.

4 4 Inhaltsverzeichnis 1. Beschreibung des PCR Amplifikation Ansetzen des Master Mixes PCR-Amplifikationsparameter Elektrophorese am ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Matrixerstellung Probenvorbereitung Einstellung der Data Collection Software Elektrophorese am ABI PRISM 3100-Avant/ 3100 Genetic Analyzer Spektralkalibrierung / Matrixerstellung Probenvorbereitung Einstellung der Data Collection Software Elektrophorese am ABI PRISM 3130/3130xl Genetic Analyzer Spektralkalibrierung / Matrixerstellung Probenvorbereitung Einstellung der Data Collection Software Elektrophorese mit ABI PRISM 3500/3500xL Genetic Analyzer Spektralkalibrierung / Matrixerstellung Probenvorbereitung Einstellungen für den Run Auswertung Analyse Parameter / Analyse Methode Biotype Auswertevorlagen Kontrollen Fragmentlängen und Aberrationen Interprätation der Ergebnisse Referenzen Erklärung der Symbole... 45

5 5 A Analytische Validierung A a) Festlegung der Standardreaktion und chargenspezifischer Toleranzen A b) Testung der Genauigkeit der Messung A c) Testung der analytischen Spezifität A c) a) Testung der analytischen Spezifität anhand negativ vortypisierter cdnas A c) b) Testung der analytischen Spezifität anhand positiv vortypisierter cdna A d) Testung der analytischen Sensitivität A e) Testung verschiedener PCR-Thermocycler A f) Testung des Einflusses verschiedener Annealingtemperaturen in der PCR A g) Testung verschiedener PCR-Pufferchargen A h) Haltbarkeit nach Anbruch B Klinische Leistungsdaten B a) Probenahme, ethische und regulatorische Aspekte B b) Vergleichstestung B c) DNA-Extraktion und Aufreinigung B d) Ergebnisse B e) Literatur zu den Biomarkern und deren DNA-Sequenzen... 53

6 6 1. Beschreibung des Tabelle 1. Nachgewiesene chromosomale Aberrationen und Varianten Chromosomale Gen-Fusionen Aberrationen Varianten AML1-ETO t(8;21) (q22;q22) - BCR-ABL t(9;22) (q34;q11) e1a3 e1a2 b3a2 b3a3 b2a2 b2a3 CALM-AF10 t(10;11) (p13;q14) AF10_240-CALM_1987 AF10_240-CALM_2092 CBFB-MYH11 inv(16) (p13;q22) Type A Type B Type C Type D Type E Type F Type G Type H Type I Type J DEK-CAN t(6;9) (p23;q34) - MLL-AF6 t(6;11) (q27;q23) - MLL-AF9 t(9;11) (p22;q23) 6A_(THP-1) 7A_(10A) 8A_(MM6) 6B_(9B) MLL-ELL t(11;19) (q23;p13.1) e10e2 e10e3 MLL-PTD Partial Tandem Duplication e9e3 e10e3 e11e3 NPM1-MLF1 t(3;5) (q25.1;q34) - PML-RARA t(15;17) (q22;q21) bcr1 (PR-L) bcr2 (PR-V) bcr3 (PR-S) Tabelle 2. Interne Qualitätskontrollen des Qualitätskontolle Interne PCR-Kontrolle (QS-Control) cdna-kontrolle (ABL-Control) Bedeutung Zeigt die Qualität der erfolgten PCR Zeigt die Qualität des cdna Templates

7 7 Kit Inhalt (100 Reaktionen) Nuklease-freies Wasser / Nuclease-free water 3.0 ml Reaktionsgemisch A / Reaction mix A 500 µl Primergemisch / Primer mix 250 µl Multi Taq2 DNA Polymerase / Multi Taq2 DNA polymerase 40 µl Kontroll cdna KASUMI-1 / Control cdna KASUMI-1 (500 ng/µl) 10 µl DNA Längenstandard 550 (BTO) / DNA Size Standard 550 (BTO) 50 µl Allelleiter / Allelic ladder 25 µl Bestellinformationen 10 Reaktionen Kat.No Reaktionen Kat.No Reaktionen Kat.No Lagerung Lagern Sie alle Komponenten bei -20 C das wiederholte Auftauen und Einfrieren sollte vermieden werden. Das Primergemisch und die Allelleiter sollten lichtgeschützt aufbewahrt werden. Die Kontroll-cDNA und die post-pcr Reagenzien (Allelleiter und DNA-Längenstandard) sollten getrennt von den PCR Reagenzien gelagert werden. Die Haltbarkeit des Testkits ist auf dem Verpackungsetikett angegeben. Zusätzliche Reagenzien Für die PCR-Amplifikation und Probenvorbereitung benötigen Sie neben den im Testkit enthaltenen Bestandteilen folgende Reagenzien: Reagenzien Lieferant Bestellnummer Hi-Di Formamide, 25 ml Life Technologies Corporation Matrix Standards BT5 single-capillary instruments (5x25 µl) Biotype Diagnostic GmbH Matrix Standards BT5 multi-capillary instruments (25 µl) Biotype Diagnostic GmbH Matrix Standards BT5 multi-capillary instruments (50 µl) Biotype Diagnostic GmbH

8 8 Warnungen und Sicherheitshinweise Folgende potenziell gefährliche Substanz ist in diesem Testkit enthalten: Kitbestandteil Chemikalie Gefahr Reaktionsgemisch Natriumazid NaN3 giftig beim Verschlucken, entwickelt bei Berührung mit Säure giftige Gase Bitte beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt. Für Biotype Kitkomponenten sind die Sicherheitsdatenblätter auf Anfrage erhältlich. Für Sicherheitsdatenblätter von Reagenzien, die nicht im Testkit enthalten sind, kontaktieren Sie bitte den jeweiligen Hersteller. Qualitätssicherung Der gesamte Inhalt des Testkits wird einer intensiven Qualitätssicherung durch die Biotype Diagnostic GmbH unterzogen. Die Qualität der Testkits wird kontinuierlich überprüft, um die uneingeschränkte Verwendbarkeit zu belegen. Bitte kontaktieren Sie uns in allen Fragen zur Qualitätssicherung. Warenzeichen und Patente Mentype ist eingetragenes Warenzeichen der Biotype Diagnostic GmbH. ABI PRISM, GeneMapper, GeneAmp and Applied Biosystems sind eingetragene Warenzeichen der Applied Biosystems LLC. POP-4, POP-7 sind in Europa eingetragene Warenzeichen der Life Technologies Corporation USA. Die PCR ist patentrechtlich geschützt. Patentinhaber sind die Firmen Roche Molecular Systems und F. Hoffmann-La Roche (Roche).

9 9 Überblick der Arbeitsschritte bis zur Diagnose Probennahme RNA Isolation cdna Synthese Multiplex-PCR Amplifikation Fragmentlängen Analyse Auswertung Abb. 1 Von der Probennahme bis zur Auswertung - Identifizierung relevanter Fusionsgene mit der Anwendung.

10 9 2. PCR Amplifikation 2.1 Ansetzen des Master Mixes Die folgende Tabelle zeigt die Volumina der eingesetzten Kitbestandteile bei 1.0 µl Probenvolumen (Template-cDNA) in einem Reaktionsvolumen von 25 µl. Berücksichtigen Sie bei der Anzahl der anzusetzenden Reaktionen die Positiv- und Negativkontrolle. Fügen Sie der Gesamtanzahl ein oder zwei Reaktionen hinzu, um Pipettierfehler zu kompensieren. Komponenten Menge Nuklease-freies Wasser 16.1 µl Reaktionsgemisch A* 5.0 µl Primergemisch 2.5 µl Multi Taq2 DNA Polymerase (hot start, 2.5 U/µl) 0.4 µl Gesamtmenge des Mastermixes 24.0 µl * enthält Mg 2+, dntps, BSA Alle Reagenzien sollten vor dem Ansetzen des Master Mixes gemischt (Vortex) und kurz zentrifugiert werden (ca. 10 s). Da der Erfolg der Multiplex-PCR Analyse maßgeblich von der Qualität und Quantität des eingesetzten cdna Templates abhängt, empfehlen wir standardisierte und bereits validierte Methoden bei der Probennahme, der RNA-Isolierung sowie bei der RNA in cdna Transkription zum Einsatz zu bringen (z.b. Protokolle des Europe Against Cancer Programm, EAC). Die Konzentration der cdna ist von der Qualität und Quantität der zuvor isolierten RNA abhängig. Bei Referenzproben aus Zellkulturmaterial ist der Einsatz von 1 µl cdna ausreichend, wenn für die cdna-synthese 1 µg RNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 µl eingesetzt wurde. Die Menge des cdna-templates kann im Falle von kritischen Patientenproben erhöht werden. Maximal sollte 1/10 Volumen der RT-Reaktion eingesetzt werden. Das Volumen an nukleasefreiem Wasser ist so zu korrigieren, dass das Gesamtvolumen des PCR-Ansatzes immer 25 µl beträgt. Die Primergemische sind so eingestellt, dass bei 25 PCR-Zyklen in einem Reaktionsvolumen von 25 µl ausgewogene Peakhöhen erreicht werden. Die Peakhöhe der internen ABL-Kontrolle sollte dabei den spezifizierten Messbereich des Gerätes nicht überschreiten. Positivkontrolle Für die Positivkontrolle verdünnen Sie die Kontroll-cDNA KASUMI-1 auf 250 ng/µl in dem entsprechenden Volumen. Pipettieren Sie die verdünnte Kontroll-cDNA anstelle der Template-cDNA in die Reaktionsgefäße mit dem vorgelegten PCR Master Mix. Negativkontrolle Als Negativkontrolle pipettieren Sie Nuklease-freies Wasser an Stelle der TemplatecDNA in die Reaktionsgefäße mit dem vorgelegten PCR Master Mix.

11 11 Template-cDNA In Abhängigkeit von der angewandten Quantifizierungsmethode kann der Messwert der cdna-konzentration variieren, so dass die optimale cdna-menge ggf. anzugleichen ist. 2.2 PCR-Amplifikationsparameter Um die Multi Taq2 DNA Polymerase zu aktivieren und die Bildung von unspezifischen Amplifikationsprodukten zu unterdrücken, sollte unbedingt ein hot start durchgeführt werden. Die Zyklenzahl ist abhängig von der eingesetzten cdna-menge. Für alle Proben werden 25 PCR-Zyklen empfohlen. Für Referenzproben aus Zellkulturmaterial (hohe cdna- Konzentration) empfehlen wir eine Reduzierung der PCR-Zyklen auf 22 Zyklen. Für kritische Patietenproben (geringe cdna-konzentration) werden für eine optimale Signalintensität bis zu 28 Zyklen empfohlen. Um die optimale Anzahl der benötigten PCR Zyklen zu ermitteln, kann die intere ABL- Kontrolle als Referenz verwendet werden. Im Resultat sollte die Peakhöhe den spezifizierten Messbereich des Gerätes nicht überschreiten (z.b. 500 bis 5000 RFU am ABI3130). Aufgrund zu geringer cdna-konzentration kann es zu statistischen Ausfällen (Allelic Dropouts) und unausgewogenen Peakhöhen kommen. Mit zunehmender Zyklenzahl steigt die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikationsprodukte. Anmerkung: Für eine optimale Kitbalance empfehlen wir die Heiz- und Kühlraten der PCR-Geräte auf ca. 4 C/s einzustellen. Standard Methode Empfohlen für alle cdna Proben Temperatur Zeit 96 C 4 min (hot start für Aktivierung der Multi Taq2 DNA Polymerase) 96 C 30 s 61 C 120 s 25 Zyklen 72 C 75 s 68 C 10 min* 10 C bis zum Ende Optional Empfohlen für cdna positive Kontrollen aus Zellkultur Temperatur Zeit 96 C 4 min (hot start für Aktivierung der Multi Taq2 DNA Polymerase) 96 C 30 s 61 C 120 s 22 Zyklen 72 C 75 s 68 C 10 min* 10 C bis zum Ende

12 12 Optional Empfohlen für kritische Patietenproben Temperatur Zeit 96 C 4 min (hot start für Aktivierung der Multi Taq2 DNA Polymerase) 96 C 30 s 61 C 120 s max. 28 Zyklen 72 C 75 s 68 C 10 min* 10 C bis zum Ende * Sollten erhöhte Anteile an -Adenin Peaks (-1bp) auftreten, kann dieser Schritt auf max. 60 min ausgedehnt werden.

13 13 3. Elektrophorese am ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Allgemeine Anweisungen zum Analysegerät, der Matrixerstellung und der Anwendung der GeneMapper Software können der entsprechenden Anleitung ABI PRISM 310 Genetic Analyzer User s Manual entnommen werden. Im Folgenden wird die Elektrophorese mit der GeneMapper ID-X Software beschrieben. Für den kombinierten Einsatz der fünf Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, BTG, BTY, BTR und BT0 ist die Nutzung des virtuellen Filter Sets G5 vorgesehen (der Matrix Standard wird im Folgenden als BT5 bezeichnet). Material Kapillare Polymer Puffer 47 cm / 50 µm (grün) POP-4 for 310 Genetic Analyzer 10 x Genetic Analyzer Buffer with EDTA 3.1 Matrixerstellung Vor der Durchführung der Fragmentlängenanalyse mit dem Filter Set G5 muss zunächst eine Matrix mit PCR-Fragmenten der entsprechenden fünf Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, BTG, BTY, BTR und BTO für das jeweilige Analysegerät erstellt werden. Farbe Blue (B) Green (G) Yellow (Y) Red (R) Orange (O) Matrix Standard 6-FAM BTG BTY BTR BTO Zur Erstellung von geeigneten Matrix-Files werden fünf Elektrophoresen unter den gleichen Bedingungen ausgeführt wie sie auch für Proben und Allelleitern des Testkits gelten. Für die fünf verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, BTG, BTY, BTR und BTO muss jeweils ein eigener Elektrophoreselauf durchgeführt werden. Matrix Probe Komponenten Volumen Hi-Di Formamide 12.0 µl Matrix Probe 1 Matrix Standard 6-FAM 1.0 µl Matrix Probe 2 Matrix Probe 3 Matrix Probe 4 Hi-Di Formamide 12.0 µl Matrix Standard BTG 1.0 µl Hi-Di Formamide 12.0 µl Matrix Standard BTY 1.0 µl Hi-Di Formamide 12.0 µl Matrix Standard BTR 1.0 µl Hi-Di Formamide 12.0 µl Matrix Probe 5 Matrix Standard BTO 1.0 µl - 3 min denaturieren bei 95 C - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen - Probenliste Sample Sheet erstellen, 5 Dyes auswählen und Proben bezeichnen

14 14 Injektionsliste für die Matrixerstellung Parameter Einstellung Module File GS STR POP-4 (1 ml) G5 Matrix File NONE Size Standard* NONE Injection [s] 5 Injection [kv] 15.0 Run [kv] 15.0 Run [ C] 60 Run Time [min] 24 * Matrix Standards sind immer ohne DNA Längenstandard (BTO) vorzubereiten Analyse der Matrix Proben - Starten der GeneMapper Software - File Add Samples to Project (Ordner des entsprechenden Laufs öffnen) - Probenordner im linken Bildbereich aufklicken - Markieren der Matrix Probe Raw Data (im rechten Bildbereich) - Bewerten Sie, ob eine stabile Basislinie vorhanden ist. Wie in der Abbildung gezeigt sollten mindestens fünf Peaks mit Peakhöhen von RFU (Y-Achse) in jeder Matrix Probe erkennbar sein (optimaler Bereich: RFU) 2900 Data Points (X) 5400 Abb. 1 Elektropherogramm der Rohdaten des Matrix Standards 6-FAM - Auswahl des Analysebereichs mit stabiler, ebener Basislinie - Falls die Basislinie zu unruhig ist, injizieren Sie die Matrix Probe noch einmal - Notieren Sie Anfangs- und Endpunkte (Data Points) des Auswahlbereiches, z.b. Anfangswert 2900, Endwert Berechnen Sie den Differenzwert, z.b = 2500 Data Points

15 15 Neue Matrix erstellen - Tools GeneMapper Manager Matrices New - Benennung der Matrix z. B. Matrix BT5 - unter Matrix Settings Matrix Proben für jede Farbe (B, G, Y, R, O) importieren (Klick auf Farbsymbol) Abb. 2 Matrix Proben auswählen - Jeweiligen Anfangspunkt bei Start At eintragen, z.b Errechneten Differenzwert z.b bei Points eintragen

16 16 Abb. 3 Neue Matrix BT5 - mit Create wird die neue Matrix berechnet - mit OK wird die neue Matrix gespeichert Matrix prüfen Bitte überprüfen Sie die neue Matrix mit Ihren aktuellen Proben. - File Add Samples to Project (Ordner des entsprechenden Laufs öffnen) Add Sample Files - wählen Sie in der Sample Tabelle die neu generierte Matrix aus - Proben neu analysieren Mit der neuen Matrix sollten keine Überstrahlungen (Pull-up Peaks) zwischen den verschiedenen Farbpanels (B, G, Y, R, O) auftreten.

17 Probenvorbereitung Komponenten Volumen Hi-Di Formamide 12.0 µl DNA Size Standard 550 (BTO) 0.5 µl 12 µl des Gemisches für alle Proben vorlegen 1 µl PCR-Produkt (ggf. verdünnt) bzw. Allelleiter zugeben - 3 min denaturieren bei 95 C - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen Die Raumtemperatur kann das Laufverhalten der PCR-Produkte stark beeinflussen und bei zu geringer Temperatur zum Auftreten von Doppelpeaks (Split Peaks) führen. Unter Umständen nimmt die Temperatur auch Einfluss auf die Laufgeschwindigkeit der Fragmente. Bitte achten Sie darauf, dass die vom Gerätehersteller empfohlene Arbeitstemperatur eingehalten wird. Optimal sind stabile Raumtemperaturen >22 C. Signalintensitäten Möglichkeiten zur Erhöhung der Signalintensitäten: - Reduzierung der Anteile am DNA Längenstandard 550 (BTO) auf Peakhöhen von ca. 500 relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) - Aufreinigung der PCR-Produkte vor der Analyse 3.3 Einstellung der Data Collection Software - Probenliste Sample Sheet erstellen und Proben bezeichnen Injektionsliste Parameter Einstellungen Module File GS STR POP-4 (1 ml) G5 Matrix File z.b. Matrix BT5 Size Standard z.b. SST-BTO_60-550bp Injection [s]* 5 Injection [kv] 15.0 Run [kv] 15.0 Run [ C] 60 Run Time [min]** 28 * Abweichend von der Standardeinstellung kann die Injektionszeit je nach Probe zwischen 1 und 20 s betragen. Handelt es sich um Vergleichsproben mit sehr hohen Peakhöhen, kann zur Vermeidung von Überstrahlungen eine kürzere Injektionszeit gewählt werden. Bei geringen cdna Mengen bzw. kritischem Patientenmaterial können bis zu 20 s notwendig sein. ** Abhängig von den Analysebedingungen sollte die Run Time für so angepasst werden, dass Fragmente bis zu einer Länge von 550 bp analysiert werden können.

18 18 4. Elektrophorese am ABI PRISM 3100-Avant/3100 Genetic Analyzer Allgemeine Anweisungen zum Analysegerät, zur Spektralkalibrierung und der Anwendung der ABI PRISM 3100 Data Collection Software Version 1.01 oder 1.1 sowie der GeneScan Software können dem entsprechenden ABI PRISM Avant/3100 Genetic Analyzer User s Manual entnommen werden. Für Systeme mit der Data Collection Software 2.0 oder 3.0 siehe Kapitel 6. Das 4-Kapillarsystem trägt die Bezeichnung ABI 3100-Avant, das 16-Kapillarsystem heißt ABI Für den kombinierten Einsatz der fünf Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, BTG, BTY, BTR und BT0 ist die Nutzung des virtuellen Filter Sets G5 vorgesehen (der Matrix Standard wird im Folgenden als BT5 bezeichnet). Material Kapillare* 36 cm Capillary Array for 3100-Avant/3100 Polymer* POP-4 Polymer for 3100 Puffer 10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA *andere Geräteeinstellungen sind möglich 4.1 Spektralkalibrierung / Matrixerstellung Vor der Durchführung der Fragmentlängenanalyse muss zunächst eine Spektralkalibrierung am ABI PRISM 3100-Avant/3100 Genetic Analyzer durchgeführt werden. Auf diese Weise wird eine Matrix erstellt, die das Überlappen der farbspezifischen Fluoreszenzemissionsspektren korrigiert. Die Spektralkalibrierung gliedert sich in die folgenden Abschnitte: - Vorbereitung des Matrix Standards zur Spektralkalibrierung - Laden des Standards in die 96-Well Platte (je Kapillare eine Probe) - Plattenzusammensetzung eingeben - Durchführung des Laufs zur Spektralkalibrierung und prüfen der Matrix Vorbereitung des Matrix Standards zur Spektralkalibrierung Beispiel für 4 Kapillaren/ABI 3100-Avant Komponenten Volumen Hi-Di Formamide 60.0 µl Matrix Standard BT5 5.0 µl - 12 μl des Gemisches in 96-Well Platte laden, z.b. Position A1-D1-3 min denaturieren bei 95 C - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen Beispiel für 16 Kapillaren/ABI 3100 Komponenten Volumen Hi-Di Formamide µl Matrix Standard BT µl - 12 μl des Gemisches in 96-Well Platte laden, z.b. Position A1-H1 und A2-H2-3 min denaturieren bei 95 C - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen

19 19 Durchführung der Spektralkalibrierung Um eine erfolgreiche Kalibrierung mit der Data Collection Software Version oder 1.1 durchzuführen, müssen zunächst einmalig die Parameter der Spectral Calibration für DyeSetG5 verändert werden. Spectral Parameter - Änderung der Parametereinstellungen unter dem Pfad: D:\AppliedBio\Support Files\Data Collection Support Files\ CalibrationData\Spectral Calibration\ ParamFiles - MtxStd{Genescan_SetG5} auswählen, um die PAR-Datei zu öffnen - Änderung des Condition Bounds Range auf [1.0;20.0] - File Save As auswählen, um die Parameter Datei unter einem neuen Namen zu speichern, z.b. MtxStd{Genescan_SetG5_BT5}.par Verwenden Sie für die Spektralkalibrierung mit dem Biotype Matrix Standard BT5 immer die soeben erstellte Parameter Datei. Platteneditor zur Spektralkalibrierung (I) - Die vorbereitete 96-Well Platte in den Autosampler setzen - Öffnen der ABI PRISM 3100 Data Collection Software - Im Plate View der 3100 Data Collection Software auf New klicken, um den Plate Editor Dialog zu öffnen - Name der Platte eingeben - Spectral Calibration auswählen - 96-Well als Plattentyp auswählen und Finish wählen Platteneditor zur Spektralkalibrierung (II) Parameter Sample Name Dye Set Spectral Run Module Spectral Parameters Einstellung Benennen der Matrixproben G5 Default (z.b. Spect36_POP4) MtxStd{GeneScan_SetG5_BT5}.par (Parameter zuvor erstellt) - In die oberste Zelle der Tabelle klicken, um die gesamte Spalte auszuwählen, über Edit Fill Down die Informationen den ausgewählten Matrixproben zufügen und mit OK bestätigen - Verknüpfen der 96-Well Platte mit der soeben erstellten Plattenbezeichnung mit dem Autosampler und den Lauf starten - Nach dem Lauf unter Spectral Calibration Result prüfen ob alle Kapillaren erfolgreich kalibriert wurden (Kennzeichnung A). Bei Kennzeichnung X sind die Anweisungen im ABI PRISM Genetic Analyzer User s Manual zu beachten - Auf OK klicken, um den Lauf zu bestätigen

20 20 Matrix prüfen - Wähle Tools Display Spectral Calibration Dye Set G5, um die Spektralkalibrierung jeder Kapillare zu kontrollieren - Jede Kapillare sollte einen Qualitätswert (Q Value) von mindestens 0.95 sowie eine Konditionszahl (C Value) zwischen 1 und 20 haben. Beide Werte müssen im zuvor festgelegten Bereich liegen - Bewerten Sie, ob eine stabile Basislinie vorhanden ist. Es müssen fünf Peaks mit Peakhöhen von RFU (Y-Achse) in jeder Kapillare erkennbar sein (optimaler Bereich: RFU) - Bitte überprüfen Sie die neue Matrix mit Ihren aktuellen Proben. Mit der neuen Matrix sollten keine Überstrahlungen (Pull-up Peaks) zwischen den verschiedenen Farbpanels (B, G, Y, R, O) auftreten - Haben alle Kapillaren die Kalibrierung erfolgreich durchlaufen, muss die aktuelle Kalibrierungsdatei für das Dye Set G5 unter Tools Set Active Spectral Calibration manuell aktiv gesetzt werden. Eine Umbenennung ist über Set Matrix Name möglich (z.b. BT5_Datum der Kalibrierung) - War die Kalibrierung nicht erfolgreich, versuchen Sie die Proben mit einer höheren Injektionszeit oder Stromstärke zu reinjizieren. Dazu ist eine Änderung des Spectral Run Modules erforderlich. Sie können Proben bis zu dreimal reinjizieren. Anderenfalls können sie auch mehr Matrix Standard für die Kalibrierung einsetzen. 4.2 Probenvorbereitung Komponenten Volumen Hi-Di Formamide 12.0 µl DNA Size Standard 550 (BTO) 0.5 µl 12 µl des Gemisches in 96-Well Platte für alle Proben vorlegen 1 µl PCR-Produkt (ggf. verdünnt) oder Allelleiter zugeben - 3 min denaturieren bei 95 C - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen Da die Injektion gleichzeitig an allen Kapillaren stattfindet, müssen am Mehrkapillargerät immer 4 oder 16 Proben auf der Platte pipettiert werden. Falls weniger Proben zu messen sind, müssen die probenfreien Positionen mit 12 µl Hi-Di Formamide aufgefüllt werden. Um eine sichere Allelzuordnung am Mehrkapillargerät zu gewährleisten, sollten unabhängig von der Probenanzahl mehrere Allelleitern mitlaufen. Die Raumtemperatur kann das Laufverhalten der PCR-Produkte an Mehrkapillargeräten stark beeinflussen und bei zu geringer Temperatur zum Auftreten von Doppelpeaks (Split Peaks) führen. Unter Umständen nimmt die Temperatur auch Einfluss auf die Laufgeschwindigkeit der Fragmente. Bitte achten Sie darauf, dass die vom Gerätehersteller empfohlene Arbeitstemperatur eingehalten wird. Optimal sind stabile Raumtemperaturen >22 C.

21 21 Signalintensitäten Möglichkeiten zur Erhöhung der Signalintensitäten: - Reduzierung des Anteiles am DNA Längenstandard 550 (BTO) auf Peakhöhen von ca. 500 relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) - Aufreinigung der PCR Produkte vor der Analyse 4.3 Einstellung der Data Collection Software Vor dem ersten Lauf muss das voreingestellte Run Modul im Dye Set G5 einmalig editiert werden: - Zum Öffnen der Dialog Box auf Module Editor klicken - Aus der Tabelle GeneScan das entsprechende Run Module als Vorlage auswählen - Ändern Sie die Spannung (Injection Voltage) auf 3 kv und die Injektionszeit (Injection Time) auf 10 s Run Module 3kV_10s_550bp Parameter Einstellung Run Temperature [ C] Default Cap Fill Volume Default Maximum Current [A] Default Current Tolerance [A] Default Run Current [A] Default Voltage Tolerance [kv] Default Pre Run Voltage [kv] Default Pre Run Time [s] Default Injection Voltage [kv] 3.0 Injection Time [s]* 10 Run Voltage [kv] Default Number of Steps Default Voltage Step Interval Default Data Delay Time [s] Default Run Time [min]** 26 * Abweichend von der Standardeinstellung kann die Injektionszeit je nach Probe zwischen 1 und 20 s betragen. Handelt es sich um Vergleichsproben mit sehr hohen Peakhöhen, kann zur Vermeidung von Überstrahlungen eine kürzere Injektionszeit gewählt werden. Bei geringen cdna Mengen bzw. kritischem Patientenmaterial können bis zu 20 s notwendig sein. ** Abhängig von den Analysebedingungen sollte die Run Time für so angepasst werden, dass damit Fragmente bis zu einer Länge von 550 bp analysiert werden können. - Auf Save As klicken, den Namen des neuen Moduls eingeben (z.b. 3kV_10s_550bp) und mit OK bestätigen - Zum Verlassen des Run Module Editors auf Close klicken

22 22 Run starten - Die vorbereitete 96-Well Platte in den Autosampler setzen - Öffnen der ABI PRISM 3100 Data Collection Software - Im Plate View der 3100 Data Collection Software auf New klicken, um den Plate Editor Dialog zu öffnen - GeneScan auswählen - 96-Well als Plattentyp auswählen und Finish anklicke Platteneditor Parameter Sample Name Dyes Color Info Project Name Dye Set Run Module* Analysis Module 1 * Parameter siehe oben Einstellungen Benennen der Proben O Ladder or sample z.b. 3100_Project1 G5 3kV_10s_550bp DefaultAnalysis.gsp - Vervollständigen der Tabelle im Plate Editor und OK wählen - In die oberste Zelle der Tabelle klicken, um die gesamte Spalte auszuwählen und Edit Fill Down wählen, um die Informationen der ausgewählten Probe zuzuordnen - Verknüpfen der 96-Well Platte mit der soeben erstellten Plattenbezeichnung mit dem Autosampler und den Lauf starten - Nach dem Lauf sind die Daten als Color Data in Array View der 3100 Data Collection Software oder als Analyzed Sample Files unter dem Pfad D:/AppliedBio/3100/DataExtractor/ExtractRuns vorzufinden

23 23 5. Elektrophorese am ABI PRISM 3130/3130xl Genetic Analyzer Allgemeine Anweisungen zum Analysegerät, zur Spektralkalibrierung und der Anwendung der ABI PRISM Data Collection Software Version 3.0 und der GeneMapper ID/ID-X Software können der entsprechenden Anleitung ABI PRISM 3130/3130xl Genetic Analyzers Getting Started Guide entnommen werden. Das 4-Kapillarsystem trägt die Bezeichnung ABI 3130, das 16-Kapillarsystem heißt ABI 3130xl. Für den kombinierten Einsatz der fünf Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, BTG, BTY, BTR und BT0 ist die Nutzung des virtuellen Filter Sets Any5Dye vorgesehen (der Matrix Standard wird im Folgenden als BT5 bezeichnet). Material Kapillare* 36 cm Capillary Array for 3130/3130xl Polymer* POP-4 Polymer for 3130 Buffer 10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA *andere Geräteeinstellungen sind möglich 5.1 Spektralkalibrierung / Matrixerstellung Vor der Durchführung der Fragmentlängenanalyse muss zunächst eine Spektralkalibrierung mit PCR-Fragmenten der entsprechenden fünf Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, BTG, BTY, BTR und BTO für das jeweilige Analysegerät durchgeführt werden. Auf diese Weise wird eine Matrix erstellt, die das Überlappen der farbspezifischen Fluoreszenzemissionsspektren korrigiert. Die Spektralkalibrierung gliedert sich in die folgenden Abschnitte: - Vorbereitung des Matrix Standards zur Spektralkalibrierung - Laden des Standards in die 96-Well Platte (je Kapillare eine Probe) - Erstellung des Instrument Protocol zur Spektralkalibrierung (Protocol Manager) - Plattenzusammensetzung im Platteneditor festlegen (Plate Manager) - Durchführung des Laufs zur Spektralkalibrierung und prüfen der Matrix Vorbereitung der Matrix Standards zur Spektralkalibrierung Beispiel für 4 Kapillaren/ABI 3130 Komponenten Volumen Hi-Di Formamide 60.0 µl Matrix standard BT5 5.0 µl - 12 μl des Gemisches in 96-Well Platte laden, z.b. Position A1-D1-3 min denaturieren bei 95 C - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen

24 24 Beispiel für 16 Kapillaren/ABI 3130xl Komponenten Volumen Hi-Di Formamide µl Matrix standard BT µl - 12 μl des Gemisches in 96-Well Platte laden, z.b. Position A1-H1 und A2-H2-3 min denaturieren bei 95 C - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen Durchführung der Spektralkalibrierung - Die vorbereitete 96-Well Platte in den Autosampler setzen - Im Protocol Manager der Data Collection Software im Fenster Instrument Protocol auf New klicken, um den Protocol Editor zu öffnen Instrument-Protocol zur Spektralkalibrierung Protocol Editor Name Type Dye Set Polymer* Array Length* Chemistry Run Module* Einstellungen User (e.g. Spectral36_POP4_BT5) SPECTRAL Any5Dye User (e.g. POP4) User (e.g. 36cm) Matrix Standard Default (z.b. Spect36_POP4_1) * Richtet sich nach dem verwendeten Polymertyp und der Kapillarlänge - OK wählen, um den Protocol Editor zu verlassen - Im Plate Manager der Data Collection Software auf New klicken, um New Plate Dialog zu öffnen Platteneditor zur Spektralkalibrierung (I) New Plate Dialog Name Application Plate Type Owner Name / Operator Name Einstellungen z.b. Spectral_BT5_date Spectral Calibration 96-Well - OK wählen. Auf diese Weise öffnet sich automatisch eine neue Tabelle im Platteneditor Platteneditor zur Spektralkalibrierung (II) Parameter Einstellungen Sample Name Benennen der Matrixproben Priority z.b. 100 Instrument Protocol 1 Spectral36_POP4_BT5 (Einstellung zuvor beschrieben)

25 25 - In die oberste Zelle der Tabelle klicken, um die gesamte Spalte auszuwählen, über Edit Fill Down diese Information den ausgewählten Matrixproben zufügen und mit OK bestätigen - In Run Schedule Find All anklicken, dann Link wählen, um die 96-Well Platte mit der soeben erstellten Plattenbezeichnung mit dem Autosampler zu verknüpfen (Position A oder B). Anschließend den Lauf starten Abb. 5 Elektropherogramm der Spektralkalibrierung mit Matrix Standards BT5 am ABI 3130 Matrix prüfen - Jede Kapillare sollte einen Qualitätswert (Q Value) von mindestens 0.95 sowie eine Konditionszahl (Condition number range) zwischen 1 und 20 haben. - Bewerten Sie ob eine stabile Basislinie vorhanden ist. Es müssen fünf Peaks mit Peakhöhen von RFU (Y-Achse) in jeder Kapillare erkennbar sein (optimaler Bereich: RFU), siehe Abbildung. - Bitte überprüfen Sie die neue Matrix mit Ihren aktuellen Proben. Mit der neuen Matrix sollten keine Überstrahlungen (Pull-up Peaks) zwischen den verschiedenen Farbpanels (B, G, Y, R, O) auftreten. - Haben alle Kapillaren die Kalibrierung erfolgreich durchlaufen, wird die Kalibrierungsdatei für das Any5Dyes im Spectral Viewer automatisch aktiv gesetzt. Eine Umbenennung ist über Rename möglich (z.b. BT5_Datum der Kalibrierung). - War die Kalibrierung nicht erfolgreich, wiederholen Sie die Injektion mit einer erhöhten Injektionszeit oder einer erhöhten Injektionsspannung. Dafür müssen Änderungen am Run Module für die Spektralkalibrierung vorgenommen werden. Sie können die gleichen Proben bis zu drei Mal reinjizieren. Anderenfalls können sie auch mehr Matrix Standard für eine erneute Spektralkalibrierung verwenden.

26 Probenvorbereitung Komponente Volumen Hi-Di Formamide 12.0 µl DNA Size Standard 550 (BTO) 0.5 µl 12 µl des Gemisches (Formamid+ Längenstandard) für alle Proben vorlegen 1 µl PCR-Produkt (ggf. verdünnt) oder Allelleiter zugeben - 3 min denaturieren bei 95 C - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen Da die Injektion gleichzeitig an allen Kapillaren stattfindet, müssen am Mehrkapillargerät immer 4 oder 16 Proben auf der Platte pipettiert werden. Falls weniger Proben zu messen sind, müssen die probenfreien Positionen mit 12 µl Hi-Di Formamide aufgefüllt werden. Um eine sichere Allelzuordnung am Mehrkapillargerät zu gewährleisten, sollten unabhängig von der Probenanzahl mehrere Allelleitern mitlaufen. Die Raumtemperatur kann das Laufverhalten der PCR-Produkte an Mehrkapillargeräten stark beeinflussen und bei zu geringer Temperatur zum Auftreten von Doppelpeaks (Split Peaks) führen. Unter Umständen nimmt die Temperatur auch Einfluss auf die Laufgeschwindigkeit der Fragmente. Bitte achten Sie darauf, dass die vom Gerätehersteller empfohlene Arbeitstemperatur eingehalten wird. Optimal sind stabile Raumtemperaturen >22 C. Signalintensitäten Möglichkeiten zur Erhöhung der Signalintensitäten: - Reduzierung der Anteile am DNA Längenstandard 550 (BTO) auf Peakhöhen von ca. 500 relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) - Aufreinigung der PCR-Produkte vor der Analyse

27 Einstellung der Data Collection Software Vor dem ersten Probenlauf muss das Run Modul wie folgt editiert werden: - Im Module Manager der Data Collection Software auf New klicken, um den Run Module Editor zu öffnen. Run Module 3kV_10s_550bp Parameter Einstellungen Oven Temperature [ C] Default Poly Fill Volume Default Current Stability [µa] Default PreRun Voltage [kv] Default PreRun Time [s] Default Injection Voltage [kv] 3.0 Injection Time [s]* 10 Voltage Number of Steps Default Voltage Step Interval Default Data Delay Time [s] Default Run Voltage [kv] Default Run Time [s]** 1560 * Abweichend von der Standardeinstellung kann die Injektionszeit je nach Probe zwischen 1 und 20 s betragen. Handelt es sich um Vergleichsproben mit sehr hohen Peakhöhen, kann zur Vermeidung von Überstrahlungen eine kürzere Injektionszeit gewählt werden. Bei geringen cdna Mengen bzw. kritischem Patientenmaterial können bis zu 20 s notwendig sein. ** Abhängig von den Analysebedingungen sollte die Run Time für so angepasst werden, dass Fragmente bis zu einer Länge von 550 bp analysiert werden können. - Auf Save As klicken, den Namen des neuen Moduls eingeben (z.b. 3kV_10s_550bp) und mit OK bestätigen - Zum Verlassen des Run Module Editors auf Close klicken Run starten - Die vorbereitete 96-Well Platte in den Autosampler setzen - Im Protocol Manager der Data Collection Software im Fenster Instrument Protocol auf New klicken, um den Protocol Editor zu öffnen Instrument-Protocol Protocol Editor Name Type Run Module* Dye Set * Parameter siehe oben Einstellungen z.b. Run36_POP4_BT5_26min REGULAR 3kV_10s_550bp Any5Dye - OK wählen, um den Protokolleditor zu verlassen

28 28 Vor jedem Probenlauf muss die zu messende Platte wie folgt angelegt werden: - Im Plate Manager der Data Collection Software auf New klicken, um New Plate Dialog zu öffnen Platteneditor (I) New Plate Dialog Name Application Plate Type Owner Name / Operator Name Einstellungen z.b. Plate_BT5_Date wählen Sie GeneMapper Application 96-Well - OK wählen. Auf diese Weise öffnet sich automatisch eine neue Tabelle im Platteneditor Platteneditor (II) Parameter Einstellungen Sample Name Benennen der Probe Priority z.b. 100 (Default) Sample Type Sample or allelic ladder Size Standard z.b. SST-BTO_60-550bp Panel z.b. AMLplex_Panels_v2 Analysis Method z.b. AMLplex_HID_3130_200rfu Snp Set - User-defined Results Group 1 (Results Group auswählen) Instrument Protocol 1 Run36_POP4_BT5_26min (Einstellung zuvor beschreiben) - In die obersten Zellen der Tabelle klicken, um die gesamte Spalte auszuwählen, über Edit Fill Down diese Informationen den ausgewählten Proben zufügen und mit OK bestätigen. - In Run Schedule Find All anklicken, dann auf Link klicken, um die 96-Well Platte mit der soeben erstellten Plattenbezeichnung mit dem Autosampler zu verknüpfen (Position A oder B). Anschließend den Lauf starten. - Die Qualität der Rohdaten kann während des Laufs für jede einzelne Kapillare im Capillaries Viewer oder Cap/Array Viewer beobachten werden. Mögliche Fehlermeldungen (Error Status) erscheinen in Event Log. - Die Daten des Probenlaufs werden unter Run History oder Cap/Array Viewer der Data Collection Software im Überblick dargestellt. Die Laufdaten der Proben werden im Run Folder der zuvor gewählten Results Group abgelegt.

29 29 6. Elektrophorese mit ABI PRISM 3500/3500xL Genetic Analyzer Allgemeine Anweisungen zum Analysegerät, zur Spektralkalibrierung und der Anwendung der Applied Biosystems 3500 Series Data Collection Software Version 3.0 und der GeneMapper ID-X Software Version 1.4, können dem entsprechenden Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers User Guide entnommen werden. Das 8-Kapillarsystem trägt die Bezeichnung AB 3500, das 24-Kapillarsystem heißt ABI 3500xL. Für den kombinierten Einsatz der fünf Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, BTG, BTY, BTR und BT0 ist die Nutzung des virtuellen Filter Sets AnyDye vorgesehen (der Matrix Standard wird im Folgenden als BT5 bezeichnet). Material Kapillare* 36 cm Capillary Array for 3500/3500xL Polymer* POP-4 Polymer for 3500/3500xL Puffer 10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA for 3500/3500xL *andere Geräteeinstellungen sind möglich 6.1 Spektralkalibrierung / Matrixerstellung Vor der Durchführung der Fragmentlängenanalyse muss zunächst eine Spektralkalibrierung mit PCR-Fragmenten der entsprechenden fünf Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, BTG, BTY, BTR und BTO für das jeweilige Analysegerät durchgeführt werden. Auf diese Weise wird eine Matrix erstellt, die das Überlappen der farbspezifischen Fluoreszenzemissionsspektren korrigiert. Die Spektralkalibrierung gliedert sich in die folgenden Abschnitte: - Vorbereitung des Matrix Standards zur Spektralkalibrierung - Laden des Standards in die 96-Well Platte (je Kapillare eine Probe) - Vorbereitung des Instruments für die Erstellung Dye Set BT5 - Durchführung des Laufs zur Spektralkalibrierung und prüfen der Matrix Vorbereitung des Matrix Standards zur Spektralkalibrierung Beispiel für 8 Kapillaren/ABI 3500 Komponente Volumen Hi-Di Formamide µl Matrix Standard BT5 9.0 µl -12 μl des Gemisches in eine 96-Well Platte laden, z.b. Position A1-H1-3 min bei 95 C denaturieren - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen

30 30 Beispiel für 24 Kapillaren/ABI 3500xL Komponente Volumen Hi-Di Formamide µl Matrix standard BT µl -12 μl des Gemisches in eine 96-Well Platte laden, z.b. Position A1-H1, A2-H2 and A3-H3* - 3 min bei 95 C denaturieren - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen * Bei Verwendung einer 384-Well Platte sollten 10 μl des Gemisches in die Positionen 1, 3, und 5 der Reihen A, C, E, G, I, K, M, und O gegeben werden. Vorbereitung des Instruments Bitte stellen Sie sicher dass vor der Spektralkalibrierung eine Spatial Calibration erfolgt ist. Dieser Schritt ist nur nach dem Einbau eines neuen Capillary Arrays nötig. Der Prozess ist detailliert im Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers User Guide aufgeführt. Vorbereitung des Dye Set BT5 Vor der Spektralkalibrierung muss das Dye Set für den Matrix Standard BT5 eingerichtet werden. 1. In Library wählen Sie Analyze und Dye Sets und klicken dann Create. 2. Benennen Sie das Dye Set unter Dye Set Name z.b. BT5. 3. Wählen Sie Matrix Standard als Chemistry und AnyDye Template als Dye Set Template. 4. Deaktivieren Sie Purple im Feld Arrange Dyes. Vergewissern Sie sich, dass alle anderen Farben aktiviert sind. 5. Unter Calibration Peak Order müssen die Farben, wie folgt aufgeführt, zugeordnet werden: 5 blue, 4 green, 3 yellow, 2 red, and 1 orange. 6. Im Feld Parameters müssen keine Änderungen vorgenommen werden. 7. Klicken Sie Save, um die Änderungen zu bestätigen.

31 31 Abb. 6 Einstellungen für die Spektralkalibrierung des Dye Set BT5 Durchführung der Spektralkalibrierung Geben Sie die Multi-Well Platte nach Beladen mit dem Gemisch für die Spektralkalibrierung in den Autosampler und starten Sie die Spektralkalibrierung. 1. Wählen Sie Maintenance auf dem Dashboard der 3500 Series Data Collection Software, um den Spectral Calibration Screen zu öffnen. 2. Die Anzahl der Kavitäten der Multi-Well Platte sowie deren Position im Gerät muss definiert werden. 3. Wählen Sie Matrix Standard als Chemistry Standard und BT5 für das Dye Set (zuvor erstellt). 4. Aktivieren sie Allow Borrowing (optional). 5. Klicken Sie Start Run.

32 32 Abb. 7 Elektropherogramm der Spektralkalibrierung mit dem Matrix Standard BT5 auf dem ABI 3500 Instrument. Matrix prüfen -Jede Kapillare sollte einen Qualitätswert (Q Value) größer als 0.8 sowie eine Konditionszahl (Condition number range) zwischen 1 und 20 haben. - Bewerten Sie, ob eine stabile Basislinie vorhanden ist. Es müssen fünf Peaks mit Peakhöhen von RFU (Y-Achse) in jeder Kapillare erkennbar sein (optimaler Bereich: RFU), siehe Abbildung. - Eine erfolgreiche Kalibrierung wird für jede Kapillare in Overall in grün angezeigt. - Wurden alle Kapillaren erfolgreich kalibriert klicken Sie Accept Results - War die Kalibrierung nicht erfolgreich klicken Sie Reject Results. In diesem Fall verweisen wir auf das Kapitel spectral calibration troubleshooting des Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers User Guides. 6.2 Probenvorbereitung Komponente Volumen Hi-Di Formamide 12.0 µl DNA Size Standard 550 (BTO) 0.5 µl 12 µl des Gemisches (Formamid + DNA Size Standard) für alle Proben vorlegen 1 µl PCR-Produkt (ggf. verdünnt) oder Allelleiter zugeben - 3 min bei 95 C denaturieren - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen Da die Injektion gleichzeitig an allen Kapillaren stattfindet, müssen am Mehrkapillargerät immer 8 oder 24 Proben auf der Platte pipettiert werden. Falls weniger Proben zu messen sind, müssen die entsprechenden Positionen mit 12 µl Hi-Di Formamide aufgefüllt werden. Um eine sichere Allelzuordnung am Mehrkapillargerät zu gewährleisten, sollten unabhängig von der Probenanzahl mehrere Allelleitern mitlaufen.

33 33 Die Raumtemperatur kann das Laufverhalten der PCR-Produkte an Mehrkapillargeräten stark beeinflussen und bei zu geringer Temperatur zum Auftreten von Doppelpeaks (Split Peaks) führen. Unter Umständen nimmt die Temperatur auch Einfluss auf die Laufgeschwindigkeit der Fragmente. Bitte achten Sie darauf, dass die vom Gerätehersteller empfohlene Arbeitstemperatur eingehalten wird. Optimal sind stabile Raumtemperaturen >22 C. Signalintensitäten Möglichkeiten zur Erhöhung der Signalintensitäten: - Reduzierung der Anteile am DNA Längenstandard 550 (BTO) auf Peakhöhen von ca. 500 relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) - Aufreinigung der PCR-Produkte vor der Analyse 6.3 Einstellungen für den Run Für den ersten Run mit der Anwendung müssen spezifische Protokolle innerhalb der 3500 Series Data Collection Software erstellt werden. Erstellen des Instrument Protocol - In Library wählen Sie Analyze / Instrument protocol und klicken Create - Ändern Sie die Parameter wie in der Tabelle unten aufgeführt: Instrument Protocol für Parameter Einstellung Application Type HID or Fragment Capillary Length Default Polymer Default Dye Set BT5 Run Module Default Protocol Name z.b. Mentype AMLplex QS Oven Temperature [ C] Default Run Voltage [kv] Default Injection Voltage [kv] 3.0 Run Time [s]** 1560** PreRun Time [s] Default Injection Time [s]* 8* Data Delay Time [s] Default Advanced Options Default * Abweichend von der Standardeinstellung kann die Injektionszeit je nach Probe zwischen 1 und 20 s betragen. Handelt es sich um Vergleichsproben mit sehr hohen Peakhöhen, kann zur Vermeidung von Überstrahlungen eine kürzere Injektionszeit gewählt werden. Bei geringen cdna Mengen bzw. kritischem Patientenmaterial können bis zu 20 s notwendig sein. ** Abhängig von den Analysebedingungen sollte die Run Time für so angepasst werden, dass Fragmente bis zu einer Länge von 550 bp analysiert werden können. - Klicken Sie Save um die Einstellungen zu bestätigen.

34 34 Einstellungen für den Längenstandard - In Library wählen Sie Analyze / Size Standards und klicken Create - Ändern Sie die Parameter wie in der Tabelle unten aufgeführt: Parameter Size Standard Dye Color Einstellung BTO_550 Orange Der DNA Size Standard 550 (BTO) muss mit folgenden Fragmentlängen angewendet werden: 60, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 425, 450, 475, 500, 525, and 550 bp. - Klicken Sie Save, um die Einstellungen zu bestätigen. Einrichten des QC oder Size Calling Protocol - In Library wählen Sie Analyze / QC oder Size Calling Protocol und klicken Create - Ändern Sie die Parameter wie in der Tabelle unten aufgeführt: Parameter Protocol Name Size Standard Sizecaller Einstellung Name BTO_550 (vorher eingerichtet) Size Caller v In Analysis Settings / Peak Amplitude Treshold wählen Sie disable Purple. Alle anderen Farben müssen aktiviert sein. - Alle anderen Einstellungen bleiben auf Default. - Klicken Sie Save, um die Einstellungen zu bestätigen. Erstellen eines Assays - In Library wählen Sie Manage / Assays und klicken Create - Ändern Sie die Parameter wie in der Tabelle unten aufgeführt: Parameter Assay Name Color Application Type Instrument Protocol QC (Size Calling) Protocol Einstellung z.b. Mentype AMLplex QS Default HID oder Fragment z.b. Mentype AMLplex QS e.g. BTO_550 - Klicken Sie Save, um die Einstellungen zu bestätigen.

35 35 Starten des Runs - Die vorbereitete Multi-Well Platte in den Autosampler setzen - Im Dashboard der Data Collection Software klicken Sie Create New Plate - In Define Plate Properties wählen Sie Plate Details - Ändern Sie die Parameter wie in der Tabelle unten aufgeführt: Platten Details Parameter Einstellung Name z.b. Mentype AMLplex QS Number of Wells 96 or 384 Plate Type* HID oder Fragment Capillary Lenght 36cm Polymer POP4 - Klicken Sie Assign Plate Contents, um die Einstellungen zu bestätigen - Definieren Sie die Position jeder mit einer Patientenprobe oder Allelleiter belegten Kavität für die Data Collection und Auswertung - Ordnen Sie jeder benannten Kavität ein Assay (erforderlich), File Name Conventions und eine Result Group zu - Klicken Sie Link the plate for Run und geben Sie den Name des Runs ein. - Klicken Sie Start Run

36 36 7. Auswertung Allgemeine Anweisungen zur automatischen Auswertung können der entsprechenden Anleitung GeneMapper ID/ID-X Software User s Manual entnommen werden. 7.1 Analyse Parameter / Analyse Methode Die empfohlenen Analyseparameter sind: Peak Detection Algorithm Allele Ranges Smoothing and Baselining Size Calling Method Peak Detection Peak Quality Advanced No specific stutter ratio, set all to 0.0 Amelogenin cut off: 0.0 Analysis: Full Range Sizing: All Sizes Smoothing: Light Baseline Window: 51 pts Local Southern Method Peak Amplitude Thresholds B: 200 Y: 200 G:200 R:200 O:50 Min. Peak Half Width: 2 pts Polynominal Degree: 3 Peak Window Size: 15 pts** Slope Thresholds: 0.0 Heterozygote Balance: 0.0 Max expected alleles: 22 * Der Grenzwert der Peakamplituden (threshold) ist die minimale Peakhöhe, welche die GeneMapper ID/ID-X Software als einen Peak erkennt. Für den werden 200 RFU empfohlen und sollten individuell vom Analyselabor festgelegt werden. Empfehlung: Die minimale Peakhöhe sollte mindestens 3 x so hoch sein wie das Grundrauschen der Basislinie. ** Falls notwendig kann die Peak Window Size auf 11 pts verringert werden. Anmerkung: Bei der Auswertung des sollte der rote Panel ausgeblendet werden. Die Ermittlung der genauen Fragmentlängen der amplifizierten Produkte ist abhängig vom Gerätetyp, von den Elektrophoresebedingungen sowie von dem verwendeten DNA Längenstandard. Aufgrund der Komplexität einiger Loci sollten möglichst viele, gleichmäßig verteilte Referenzpunkte zur Längenbestimmung herangezogen werden. Hierzu verwenden Sie den DNA Längenstandard 550 (BTO) mit den Fragmentlängen 60, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 425, 450, 475, 500, 525 und 550 bp.

37 37 Abb. 8 Elektropherogramm des DNA Längenstandard 550 (BTO), Fragmentlängen in bp Anmerkung: Für die Auswertung und Analyse des mit der GeneMapper ID/ID-X Software kann die bereitgestellte Auswertevorlage des DNA- Längenstandards SST-BTO_60-550bp verwendet werden. 7.2 Biotype Auswertevorlagen Die Allelzuordnungen der aufgetrennten PCR-Produkte (Genotyping) kann mit Hilfe geeigneter Auswertungssoftware erfolgen, z.b. mit GeneMapper ID/ID-X Software in Kombination mit Auswertevorlagen der Biotype. Biotype Auswertevorlagen (Template Files) finden Sie auf unserer Homepage ( zum Download. Auf Anfrage senden wir Ihnen gerne eine CD-ROM. Die empfohlenen Biotype Templates für die GeneMapper ID/ID-X Software sind: Panels AMLplex_Panels_v2/v2X oder höhere Version BinSets AMLplex_Bins_v2/v2X oder höhere Version Size Standard SST-BTO_60-550bp Analysis Method AMLplex_HID_310_200rfu empfohlen AMLplex_HID_3130_200rfu empfohlen Plot Settings PlotsBT5_4dyes Table Settings Table for 10 Alleles Table for 22 Alleles Die Panels und BinSets müssen immer verwendet werden, die weiteren Auswertevorlagen sind optional. Wichtiger Hinweis: Der Import und die Allelzuordnung mit Hilfe der angebotenen Auswertevorlagen kann nur für die GeneMapper ID/ID-X Software garantiert werden. Sollten Sie GeneMapper nutzen können Probleme beim Import einiger Auswertevorlagen auftreten und Sie müssen gegebenenfalls die Panels und Bins mit einen oder mehreren Runs der Allelleiter auf Ihrem spezifischen Gerätesetup anpassen. Kontaktieren Sie unseren Support für Hilfestellungen (support@biotype.de). Allgemeine Vorgehensweise bei der Auswertung 1. Prüfen des Längenstandards (Size Standard) 2. Prüfen der Allelleiter (Allelic Ladder) 3. Prüfen der Positivkontrolle 4. Prüfen der Negativkontrolle 5. Probendaten auswerten

38 Kontrollen Das PCR Amplification Kit enthält eine cdna Kontrolle, die die folgende genetische Aberration aufweißt: Tabelle 3. cdna-kontrolle cdna aus der Zellkultur* KASUMI-1 (Asou et al. 1991) Aberration AML1-ETO *Die Zellkultur für die Erstellung der cdna wurde bezogen von: DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany. Die Verwendung dieser cdna ist ausschließlich für den vorgesehen. 7.4 Fragmentlängen und Aberrationen Tabelle 4 zeigt die Fragmentlängen der verschiedenen Varianten in Abhängigkeit des DNA Size Standards 550 (BTO). Die Analyse erfolgte mit dem ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer auf POP-4 Polymer. Bei Verwendung anderer Analysegeräte, DNA Size Standards oder Polymere kann es zur Abweichung der Fragmentlängen kommen. Wegen gerätespezifischer Unterschiede wird ein individuelles Einstellen am verwendenten Gerät (fine tuning) nach Messung der Fragmentlänge empfohlen. Zusätzlich sollte ein visueller Abgleich mit der Allelleiter vorgenommen werden. Skalierung Horizontal: bp Vertical: Abhängig von der Signalintensität

39 39 Abb. 9 Elektropherogramm des bei Ensatz der cdna Kontrolle KASUMI-1 (250 ng). Die Ananlyse wurde auf dem ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer unter Verwendung des Size Standard 550 (BTO), durchgeführt. Die Fragmentzuordnung erfolgte mit der GeneMapper ID Software sowie dem Template File.

40 40 Abb. 10 Elektropherogramm der Allelleiter). Die Ananlyse wurde auf dem ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer unter Verwendung des Size Standard 550 (BTO), durchgeführt. Die Fragmentzuordnung erfolgte mit der GeneMapper ID Software sowie dem Template File.

41 41 Tabelle 4. Fragmentlängen der Allelleiter ermittelt mit dem ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer mit POP-4 Polymer. Bitte beachten Sie die Hinweise unter Punkt 8.3. Panel/Varianten AMLplex Blue Größe [bp]* Andere Panel/Varianten AMLplex Green Größe [bp]* CBFB-MYH11_TypeG 63 DEK-CAN 78 CBFB-MYH11_TypeI 66 MLL-PTD_e9e3 87 QS-Control 72 MLL-AF9_6A_S 113 BCR-ABL_b2a3 107 MLL-AF9_6B 191 CBFB-MYH11_TypeJ 141 MLL-PTD_e10e3 218 CBFB-MYH11_TypeC 146 MLL-ELL_e10e3 242 CBFB-MYH11_TypeD 160 MLL-AF9_7A 245 CBFB_MYH11_TypeH 165 MLL-ELL_e10e2 289 CBFB_MYH11_TypeF 175 MLL-AF6 303 BCR-ABL_b3a3 183 MLL-PTD_e11e3 333 BCR-ABL_e1a3 206 MLL-AF9_8A 360 AF10_240- CALM_2092 CBFB-MYH11_TypeA MLL-AF9_6A_L 498 BCR-ABL_b2a2 282 AMLplex Yellow AML1-ETO 301 PML-RARA-bcr1 220 BCR-ABL_b3a2 358 PML-RARA_bcr3 288 CBFB-MYH11_TypeE 365 AF10_240- CALM_ BCR-ABL_e1a2 380 NPM1-MLF1 389 CBFB-MYH11_TypeB 486 ABL-Control 518 Andere PML- RARA_bcr2** * auf ganze Zahl gerundet ** Aufgrund der variierenden Amplikonlänge (ca. 173bp) kann die Variante nicht automatisch zugeordnet werden, ist jedoch mit den Primern des detektierbar. Zwei Amplikons für die Variante MLL-AF9_6A

42 42 8. Interprätation der Ergebnisse Durch die vorher beschriebene Post-PCR Auswertung mit automatischer Allelzuordnung wird eine genaue und zuverlässige Unterscheidung der Fusionsgentranskripte und ihrer Varianten gewährleistet. Bitte überprüfen Sie die korrekte Zuordnung der Allele in der Alleleleiter in jedem Lauf. Detektionslimit In Versuchen mit Plasmiden wurde ein Detektionslimit von 1000 Kopien ermittelt. Liegt diese Kopienzahl vor, können Peakhöhen von > 200 RFU erreicht werden. Es handelt sich bei dieser Anwendung um ein PCR-basiertes Screening-Tool, das für die Subtypen Klassifizierung der AML entwickelt, validiert und zertifiziert wurde. Diese Anwendung ist nicht für die Quantifizierung oder das Monitoring Minimaler Resterkrankung (MRD) geeignet. Überstrahlungen (Pull-up Peaks) Es kann zu Überstrahlungen zwischen den Farbpanels kommen, wenn eine ungeeignete Matrix für die Analyse verwendet wurde oder die Peakhöhen des PCR Produktes außerhalb des linearen Detektionsbereiches des Gerätes liegen. Diese erscheinen an der gleichen Position wie spezifische Peaks in anderen Farbpanels (in der Regel mit niedrigeren Signalintensitäten). Wenn nötig, verdünnen Sie die PCR Produkte um eindeutig auswertbare Ergebnisse zu erhalten. Bei Überstrahlungen trotz optimaler Fluoreszenzhöhen, sollte die Matrix erneuert werden. Template-unabhängige Anheftung von Nukleotiden Die Multi Taq DNA Polymerase hängt aufgrund ihrer terminalen Transferase-Aktivität bevorzugt ein Adenosin an das 3 -Ende des amplifizierten DNA-Fragments an. Wenn dem PCR-System nicht genügend Zeit für die Extension zur Verfügung steht oder wenn die Primersequenzen die Extension nicht begünstigen, findet diese Anheftung nicht statt. Dieses Artefakt ist durch das Auftreten eines um eine Base verkürzten Fragments (-1 bp Peak) erkennbar. Alle Biotype Primer sind so gestaltet, dass diese Artefaktbildung minimiert wird. Zusätzlich wird die Bildung des Artefakts durch den abschließenden Extensionsschritt im PCR-Protokoll (68 C für 10 min) reduziert. Die Peakhöhe des Artefakts nimmt bei hohen cdna-mengen zu. Zur Bewertung der Peaks sollte jedes Analyselabor hierfür eigene Grenzwerte festlegen. Artefakte Die Raumtemperatur kann das Laufverhalten der PCR-Produkte an Kapillargeräten stark beeinflussen und bei zu geringer Temperatur zum Auftreten von Schultern oder Doppelpeaks (Split Peaks) führen. Außerdem kann die automatische Allelzuordnung beeinträchtigt sein. Sollten diese Effekte beobachten werden, empfehlen wir eine erneute Injektion der Proben eventuell auch mit mehreren Allelleitern pro Run. Bitte achten Sie darauf, dass die vom Gerätehersteller empfohlene Arbeitstemperatur eingehalten wird. Optimal sind stabile Raumtemperaturen >22 C.

43 43 Einfluss des Polymertyps wurde auf POP-4 validiert und zertifiziert. Die Verwendung eines anderen Polymers (z.b. POP-7 oder POP-6 ) kann das Laufverhalten der spezifischen PCR-Produkte verändern. Die Anpassung der Biotype Templates (Panels und BinSet) ist unter Umständen nötig. Bitte wenden Sie sich an unseren technischen Support (support@biotype.de). Außerdem wurde ein erhöhtes Hintergrundrauschen durch ein verändertes Verhalten von freien Fluoreszenzfarbstoffresten beobachtet.

44 44 9. Referenzen Asou H, Tashiro S, Hamamoto K, Otsuji A, Kita K, Kamada N (1991) Establishment of a human acute myeloid leukemia cell line (Kasumi-1) with 8;21 chromosome translocation. Blood 77(9): Beillard E, Pallisgaard N, van der Velden VHJ, Bi W, Dee R, van der Schoot E, Delabesse E, Macintyre E, Gottardi E, Saglio G, Watzinger F, Lion T, van Dongen JJM, Hokland P, Gabert J (2003) Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using real-time quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) - a Europe against cancer program. Leukemia 17: Van Dongen JJM, Macintyre EA, Gabert JA, Delabesse E, Rossi V, Saglio G, Gottardi E, Rambaldi A, DOtti G, Griesinger F, Parreira A, Gameiro P, Gonzalez Diaz M, Malec M, Langerak AW, San Miguel JF, Biondi A (1999) Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease - Report of the BIOMED-1 Concerted Action: Investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 13:

45 Erklärung der Symbole Hersteller Herstellungsdatum Chargenbezeichnung <N> Ausreichend für <N> Tests Gebrauchsanweisung (Handbuch) beachten Verwendbar bis Temperaturbegrenzung Bestellnummer In-vitro-Diagnostika