Translation. Introns in trna. trna. trna. trna. trna

Transkript

1 Translation Übersetzen des Nukleinsäurecodes in eine Aminosäurekette, das Protein. Zentrale Übersetzungsmaschine: das Ribosom Die Aminosäuren werden mit trnas (transferrnas) angereicht Introns in trna Auch bei der Reifung der transfer-rnas werden Molekülteile herausgeschnitten, prinzipiell eine Splicing- Reaktion. Allerdings wird hier die RNA zuerst gespalten und später unter Energieaufwand (ATP) wieder verknüpft. Der Bereich des Introns wird hier nicht an seiner Sequenz erkannt, sondern an der Ausbildung der Sekundärstruktur der umgebenden Exonbereiche. trna Die transfer-rna (trna) ist der Adaptor zwischen den Nucleinsäuren und den Proteinen. Sie bringen einzelne Aminosäuren, verbunden mit dem zugehörigen Nucleinsäure-Erkennungscode (3 Nucleotide: Triplett- Code) zum Ribosom. Es gibt 64 verschiedene Triplettcodes, von denen 61 für Aminosäuren stehen. Dennoch gibt es in E. coli nur 40 trna-gene (in je einer Kopie), da mehrere Tripletts ( Wobble-Hypothese, das dritte Nucleotid wird oft ignoriert) an dieselbe trna binden. trna In Eukaryonten kommen die trnas in mehreren Kopien vor (<10 in Hefe pro Typ, >200 in Xenopus laevis (Krallenfrosch, beliebtes Forschungsobjekt)). trna Dabei liegen nie mehrere Kopien derselben trna nebeneinander, sondern verschiedene trnas bilden eine Gruppe, die (nebeneinander wiederholt oder im Genom verteilt) vielfach vorkommt. trna Nach der Transkription werden trnas noch stark modifiziert. Neben dem Splicing werden Basen verändert, insbesondere durch Methylierung. 1

2 trna Struktur der trna Typisch trna ist das Pseudouridin (ψ, psi), in dem das Uracil mit dem falschen Atom (C!) am Zucker sitzt. Trotz unterschiedlicher Länge (73-93 Nukleotide) nehmen alle trnas eine sehr ähnliche Raumstruktur an, die flachgedrückt wie ein Kleeblatt aussieht. Struktur der trna Die tatsächliche Raumstruktur erinnert eher an ein L. Struktur der trna Der Akzeptor-Stamm trägt am 3 -Ende die Aminosäure. Die Längenunterschiede beruhen auf Unterschieden in der D-Schleife (D: Dihydrouridin) und der variablen Schleife (extra arm). Die Anticodon-Schleife bindet mit dem Anticodon- Triplett an die mrna. Struktur der trna Die Anticodon-Schleife bindet mit dem Anticodon-Triplett an die mrna. Codon, Anticodon, Sense, Antisense? Die Nomenklatur nimmt die mrna als Standard. Ihre Basenfolge ist daher der Code, die dazu passende Sequenz der trna Anticode. Der transkribierte DNA-Strang (Template-Strang, Vorlagen- Strang) ist also auch Anticodon (oder antisense), während der nicht-translatierte Gegenstrang ein codierender oder Sinn- (sense) Strang ist. 2

3 Beladen der trna Für jede der 20 proteinogenen Aminosäuren gibt es eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase, die (unter ATP-Verbrauch) die Aminosäure auf alle passenden trnas (IsoakzeptortRNAs, akzeptieren die gleiche Aminosäure) hängt (am 3 - Akzeptorende). Dabei erkennt sie die trnas an Details ihrer Raumstruktur, nicht am Anticodon. Zunächst bindet die Synthetase die Aminosäure unter ATP- Verbrauch als Enzym-Aminoacyladenylat-Komplex: Aminosäure + Enzym + ATP Enzym-AS-AMP + PP Dann wird die so aktivierte Aminosäure auf die richtige trna übertragen, AMP wird freigesetzt. Enzym-AS-AMP + trna AS-tRNA + Enzym + AMP Beladen der trna - Aminoacyl-tRNA-Synthetasen Sowohl bei der Bindung der Aminosäure wie nach der Übertragung kann das Enzym falsche Aminosäuren erkennen und (von sich bzw. von der trna) wieder abspalten. Falsche trnas werden einerseits schlecht vom Enzym gebunden, andererseits viel langsamer mit AS beladen. Die verbleibende Fehlerquote liegt bei 1:3000 (Enzym bindet falsche AS mit 1:100, Endkontrolle funktioniert mit 1:30). Das ist ein gutes Ergebnis für die komplizierte Aufgabe, führt aber andererseits zu einer merklichen Ausfallrate besonders bei größeren Proteinen. Fehlerkontrollen beim Beladen der trna Ribosomen Die Ribosomen bauen Proteine aus Aminosäuren, die von trnas angeliefert werden, nach Vorgabe von mrnas zusammen. Sie bestehen immer aus zwei Untereinheiten, bei Eukaryonten ist alles (bis auf die 5S rrna) etwas größer als bei Bakterien. Ribosomen Ribosomen Die Proteine der Ribosomenuntereinheiten, aufgetrennt durch 2- dimensionale Elektrophorese (2-D Elektrophorese): Trennung nach Molekülgröße (SDS-PAGE) in einer Richtung, Trennung nach dem isoelektrischen Punkt (dem ph- Wert, bei dem das jeweilige Protein ungeladen ist; Isoelektrische Fokussierung) rechtwinklig dazu. 3

4 Ribosomen Die RNAs machen bis 70% der Ribosomen aus. Sie bilden das strukturelle Rückrad der Ribosomen. Außerdem machen sie mit der mrna zeitweise Basenpaarung. Verteilung von Protein und RNA in der 30S- Untereinheit. Ribosomen Die Synthese der ribosomalen Untereinheiten findet (bei Eukaryonten) in einem bestimmten Bereich des Zellkerns statt, dem Nucleolus. Dort liegen auch die rrna-gene in hoher Kopienzahl: mehrere hundert tandemartig hintereinander. Die hohe Anzahl ist nötig, denn fast 90% der cytosolischen RNA ist rrna (dabei spielt natürlich auch die gegenüber mrna (nur <4% der Gesamt-RNA, 5-10% trnas) viel höhere Lebensdauer eine Rolle)! Die intakten Untereinheiten (aus den rrnas und den ribosomalen Proteinen) werden durch die Kernporen ins Cytoplasma exportiert. In E. coli gibt es nur 7 Kopien der rrna-gene, sie liegen aber nahe beim Replikationsursprung, so dass sie früh im Zellzyklus verdoppelt werden. Nucleolus Der Nucleolus ist im elektronenmikroskopischen Bild gut als dichter, meist runder Bereich im Zellkern zu erkennen. Ribosomen Anzahl der ribosomalen Gene in verschiedenen Eukaryonten: Tetrahymena vermehrt die einzige Kopie des eigentlichen Zellkerns in einer Art Arbeitszellkern, dem Makronukleus, zu sehr hoher Kopienzahl. Ribosomen Alle Ribosomen eines Zellkompartiments sind identisch (cytosolische, mitochondriale). Sie binden jeweils zwei trnas. Die eine trna trägt die letzte eingebaute Aminosäure und den Aminoterminus des wachsenden Proteins, die andere trna trägt die nächste einzubauende Aminosäure. Die mrna läuft durch die 30S Untereinheit, das Protein entsteht an der 50S Untereinheit, die trna durchspannt beide Untereinheiten. Die Translation von mrna in Protein geschieht mit einem Triplettcode (3 Nucleotide codieren für eine Aminosäure). Beim Übersetzen wandert die Lesemaschine ebenfalls pro Aminosäure um drei Nucleotide weiter, so daß jedes Nucleotid nur in einem Codon gelesen wird (> der Code ist nicht überlappend, die Folge ATGGGC wird also ATG GGC gelesen, nicht ATG TGG GGG GGC). Allerdings werden in einigen Viren (z.b. E. coli-phage ΦX) verschiedene Gene vom selben DNA/RNA-Bereich codiert und in verschiedenen Leserasern abgelesen: Sequenz ATGCGCGCTTCGATAAAAATGATTGGC... Protein A.TG GCG CGC TTC GAT AAA AAT GAT... Protein B ATG CGC GCT TCG ATA AAA ATG ATT... 4

5 Translation - der genetische Code Der degenerierte Triplett- Code: 64 Codone werden in 20 Aminosäuren bzw. Stop (Abbruch der Translation) übersetzt. Der Code ist degeneriert (mehrere Codone codieren für die gleiche Aminosäure). Die Unterschiede liegen meist in der dritten Position des Tripletts. Unterschiedliche Organismen bevorzugen verschiedene Codone für dieselbe Aminosäure. So verwenden Organismen mit Vorliebe für G+C (Streptomyces 74% G+C) meist G oder C im dritten Triplett-Nukleotid (bis zu 94% bei Streptomyceten). Auf diese Weise lassen sich bei Streptomyceten auch für Protein codierende Leseraster von nicht-codierenden Bereichen unterscheiden: Man wertet jedes dritte Nucleotid aus. Tritt fast nur G/C auf, ist der Bereich codierend. DNA-Abschnitt von Streptomyces arenae, analysiert nach GC-Gehalt in allen Rastern. Dieser Codon-Usage ist wichtig, wenn Fremdgene in einem Organismus exprimiert werden sollen. Für die unbeliebten Codone gibt es weniger oder sogar gar keine trna. Zur optimalen Genexpression sollte man daher den Code entsprechend anpassen. Auch die Natur nutzt die Möglichkeit, Genexpression über die Verfügbarkeit der trna zu steuern. Bei vielen Streptomyceten kommt ein Code (TTA) nur in Genen der Differenzierung und der Antibiotika-Synthese vor. Die entsprechende trna wird nur synthetisiert, wenn die Zelle auf Sekundärmetabolismus und Differenzierung (Sporulation) umschaltet. So wird vermieden, daß sie sich im Wachstum mit dem eigenen Antibiotikum vergiftet. Innerhalb derselben Zelle ist der Codon-Usage nicht für alle Gene gleich. Häufig und in großer Menge benötigte Proteine werden mit den besten Codonen des Organismus codiert (reichlich trnas), bei wenig verwendeten Proteinen tauchen auch die unbeliebten Codone auf. Aus der Bestimmung des Codon-Index (Anteil der bevorzugten Codone im Gen) läßt sich daher abschätzen, ob ein Gen oft oder wenig verwendet wird, und auch (bei sehr kurzen Leserastern), ob die Sequenz tatsächlich für ein Protein codiert, oder ob nur zufällig in einer nicht-codierenden (oder für rrna, trna codierenden) Sequenz über einen längeren Abschnitt kein Stop-Codon vorliegt. Der genetische Code Für die verschiedenen Aminosäuren codieren 1 bis 6 Codone. Seltener in Proteinen vertretenen Aminosäuren sind eher weniger Codone zugeordnet (Met, Trp, Cys), häufigen viele (Leu, Ser), diese Korrelation gilt aber nicht streng (Glu mit nur 2 Codonen). 5

6 Der genetische Code Die dritte Base der Tripletts wird häufig ignoriert (32 von 61 mal), oder nur nach Purin oder Pyrimidin ausgewertet. In der dritten Position werden nämlich auch andere als die Watson- Crick-Paarung toleriert ( Wobble, wacklige, schwabblige Ablesung). Der genetische Code Nur Codone mit G oder U an 3. Stelle können eindeutig sein, was mit den drei einzigartigen Codonen übereinstimmt (ATG Met, TGG Trp, TGA Stop - das eben nicht vom Trp- Anticodon ). Der Code ist universell, alle Organismen verwenden die gleiche Zuordnung von Tripletts zu Aminosäuren - mit wenigen Ausnahmen: in Mitochondrien gibt es einige Abweichungen. Nicht-universeller Code: In einigen Protozoen (Tetrahymena, Paramecium: Stop- Codone UAA, UAG werden als Glutamin gelesen ) und in der Hefe Candida cylindrica werden sogar in Kerngenen einige Codone anders übersetzt (dadurch funktionieren die meisten Bäckerhefegene nicht in Candida, obwohl beide Hefen eng verwandt sind: CUG wird hier als Serin statt als Leucin übersetzt)! Und in Mycoplasma capricolum (also einem Prokaryonten) steht der Stop-Code UGA für Tryptophan. DerCodeistkommafreiauchdieInterpretationwoeinProteinbegin ntmußdiezelleausdemkontextshinedalgarnoboxerkennen 6

7 DerCodeistkommafreiauchdieInterpretationwoeinProteinbegin ntmußdiezelleausdemkontextshinedalgarnoboxerkennen Der Code ist kommafrei, auch die Interpretation wo ein Protein beginnt, muß die Zelle aus dem Kontext (Shine- Dalgarno-Box) erkennen. Ermittlung des genetischen Code Mit der Erkenntnis der Doppelstrangnatur der DNA und der Art des Informationsspeichers wurden die Prinzipien der Translation theoretisch richtig erschlossen. Das Ermitteln des kompletten Codes dauerte aber mehrere Jahre. Hilfreich war das Enzym Polynukleotid-Phosphorylase, das die Bildung von RNA-Strängen aus NTPs ermöglichte (ohne Matritze). Zuerst (1961) wurde Poly-U in Phenylalanin übersetzt (Code UUU). Erst 1972 wurde durch die parallele Sequenzierung eines Phagengens und des codierten Proteins die Code-Tabelle entgültig bestätigt, und dabei auch AUG als Startcodon und die Colinearität von Gen und Protein bestätigt. Translation Bei der Translation lassen sich die drei Phasen Initiation, Elongation und Termination unterscheiden, in denen jeweils unterschiedliche Proteinfaktoren beteiligt sind. Initiation der Translation Zunächst bindet die mrna an die kleine ribosomale UE (die vom Antiassoziationsfaktor IF-3 an der Bindung der großen UE gehindert wird). Bei Bakterien geschieht das mit einer purinreichen Sequenz, der Shine-Dalgarno-Sequenz, die komplementär zum 3 -Ende der 16S rrna ist. Sie liegt 8-12 Nukleotide vorm Start-Codon AUG. Anders als sonst gebräuchlich, ist im Ribosom der Energielieferant GTP, das von kleinen G- Proteinen in den verschiedenen Phasen der Translation hydrolysiert wird. Initiation der Translation Initiation der Translation Bei Eukaryonten dient die 5 - Capstruktur zum Binden der 40S-Untereinheit. Die Untereinheit wandert dann zur Ribosomenbindungsstelle, die das Start-Codon umgibt. Bei langem Leader (mrna vorm Start) können mehrere Ribosomen-UE geladen werden und auf den Translationsstart warten. Dann binden (bei Bakterien) IF-1 (Initiationsfaktor) und ein Komplex aus IF-2, GTP und Formylmethionin-tRNA durch Paarung der Anticodonschleife mit dem Start-AUG. Von diesem 30S-Initiationskomplex löst sich IF-3, dadurch kann die große UE binden. Beim Ablösen von IF-1 und IF-2 wird das GTP zu GDP hydrolysiert. 7

8 Die Start -trna unterscheidet sich von allen anderen trnas. Sie wird von einer speziellen Synthase mit Methionin beladen, das anschließend durch Formylierung (Ameisensäure in Amidbindung) am Aminoterminus geschützt wird. FormylmethionintRNA FormylmethionintRNA fmet-trna kann an AUG und GUG (codiert sonst Valin) als Startcodon binden. Es wird als einzige trna an den P- Ort (Peptidyl-Ort) der freien 30S-UE des Ribosoms gebunden, alle andern trnas werden von EF-Tu am kompletten Ribosom an den A-Ort (Akzeptor-Ort) dirigiert. Elongationsphase der Translation Die Elongation ist ein zyklischer Prozeß (eine Runde pro angehängte Aminosäure), die man in drei Phasen unterteilen kann: Bindung der AAtRNA, Elongation, Translokation Elongationsphase der Translation Die Aminoacyl-tRNA bildet einen Komplex mit Elongationsfaktor EF-Tu, der zugleich mit GTP beladen ist. EF-Tu kann alle trnas außer der Start-tRNA binden. Der Komplex bindet an den A-Ort, dabei paart die TψC-Schleife mit der 5S-rRNA. EF-Tu spaltet das GTP und geht als EF-Tu- GDP ab. In dieser Phase (GTP-Hydrolyse, EF-Tu-Abdissoziation) wird auf korrekte Paarung getestet. Das von der Natur optimierte Ergebnis ist eine Dauer von einigen Millisekunden und eine Fehlerrate von Geringere Fehler würden den Ablauf weiter verzögern. EF-Tu wird von EF-Ts wieder mit GTP beladen (EF-Ts verdrängt das GDP und wird seinerseits von GTP verdrängt). Elongationsphase der Translation Die Peptidyltransferase-Aktivität der beiden trnas* überträgt das fmet (in weiteren Zyklen das wachsende Peptid) auf die Aminosäure am A-Ort. Am P-Ort verbleibt die leere trna. *Das Peptidyltransferase- Zentrum des Ribosoms enthält kein Protein, hier liegt also eine Ribozym-Aktivität vor! Elongationsphase der Translation Die 23S rrna positioniert die trnas und stabilisiert den Übergangszustand, die eigentliche Reaktion führt aber nur die P-Site trna mit der A-Site Aminosäure durch (das weiss man noch nicht lange). 8

9 Elongationsphase der Translation Elongationsphase der Translation Der A-Ort muß für eine neue AA-tRNA freigemacht werden. GTP-beladener Faktor EF-G verdrängt die peptidbeladene trna vom A-Ort, diese wandert in den P-Ort, die leere trna wird freigesetzt. Ist der A-Ort unbesetzt, kann also die trna vom P-Ort nicht verdrängt werden. Dabei wandert auch die mrna um drei Nukleotide weiter. EF-G spaltet dann sein GTP und gibt den A-Ort wieder frei. Das abwechselnde Binden von EF-Tu (im trna-komplex) und EF-G treibt die Proteinelongation voran. Elongationsphase der Translation Die Richtung von Translation und Transkription ist gleichsinnig. Daher kann die bakterielle Translation kurz nach Beginn der Transkription einsetzen und die Ribosomen als Polysomen die mrna schützen. Struktur der Polysomen Feinstruktur der Ribosomen Die mrna macht zwischen A und P-Site einen Knick, dadurch liegen die trnas im Winkel zueinander. Terminationsphase der Translation Für die Stop-Codons gibt es keine trna. Die Translation stoppt dann, es binden die release factors (Ablöse-, Freisetzungs-Faktoren). RF-1 erkennt UAA und UAG, RF-2 erkennt UAA und UGA. Immer bindet noch RF-3 und GTP. Die RFs schalten die Peptidyltransferase an, die - bei fehlender Aminosäure in der A-Site - das Peptid von der P- Site trna auf Wasser überträgt, damit die Bindung zum Peptid hydrolysiert und das Peptid freisetzt. trna und mrna verlassen das Ribosom, dann trennt IF-3 die 30S-Untereinheit ab und macht sie für eine neue Translation bereit. 9

10 Terminationsphase der Translation Eine Deformylase entfernt den Formylrest vom freigesetzten Peptid, und oft wird auch das Methionin* noch abgespalten. Translation polycistronischer mrna Bei polycistronischer mrna (Operonstruktur: mehrere Protein-Leseraser hinter einem Promotor) wird jedes Gen individuell translatiert, das Ribosom terminiert also jedesmal und muß wieder neu zusammengesetzt werden. *das eine CH 2 -Gruppe länger ist als hier gezeigt - auch Lehrbücher machen Fehler. Translation bei Eukaryonten Die Details der Translation sind bei Eukaryonten weniger genau untersucht. Bekannte Unterschiede sind: -Methionin als Start-Aminosäure (statt Formyl-Methionin) -mindestens 5 Initiationsfaktoren -5 Cap als erster Bindungsort der kleinen Untereinheit, statt der Shine-Dalgarno-Sequenz. Translation Die Faktoren EF-Tu (als AA-tRNA-Komplex), EF-G und RF-1/3 oder -2/3 binden an der gleichen Position des Ribosoms. Das ist durch molekulares Mimikry möglich: für das Ribosom sehen sie ähnlich aus, obwohl ein Teil des bindenden Komplexes einmal RNA, die anderen Male Protein ist. Durch den gemeinsamen Bindungsort ist ein gleichzeitiges Binden unmöglich, dadurch wird die korrekte Reihenfolge beim Ablauf der Translation sichergestellt. AA-tRNA- EF-TU (l.) und EF-G (r.) haben große Ähnlichkeit in der Struktur Translation Translation und Mutation Veränderungen einzelner Nucleotide der DNA (Punktmutationen) können für das gebildete Protein drei Auswirkungen habe: - Wenn ein Nukleotid an dritter Stelle im Codon verändert ist, wird eventuell dieselbe Aminosäure eingebaut wie beim unmutierten Gen (stille Mutation). Achtung: Wegen des Codon-Usage kann die Mutation dennoch Auswirkungen haben, nämlich auf die Translationsgeschwindigkeit. - Der Code kann nun für eine andere Aminosäure codieren (Missense-Mutation). - Der Code kann jetzt für ein STOP stehen (Nonsense- Mutation). 10

11 Translation - Nonsense und Nonsense-Suppression Wenn ein Codon durch Mutation in ein Stop-Codon umgewandelt ist, spricht man von einer Nonsense- Mutation. Das entsprechende Protein ist dadurch verkürzt und meist nicht funktionsfähig. Eine weitere Mutation kann viele Nonsense-Mutationen in derselben Zelle aufheben (supprimieren). Ursache ist eine Mutation in der Anticodon-Schleife einer trna, so daß sie jetzt das Stop- Codon erkennt. Translation - Nonsense und Nonsense-Suppression Das klappt nur, weil ja die AminoacyltRNA-Synthase nicht das Anticodon prüft, sondern die Form der trna und Nukleotide anderer Bereiche. Zellen mit solchen Nonsense- Suppressoren wachsen schlecht, denn auch sinnvolle Stop-Codone werden überlesen. Es entstehen überlange, oft defekte Proteine. Da aber andere Kopien der trna nicht-mutiert sind, entsteht genug korrektes Protein zum Überleben. Translation - Nonsense und Nonsense-Suppression Verschiedene Nonsense-Suppressoren: mutiert ist immer der Anticodon eines trna-gens. Translation - Missense und Missense-Suppression Ähnlich funktioniert es, wenn eine Mutation zu einer anderen Aminosäure (Missense-Mutation) und damit zum Funktionsverlust des Proteins führt. Auch hier kann die Mutation des Anticodons die ursprüngliche Aminosäure wieder einführen - auf Kosten einer fehlerhaften Einfügung diese Aminosäure in viele andere Proteine. Auch hier erlauben die unmutierten Kopien der gleichen trna der Zelle das Überleben. Translation - Frameshift und Frameshift-Suppression mrna-editing Schließlich kann auch durch ein Verlassen des richtigen Leserasters (Frameshift, das geschieht durch Insertion - Einfügen von Nucleotiden, oder Deletion -Verlust von Nucleotiden) zum Entstehen fehlerhafter Proteine kommen. Auch hier gibt es Suppression durch mutierte trnas. Dabei kann das Anticodon selbst verändert sein (Hefe SUF2: GGGA statt GGA), oder die Struktur der trna, so dass sie z.b. einen 4 Basen Code liest und so eine 1-Nucleotide Deletion ausgleicht. Auch natürlicherweise können auf dem Weg von Transkription und Translation Veränderungen der codierten Information eingeführt werden. Das geschieht durch Veränderung der mrna-sequenz, durch mrna-editing. 11

12 mrna-editing So wird das Apolipoproteingen apo-b in der Leber normal verarbeitet, ein CAA-Code führt zum Einbau von Glu, es entsteht ein Protein von 512 kda. In den Eingeweiden wird dieser Code aber in der mrna in UAA editiert. Es kommt zum Translationsstop, das entstehende Protein ist nur 250 kda lang. mrna-editing Beim Glutamat-Rezeptor im Rattenhirn wird durch einen A>Inosin (gelesen wie G)-Umbau statt Gln ein Arg eingebaut, das für die Funktion nötig ist. In beiden Fällen (apo-b C>U) wird eine Aminogruppe der Base von einer spezifischen Deaminase abgespalten. Vermutlich erkennen diese Enzyme Faltungsstrukturen der mrna. mrna-editing Bei Trypanosomen findet mrna-editing in großem Maßstab statt. Ein einfaches Beispiel ist das coxii-gen (Cytochrom- Oxidase), bei dem ein -1-Frameshift (Leserasterwechsel um eine Base) durch Einfügen von 4 Uridinen korrigiert wird. mrna-editing Beim coxiii-gen werden mehr Uridine eingefügt (im Beispiel, dem coxiii-gen, rot), oder (im Beispiel T s) herausgeschnitten, als das Gen andere Nukleotide hat. mrna-editing Die Information stammt von Guide-RNAs, die sich mit der mrna paaren und als Korrektur-Template fungieren. Diese Guide-RNAs sind aber keine durchgehenden Gegenstränge der mrna, sondern paaren nur in kurzen Abschnitten mit ihr. mrna-editing Die mrna wird aufgeschnitten, nach Vorgabe der Guide-RNA U s abgespalten oder eingefügt, und die Lücke wieder geschlossen. 12

13 mrna-editing Die DNA-Sequenzen für Guide-RNAs und für die zugehörigen mrnas liegen oft buntgemischt nebeneinander. mrna-editing Der Editing-Prozeß scheint an der mrna 5 >3 entlangzuwandern, denn man findet teilweise editierte Zwischenprodukte. Hier hat man die ungewöhnliche Situation, das sowohl Mutationen des eigentlichen Gens als auch Mutationen der Guide-RNA das entstehende Protein verändern. Die Guide- Gene wirken in trans (sie könnten also auch woanders im Genom oder auf einem Plasmid sitzen und würden trotzdem funktionieren). Was geschieht nach der Translation mit dem Protein? Im Ribosom entsteht das neue Protein als lineares Molekül. Es muß sich in die richtige Raumstruktur falten, um seine Funktion ausüben zu können. Die Information für die richtige Faltung liegt (zumindestens meist) im Proteinfaden selbst, d.h., auch ein wieder entfaltetes Protein kann sich prinzipiell in die richtige Konformation zurückfalten. Allerdings neigen entfaltete Proteine zum Verklumpen und dadurch zum Präzipitieren (unlöslich ausfallen), weil sie ihre hydrophoben Bereiche exponieren, die zusammenkleben. Was geschieht nach der Translation mit dem Protein? - Chaperone Das wird durch Chaperone ( Anstandsdamen ) verhindert, Proteine, die ungefaltete Proteine umgeben, am Verkleben hindern und ihnen so die Zeit geben, sich in die richtige Form zu falten. Die Chaperone helfen nicht aktiv beim Falten mit, sie erkennen lediglich hydrophobe Proteinbereiche! Beim Hitzeschock entfalten sich in der Zelle viele Proteine, daher werden dann viele Chaperone gebraucht. Chaperone sind die Hauptklasse der Hitzeschockproteine (daher oft mit Namen wie hsp-70, hsp-90 bezeichnet), das sind Proteine, die nach einem Hitzeschock in der Zelle angehäuft werden. Was geschieht nach der Translation mit dem Protein? - Chaperone Chaperone- Proteinfamilien von Eukaryonten und (Klammern) Bakterien: die verschiedenen Chaperone-Klassen sind in der Evolution konserviert. Was geschieht nach der Translation mit dem Protein? - Chaperone Nach der Translation unterstützt DnaK, unterstützt von DnaJ, die Faltung des neuen Proteins, dabei spaltet es ATP (ist also, wie viele Chaperone, eine ATPase). GrpE verdrängt das ADP und sorgt so für die Ablösung der Chaperone vom Protein. Ist die Faltung noch nicht abgeschlossen, binden DnaK und DnaJ erneut. 13

14 Chaperone Chaperone GroEL bildet zwei Ringe (aus je 7 Untereinheiten), GroES den Deckel dazu. In der zentralen Kammer falten sich die Substratproteine. Beim Falten und beim Freilassen wird ATP verbraucht. Was geschieht nach der Translation mit dem Protein? Auch Enzyme helfen bei der richtigen Faltung mit, indem sie besonders langsame Faltungsschritte beschleunigen. Die Peptidyl-Prolyl-Isomerasen rotieren Prolinreste um ihre Peptidbindung herum. Was geschieht nach der Translation mit dem Protein? Protein- Disulfidisomerasen beschleunigen das Ausbilden der richtigen S-S- Brücken zwischen zwei Proteinen. Was geschieht nach der Translation mit dem Protein? - Sekundärstruktur Beim gefalteten Protein lassen sich Grundelemente der Faltung erkennen: die α-helix, das β-faltblatt (als paralleles und als antiparalleles Faltblatt), der γ-turn. Diese Grundelemente (Sekundärstrukturelemente) ordnen sich im Raum zu komplizierten Strukturen (Tertiärstruktur). Besteht ein Protein aus mehreren Untereinheiten, bezeichnet man die Art ihres Zusammenlagens als Quartärstruktur. Die Sekundärstruktur läßt sich grob aus der Aminosäuresequenz ableiten (Prolin bricht z.b. Helices), die höheren Strukturen werden durch Röntgenstrukturanalyse von Proteinkristallen oder durch NMR (Kernspinresonanzspektroskopie) von Proteinlösungen ermittelt. Proteinstrukturen Posttranslationale Modifikation Das Raummodell des lac- Repressors zeigt die Elemente der Sekundärstruktur und ihre Organisation in größere (Tertiär-)Strukturen, wie das Helix-Turn-Helix - Motiv Während alle Proteine sich falten, gibt es eine Reihe von Veränderungen, die nur bei einigen Proteinen geschehen: Abschneiden von Proteinteilen (Prozessierung), Anhängen von Zuckerresten (Glycosylierung), Phosphatresten, Lipiden (z.b. Farnesylierung), Transport in Organelle (oft mit anderen Modifikationen verbunden), Anbringen von Schutzgruppen (Acetylgruppe am Aminoterminus, Amidgruppe am Carboxyterminus - Verlangsamen den Abbau der Proteine). 14

15 Posttranslationale Proteinsortierung Wohin ein Protein gelangen kann, entscheidet sich schon bei der Translation: Proteine, die an cytosolischen Polysomen entstehen, können im Cytosol bleiben oder in den Zellkern, die Mitochondrien, Chloroplasten und Peroxisomen wandern. Posttranslationale Proteinsortierung Signalsequenzen bestimmen dabei das Zielorganell Posttranslationale Proteinsortierung Proteine, die im Cytoplasma an Polysomen entstehen, werden erst nach Abschluß der Translation in ihre Zielorganelle transportiert. Der Zellkern kann durch seine großen Poren auch gefaltete Proteine importieren. Für die Mitochondrien bestimmte Proteine werden durch Chaperone an der kompletten Faltung gehindert. Der Importmechanismus der Mitochondrien (Ratschen-Prinzip) ist aber so stark, daß er teilgefaltete Proteine auseinanderziehen kann. Kerntransport Kernporen im Modell und im EM-Bild Kerntransport Durch die Kernporen passen sogar Ribosomenuntereinheiten, allerdings ist der Transport gegenüber kleineren Proteinen verlangsamt. Kerntransport Kernimportsignale bestehen aus einer oder zwei ( bipartite signal ) Gruppen aus basischen Aminosäuren, oft gehört noch ein Prolin dazu. 15

16 Kerntransport Anders als fast alle die übrigen Signalsequenzen werden Kernimportsignale nicht nach dem Transport abgeschnitten. Dadurch können die Proteine erneut in den Kern transportiert werden, wenn sich - wie es bei der offenen Mitose in jeder Zellzyklus geschieht - die Kernmembran auflöst und die Proteine wieder im Cytoplasma landen. Oft sind Kernlokalisationssignale durch die Proteinstruktur versteckt und werden auf ein Signal hin (Phosphorylierung, Abbau eines abdeckenden Inhibitorproteins) exponiert. Transkriptionsregulatoren werden oft durch diesen Mechanismus angeschaltet. Kerntransport Die Signalsequenzen werden von Träger- (Carrier-)Proteinen gebunden, die vom Transportsystem samt ihrem Substrat befördert werden. Posttranslationale Proteinsortierung Posttranslationale Proteinsortierung - Mitochondrien Bei Mitochondrien und Chloroplasten besteht das zusätzliche Problem, daß diese Organellen aus zwei Membransystemen bestehen und dadurch zwei unterschiedliche lösliche Kompartimente als Transportziel enthalten. Bei den Mitochondrien werden alle Proteine zuerst in die Matrix (innerstes Kompartiment) befördert und die entsprechende Signalsequenz abgespalten. Ein weiteres Signal sorgt dann für den halben Rücktransport in den Intermembranraum oder die innere Membran. Posttranslationale Proteinsortierung - Chloroplasten Bei den Chloroplasten werden die Proteine erst ins Stroma transportiert und dabei die Signalsequenz abgespalten. Eine weitere Signalsequenz sorgt ggf. für den Weitertransport durch die Thylacoidmembran ins Lumen. Posttranslationale Proteinsortierung ER und Golgi-Apparat bilden Stapel von Lamellen in der Zelle. 16

17 Posttranslationale Proteinsortierung Das Signal recognition particle (SRP) erkennt die Signalsequenz aus einem kurzen polaren und einem langen hydrophoben Abschnitt am Aminoterminus, stoppt die Translation, dirigiert das Ribosom zum SRP- Rezeptor, der an einer Sec61-Pore in der ER- Membran sitzt, und gibt die Translation wieder frei. Posttranslationale Proteinsortierung Signalsequenz zur ER-gebundenen Translation. Nach Einfädeln des neuen Proteins ins ER wird sie abgespalten. Posttranslationale Proteinsortierung Posttranslationale Proteinsortierung Membrangebundene Proteine werden wie sekretierte Proteine am ER translatiert. Nach Entstehen der hydrophoben Region wandert sie aus dem Sec61-Kanal in die Lipidschicht der Membran ein. Membrangebundene Proteine enthalten meist ein oder mehrere hydrophobe Abschnitte, die sich in die Membran inserieren. Ist ihre Anzahl gerade, liegen Proteinanfang und -ende (N- und C- Terminus) auf der selben Seite der Membran. Posttranslationale Modifikation Eine andere Möglichkeit der Membranverankerung von Proteine besteht im (posttranslationalen) Anhängen eines Lipidankers, wie Isoprengruppen (z.b. Farnesyl-Reste), Fettalkoholen, Fettsäuren (bei Proteinen, die an löslichen Ribosomen entstanden sind) oder Glycolipiden (im ER/Golgi-Weg). Posttranslationale Proteinsortierung Zum Durchtritt durch die Membranporen muß das Proteine ungefaltet sein. Auch dabei helfen Chaperone mit, indem sie die ungefaltete Form abschirmen und stabilisieren. 17

18 Posttranslationale Proteinsortierung Bei Bakterien ist das Chaperone SecB, das zur Sekretion bestimmte Proteine ungefaltet an SecA anreicht. Der weitere Transport durch die Membran benötigt ATP und Proton motive force, also einen ph-gradienten über die Membran. Posttranslationale Proteinsortierung Proteine, die am rauhen ER entstehen, wandern durch das ER und die verschiedenen Abschnitte des Golgi- Apparates ins Lysosom, oder werden sekretiert (aus der Zelle abgegeben). Sollen sie in einer Station dieses Weges bleiben, benötigen sie Retentionssignale, die ihren Weitertransport verhindern oder sie wieder zurückholen. -KDEL ist die Retentionssequenz für das ER. Posttranslationale Modifikation - Glycosylierung Beim Durchwandern von ER und Golgi-Apparat werden den Proteinen Zuckerreste angehängt (Glycosylierung). Daher sind sekretierte Proteine glycosyliert, während Proteine im Cytoplasma, im Kern und in den Mitochondrien keine Zuckerreste tragen. Posttranslationale Modifikation - Glycosylierung Die verschiedenen Abschnitte des Golgi-Apparates haben eine unterschiedliche Enzymausstattung. Proteine des ER, die durch ihr KDEL -Signal zurückgehalten werden, tragen meist ein cis-golgi Glycosylierungsmuster. Sie sind also schon dem ER entflohen und wurden wieder (von KDEL- Rezeptoren) zurückgeholt. Posttranslationale Modifikation - Glycosylierung Der membrangebundene KDEL-Rezeptor zykliert zwischen ER und cis-golgi und führt ER-residente Proteine zurück. Posttranslationale Proteinsortierung Das Glycosylierungsmuster von Proteinen kann auch das Zielorganell bestimmen: um ins Lysosom zu gelangen, muß ein Protein Mannose-6-Phosphat-Reste tragen. Diese binden an einen Mannose-6-Phosphat-Rezeptor, der für den Transport Richtung Lysosom sorgt. Der Rezeptor trennt sich vorher von seiner Proteinladung und wird für weitere Transporte recycelt. 18

19 Proteinsortierung in Lysosomen 19