HLA-B*27-Realtime LT 2 - Version

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1 HLA-B*27-Realtime LT 2 - Version attomol HLA-B*27-Realtime LT 2 Testkit zur Bestimmung des HLA-B*27-Locus im humanen Genom mit dem LightCycler (Nicht zur Gewebetypisierung zu verwenden!) In-vitro-Diagnostikum 100 Reaktionen Best.-Nr.: 1196 C 1. Einführung Die Humanen Leukozyten-Antigene (HLA) sind Glycoproteine des Haupthistokompatibilitätskomplexes (engl. major histocompatibility complex = MHC), die auf nahezu allen kernhaltigen Körperzellen exprimiert werden. Sie sind für die immunologische Individualität des Menschen (Erkennung von körpereigen und körperfremd ) mit verantwortlich. Die HLA-B-Antigene gehören gemeinsam mit den HLA-A und HLA-C zu den MHC-Klasse-I-Molekülen und sind auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 kodiert (Thomas, 2000, Labor und Diagnose, 5. erweiterte Auflage, TH-Books Verlagsgesellschaft mbh, S ). Von HLA-B existieren verschiedene Formen, die man als Determinanten bezeichnet (z.b. HLA-B7, -B8, -B15,...). Eine dieser Determinanten, das HLA-B27, wurde bereits 1973 eng mit rheumatischen Erkrankungen, insbesondere der ankylosierenden Spondylitis (Spondylitis ankylosans, SPA, Morbus Bechterew) in Zusammenhang gebracht (Brewerton et al., 1973, Lancet 1: ). Träger von HLA- B27 haben ein 87mal höheres Risiko an SPA zu erkranken, als Träger anderer HLA-B-Determinanten. Die Krankheit manifestiert sich sehr häufig zwischen dem 15. und 30. Lebensjahr und tritt überwiegend bei Männern auf (ca. 90 %). HLA-B27 kommt bei etwa 7 % der westeuropäischen Bevölkerung vor. Bei Patienten mit ankylosierender Spondylitis dagegen tritt es zu % auf (Isselbacher et al., 1995, Harrisons Innere Medizin 1, 13. Auflage, Blackwell-Wissenschaftsverlag, S ). Der genaue Pathogenesemechanismus ist noch immer nicht vollständig aufgeklärt (Taurog, J Rheumatol 2010, 37(12): ). Bisher war die serologische Bestimmung von HLA-B27 weit verbreitet. Sie wird jedoch zunehmend durch molekularbiologische Methoden ersetzt, da diese ohne lebende Zellen auskommen und in der Regel eine einfachere und schnellere Durchführung erlauben. Testspezifität: Die in diesem Test verwendeten Primer sind für die Detektion der HLA-B*27-Subtypen konzipiert worden. Die HLA-B*27-Subtypen 12, 16, 18, 26, 27:05:09, 29, 31, 85, 92, 101, 109 und 119 können, vorbehaltlich einer in vitro-testung, wahrscheinlich nicht detektiert werden, da bei Sequenzanalysen Fehlpaarungen innerhalb der Primerbindungsstellen festgestellt wurden. HLA-B*73, mit einer Häufigkeit von 0,08 % in Deutschland ( Recherchestand ), wird mit dem vorliegenden Test ebenfalls erfasst. Das Maximum des Schmelzkurvenpeaks für HLA-B*73 liegt jedoch außerhalb des Toleranzbereiches für HLA-B*27 (siehe Auswertung). Die Erfassung weiterer, seltener HLA-Typen kann nicht ausgeschlossen werden, wurde aber bei der Bestimmung von 120 Proben im Rahmen der Leistungsbewertungsprüfung nicht beobachtet. 2. Wichtige Hinweise angegebene Lagerungstemperatur des Testkits einhalten Testkit ausschließlich für in-vitro-anwendungen benutzen Testkit stets anhand der beigefügten Bedienungsanleitung abarbeiten Testkit nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden zur Durchführung der Tests ist ein entsprechend eingerichtetes molekularbiologisches Labor sowie in in-vitro-dns-amplifikation geschultes Fachpersonal erforderlich bei der Abarbeitung des Tests sind stets Handschuhe zu tragen Patientenproben sollten als potentiell infektiös behandelt und nach der Verwendung dementsprechend entsorgt werden Reagenzien zur Durchführung der PCR getrennt von Patienten-DNS und Amplifikationsprodukten lagern

2 HLA-B*27-Realtime LT 2 - Version Testbestandteile Art.-Nr. Reagenzienbezeichnung Menge Lagertemperatur 326 Oligomix HLA-B*27 LT 2 (blauer Deckel) 2 Tubes mit je 100 µl Primer-/ Sondengemisch, gebrauchsfertig -20 C bis zur ersten Verwendung, angebrochene Tubes dann bei 4 C dunkel aufbewahren* * bei 4 C maximal 4 Wochen haltbar, nur dann wieder einfrieren, wenn eine Benutzung innerhalb der nächsten 4 Wochen nicht geplant ist. 4. Benötigte Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel, die nicht mitgeliefert werden zu untersuchende Patienten-DNS-Proben (genomische DNS, gelöst in Aqua dest. bzw. TE- Puffer) Positivkontrolle (für HLA-B*27 positive DNS) Mikropipetten (Volumenbereich 0, µl) mit sterilen, gestopften Pipettenspitzen (Filtertips) aus dem Kit LightCycler Faststart-DNA-Master HybProbe von Roche (Katalognr oder ): Vial Nr. 1a (rote Kappe) nach Herstelleranleitung mischen mit Vial Nr.1b (farblose Kappe), der daraus entstehende 10fach konzentrierte Fertigmix (enthält Taq-Polymerase, Nukleotide, MgCl 2 ) wird im Folgenden Roche-Mix genannt PCR-W asser LightCycler -Kapillaren (20 µl, für den LightCycler 2; Katalognr ) oder passende PCR-Gefäße für den LightCycler 480 LightCycler 2.0 oder 480 mit zugehöriger Steuer- und Auswertesoftware Farbkompensationsdatei, erstellt mit dem attomol Farbkompensationskit 2 (Art.-Nr. 1197) 5. Testprinzip Im vorliegenden Realtime-Test werden nach Isolierung der DNS aus Patientenblut der HLA-B*27 Locus einer Probe und ein Referenzgen, das als interner Standard dient, in einem Reaktionsansatz parallel vervielfältigt. Der Nachweis der Amplifikationsprodukte erfolgt durch Hybridisierung von spezifischen LoopTag 1) - Sonden. Die LoopTag-Sonden hybridisieren am verlängerten Primer, wodurch die Entstehung einer Sonden-Primer-Schleife und FRET vom Fluoreszenz-Donor-Farbstoff (D) zum Fluoreszenz-Akzeptor- Farbstoff (A) ermöglicht wird (Abb. 1). Die Dehybridisierung der Nachweissonde erfolgt während der Schmelzkurvenanalyse und bestätigt durch die spezifische Schmelztemperatur, dass der HLA-B*27- Locus amplifiziert wurde (siehe Arbeitsschritt Genotypisierung unter Punkt 6.). Die Amplifikation des internen Standards zeigt vor allem bei HLA-negativen Proben den korrekten Ablauf der PCR. Eine klinische Diagnose sollte nicht allein mit Hilfe der Ergebnisse einer einzelnen diagnostischen Methode erhoben werden. Zur Diagnoseerstellung sollten vom Arzt alle möglichen klinischen und Laborbefunde berücksichtigt werden. 3 A Primerelongation FRET A D 3 Abb. 1: LoopTag-Testprinzip Sondenhybridisierung 1) LoopTag ist eine von der Firma Attomol patentrechtlich geschützte Technologie (Patent-Nr. PCT/EP2008/057512).

3 HLA-B*27-Realtime LT 2 - Version Arbeitsanleitung Vor der erstmaligen Verwendung dieses Testkits ist unter Benutzung des attomol Farbkompensationskits 2 (Art.-Nr. 1197) eine Farbkompensationsdatei zu erstellen. Es wird empfohlen, in jeder Probenserie folgende Kontrollen mitzuführen: 1. Negativkontrolle (PCR-Leerwert) 2. Positivkontrolle (HLA-B*27-positive Probe) Die Positivkontrolle kann separat vom Hersteller dieses Testkits bezogen werden (Art.-Nr. 106). Bereits beim Anwender als HLA-B*27-positiv bestimmte Patientenproben können auch als Positivkontrolle verwendet werden. Arbeitsschritte: DNS-Präparation erfolgt aus Patientenblut nach Standardverfahren. Die dabei erhaltenen DNS- Proben (ca. 20 ng/µl) können unverdünnt eingesetzt werden. Hinweis: Bei auftretenden Problemen (schlechte Amplifikation, keine auswertbaren Schmelzkurven) ist zunächst eine Wiederholung des Tests mit verdünnter Proben-DNS (z.b. 1:10) durchzuführen. Oligomix auftauen, kurz schütteln und zentrifugieren, um gebildetes Kondenswasser zum Oligomix zurückzuführen. Lagerungshinweis: Nach Entnahme der benötigten Menge Oligomix das angebrochene Tube im Kühlschrank (dunkel) lagern, nur dann wieder einfrieren, wenn eine Benutzung innerhalb der nächsten Tage nicht geplant ist. Vor jeder Benutzung kurz zentrifugieren und mischen! Generell gilt: Den Oligomix so wenig wie möglich auftauen und wieder einfrieren. Herstellung des PCR-Mixes (es werden jeweils 8 µl PCR-Mix und 2 µl Proben-DNS für einen Ansatz benötigt) Zur Herstellung des PCR-Mixes werden je nach Probenzahl PCR-Wasser, Roche-Mix und Oligomix entsprechend der folgenden Tabelle in ein Eppendorfgefäß pipettiert und anschließend gut gemischt. Probenanzahl PCR-Wasser Roche-Mix Oligomix Probenanzahl PCR-Wasser Roche-Mix Oligomix 2 11,4 2, ,6 30, ,8 4, ,0 33, ,2 6, ,4 35, ,6 8, ,8 37, ,0 11, ,2 39, ,4 13, ,6 41, ,8 15, ,0 44, ,2 17, ,4 46, ,6 19, ,8 48, ,0 22, ,2 50, ,4 24, ,6 52, ,8 26, ,0 55, ,2 28,6 52 Pipettieren der Reaktionsansätze in LightCycler -Kapillaren bzw. -reaktionsgefäße Negativkontrolle: Positivkontrolle: Patientenbestimmung: 8 µl PCR-Mix 8 µl PCR-Mix 8 µl PCR-Mix + 2 µl PCR-Wasser + 2 µl DNS (HLA-B*27 positiv) + 2 µl DNS Kapillaren/Reaktionsgefäße verschließen und zentrifugieren PCR-Inkubation der Ansätze im LightCycler mit den im Anhang 1 aufgeführten Programmen Genotypisierung der Patientenproben durch Auswertung der Amplifikationssignale und der Schmelzkurvenpeaks (siehe untenstehende Auswertetabellen) Bei HLA-B*27-negativen oder nicht eindeutig bestimmten Proben muss überprüft werden, ob ein Signal für die Amplifikation des internen Standards vorliegt. Ist das nicht der Fall, liegt eine Inhibition der PCR dieser Probe vor und der Test muss wiederholt werden (Probe dafür evtl. verdünnen oder DNS-Extraktion wiederholen).

4 HLA-B*27-Realtime LT 2 - Version Auswertekriterien: HLA-B*27 positive Proben: LC 2.0 LC HLA-B*27 Amplifikationssignal bei 710 nm mit deutlichem exponentiellen bzw. sigmoidalen Anstieg, c t-wert < 40, Schmelzkurvenpeak bei 65 C ± 2 C Amplifikationssignal bei 660, 670 oder 705 nm mit deutlichem exponentiellen bzw. sigmoidalen Anstieg, c t-wert < 40, Schmelzkurvenpeak bei 65 C ± 2 C HLA-B*27 negative Proben: LC 2.0 LC HLA-B*27 kein Amplifikationssignal bei 710 nm, Kurvenverlauf gerade, auch mit leichtem, kontinuierlichem Anstieg möglich, ohne Schmelzkurvenpeak oder Schmelzkurvenpeak liegt außerhalb des Toleranzbereiches von 65 C ± 2 C (z.b. bei HLA-B*73) kein Amplifikationssignal bei 660, 670 oder 705 nm, Kurvenverlauf gerade, auch mit leichtem, kontinuierlichem Anstieg möglich, ohne Schmelzkurvenpeak oder Schmelzkurvenpeak liegt außerhalb des Toleranzbereiches von 65 C ± 2 C (z.b. bei HLA-B*73) 1 Wellenlängen je nach vorhandenem Filtersatz auswählen interner Standard Amplifikationssignal bei 560/530 nm mit sigmoidalem oder exponentiellem Anstieg, c t-wert < 36, darf bei stark HLA-B*27-positiven Proben auch ausfallen Amplifikationssignal bei 568 oder 580 nm mit sigmoidalem oder exponentiellem Anstieg, c t-wert < 36, darf bei stark HLA-B*27-positiven Proben auch ausfallen interner Standard Amplifikationssignal bei 560/530 nm mit sigmoidalem oder exponentiellem Anstieg, c t-wert < 36 Amplifikationssignal bei 568 oder 580 nm mit sigmoidalem oder exponentiellem Anstieg, c t-wert < 36 Abb. 2: Beispiele für die Auswertung einer HLA-B*27-positiven Probe (rote Kurve), einer negativen Probe (blaue Kurve) und der Leerwertkontrolle (Negativkontrolle, schwarze Kurve) Die Beispieldaten wurden mit einem Lightcycler 480 aufgenommen. A: Amplifikationskurven für HLA-B*27 B: Schmelzkurven für HLA-B*27 C: Amplifikationskurven für den internen Standard Bei eventuell auftretenden Problemen während der Testdurchführung oder -auswertung wenden Sie sich bitte an den Hersteller.

5 HLA-B*27-Realtime LT 2 - Version Anhang 1 Die für die Anregung und die Detektion erforderlichen Wellenlängen sind folgender Tabelle zu entnehmen: Anregung Messung für HLA-B*27 Messung für den internen Standard (IS) LC 2.0 automatisch 710 nm (F6) 560/530 nm (F2/F1) LC 480 HLA-B*27: 483 oder 498 nm 1 660, 670 oder 705 nm 1 IS: 523 oder 533 nm oder 580 nm 1 1 Wellenlängen je nach vorhandenem Filtersatz auswählen Für die Durchführung der PCR und die anschließende Auswertung sind die nachfolgend angegebenen LightCycler -Programme zu verwenden. Programm für LC 2.0 Programm für LC 480 Program: Aktivierung; Type: None; Cycles: 1 Program: Aktivierung; Analysis : None; Cycles: 1 Temperature Hold Time Slope Target Hold Ramp Rate Target ( C) (sec) ( C/sec) ( C) (s) ( C/s) none 95 none Program: Amplifikation; Type: Quantification; Cycles: 45 Program: Amplifikation; Analysis : Quantification; Cycles: 45 Temperature Target ( C) Hold Time (sec) Slope ( C/sec) Target ( C) Hold (s) Ramp Rate ( C/s) none 95 none single 62 single none 72 none Program: Schmelzkurve; Type: Melt. Curves; Cycles: 1 Program: Schmelzkurve; Analysis : Melt. Curves; Cycles: 1 Temperature Target ( C) Hold Time (sec) Slope ( C/sec) Target ( C) Hold (s) Ramp Rate ( C/s) none 95 none none 50 none none 40 none continuous 80 continuous Program: Kühlen; Type: None; Cycles: 1 Program: Kühlen; Analysis : None; Cycles: 1 Temperature Hold Time Slope Target Hold Ramp Rate Target ( C) (sec) ( C/sec) ( C) (s) ( C/s) none 40 none Anhang 2 Übersicht über die verwendeten Etikettensymbole Erklärung der Symbole h Hersteller l Chargennummer v verwendbar bis explanation of symbols manufacturer batch number expiry date 2 t 6 Lagerung zwischen +2 C und +6 C store between +2 C and +6 C o -20 Lagerung bei maximal -20 C store at a maximum of -20 C b Bestellnummer i In-vitro-Diagnostikum pn g Inhalt ausreichend für <n> Bestimmungen Gebrauchsanweisung beachten catalogue number in vitro diagnostic medical devices content sufficient for <n> determinations consult instructions for use