Kleinhenz, Silvia und Gertrud Eigner (2007) Mitteilungsblatt der Fleischforschung Kulmbach 46, Nr. 175, 21-26

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1 , Entwicklung einer Aufarbeitungsmethode zur Bestimmung von Sudan- und Azofarbstoffen in Fleischerzeugnissen mittels LC-MS bzw. HPLC-UV Development of a clean-up procedure to determine Sudan and azo dyes in meat products by applying LC-MS or HPLC-UV Silvia KLEINHENZ und Gertrud EIGNER Zusammenfassung Sudanfarbstoffe sind synthetisch hergestellte Stoffe, die trotz fehlender Zulassung in Europa häufig wegen ihres weiten Farbspektrums den Lebensmitteln, vor allem Chili- und Paprika- Gewürzen zugesetzt werden. Da sie im Verdacht stehen, Krebs erregend und mutagen wirksam zu sein, sollten Analysenmethoden erarbeitet werden, um diese Farbstoffe in Lebensmitteln zu detektieren. Nachweismethoden für diese Stoffe in Gewürzen existieren bereits. Da Gewürze jedoch auch in Fleischerzeugnissen eingesetzt werden, sollte im Folgenden eine qualitative und quantitative Bestimmungsmethode für diese Lebensmittelgruppe erarbeitet werden. Mit Hilfe der entwickelten Probenextraktion bzw. der Fettabtrennung können nun an einer HPLC-UV/VIS- bzw. einer LC-MS-Anlage unter Einsatz einer Zorbax Eclipse XDB-C8-Säule und einem geeigneten Gradienten die verschiedenen Sudanfarbstoffe getrennt voneinander detektiert werden. Summary Sudan dyes are synthetically produced substances. Despite not existing admittance in Europe these dyes are still used in food particularly in chili and red pepper spices. They are suspected to be both carcinogenic and mutagenic. Therefore methods for analyzing these dyes in different food matrices should be developed. Some methods already exist to detect the forbidden dyes in spices. Because spices are applied during the production of meat products, a qualitative and quantitative method to detect the Sudan and azo dyes in this matrix had to be designed. With the help of the developed sample extraction and fat separation these dyes can be detected with HPLC-UV/VIS or LC-MS working with a Zorbax Eclipse XDB-C8 column and a specific gradient. Schlüsselwörter Key Words Sudanfarbstoffe Azofarbstoffe Fleischerzeugnisse Methodenentwicklung LC-MS HPLC-UV Sudan dyes azo dyes meat products method development LC-MS HPLC-UV Einleitung Sudanfarbstoffe sind synthetisch hergestellte Azofarbstoffe, die in der Natur nicht vorkommen. Deshalb ist ein Nachweis dieser Farbstoffe in Lebensmitteln ausschließlich durch bewussten Zusatz zu erklären. Bewusst zugesetzte Farbstoffe zählen zur großen Gruppe von Zusatzstoffen. Zusatzstoffe dürfen allerdings nur dann eingesetzt werden, wenn sie eigens zugelassen wurden, d. h., dass neu entwickelte Zusatzstoffe grundsätzlich erst verboten sind, bis zu dem Zeitpunkt, an dem sie ausdrücklich erlaubt werden. Eine solche Zulassung existiert für Sudan- und Azofarbstoffe nicht. Es ist also verboten, diese Substanzen Lebensmitteln zuzusetzen. 21

2 Dennoch wurden in den letzten Jahren durch verschiedene Staaten der Europäischen Union vermehrt die Farbstoffe Sudan I bis IV in Lebensmitteln, insbesondere in scharfem Chilipulver aus Drittländern, nachgewiesen. Es herrschte also Handlungsbedarf. Deshalb wurden EUweite Regelungen getroffen, welche die verbotene Verwendung von Sudan I bis IV in Lebensmitteln noch stärker kontrollieren. Noch heute sind Sudan I und andere Azofarbstoffe, wie Pararot oder Buttergelb, Ursache für Meldungen im Europäischen Schnellwarnsystem (Rapid Alert System for Food and Feed, RASFF) [1]. Die aktuellste Beanstandung (Stand: 1. Kalenderwoche 2007) stammt vom 14. Dezember Dort wurden Sudanrot I und IV in einer Gewürzzubereitung für Geflügel aus der Türkei durch das Importland Deutschland beanstandet. Es stellt sich die Frage, wie überprüft werden kann, dass nicht etwa ein Gewürz bei der Wurstproduktion verwendet wurde, das mit Sudanfarbstoffen kontaminiert war. Oder, wie können Fleischerzeugnisse auf ihren Sudanfarbstoffgehalt überprüft werden, wenn von einer Rückrufaktion betroffene gefärbte Gewürze eingesetzt wurden? Verwendung von Sudanfarbstoffen Verwendung finden die Sudanfarbstoffe aufgrund ihrer vielfältigen und sehr ansprechenden Farbschattierungen beim Färben von Mineralöl-Produkten, von Wachserzeugnissen sowie zur Herstellung von Kugelschreiberpasten, Tuschen und Filzschreibern. Am bekanntesten neben Sudan I bis IV ist mit Sicherheit das zur Kennzeichnung von Heizöl verwendete farblose Solvent Yellow 124, das im sauren Milieu zu einem intensiv roten Farbstoff reagiert, der sich in der wässrigen Phase anreichert und damit sehr einfach und schnell nachweisbar ist. Toxizität von Sudanfarbstoffen Sudanfarbstoffe, beziehungsweise Azofarbstoffe im Allgemeinen, stehen im Verdacht, Krebs erregend zu sein. Außerdem sollen diese Farbstoffe mutagen wirksam sein. Die Mutagenität soll aus einer im menschlichen Körper stattfindenden Azospaltung der Farbstoffmoleküle resultieren, bei der sich Amine bilden können, die in der Lage sind, mit dem menschlichen Erbgut in Interaktion zu treten und es damit zu schädigen. Sudan I kann überdies bei Kontakt mit der Haut oder beim Einatmen als Staub sensibilisierende Wirkung haben [2]. Diese Risiken sind Ursache für eine strikte Regelung der Verwendung von Sudanfarbstoffen. Rechtliche Aspekte Die Tatsache, dass noch immer Sudan I in Lebensmitteln gefunden wurde, war der Auslöser dafür, dass die Europäische Kommission am 20. Juni 2003 eine Entscheidung über Dringlichkeitsmaßnahmen (2003/460/EG) [3] erlassen hat. Danach ist in den Mitgliedsstaaten der EU die Einfuhr von scharfen Chilis und scharfen Chilierzeugnissen aus Drittländern komplett verboten, wenn nicht durch einen Analysenbericht bestätigt wird, dass kein Sudan I nachweisbar ist. Durch die Entscheidung 2004/92/EG der Kommission vom 21. Januar 2004 [4] wurde die Palette der zu untersuchenden Produkte von Chilis und Chilierzeugnissen (entspricht Curry) auf Paprikapulver, Kurkuma und Palmöl ausgeweitet. Außerdem ist ein Analysenbericht für Sudan II, Sudan III, und Sudan IV verpflichtend, da sie noch immer in Lebensmitteln nachgewiesen wurden und durch ihre sehr ähnliche Struktur zu Sudan I ebenfalls als kanzerogen eingestuft werden. Bestehende Methoden zur Bestimmung von Sudan- und Azofarbstoffen Weder der qualitative noch der quantitative Nachweis von Sudanfarbstoffen, die verbotenerweise in Lebensmitteln eingesetzt werden, lassen sich ohne Probleme aufgrund der komplizierten Matrices von Lebensmitteln durchführen. In Landesuntersuchungsämtern werden die 22

3 Sudanfarbstoffe üblicherweise in einem Screening-Verfahren mittels Dünnschichtchromatographie bestimmt. Wenn dort positive Befunde ermittelt werden, wird eine Absicherung dieser Ergebnisse durch empfindlichere Verfahren mittels HPLC/ Diodenarray-Detektor (DAD) oder HPLC/ MS-MS durchgeführt. Die dabei verwendeten und auch die in anderen Laboratorien entwickelten Methoden sind vielfältig. Einige der Methoden sind sehr empfindlich mit Nachweisgrenzen unter 1 mg/kg (ppm) und kommen in ähnliche Konzentrationsbereiche, wie sie für Fleischerzeugnisse nötig wären. Allerdings gelten diese Methoden nur für Gewürze, Soßen und Palmöl. Für den Nachweis und die Bestimmung von Sudanfarbstoffen in Wurst oder für eiweißreiche erhitzte Produkte wurde noch keine adäquate Analytik entwickelt. Entwicklung einer Methode zur Bestimmung von Sudan- und Azofarbstoffen in Fleischerzeugnissen Sudanfarbstoffe, die verbotenerweise durch Gewürze in die Wurst gelangten, sollen in Fleischerzeugnissen durch eine geeignete Aufarbeitung sowohl qualitativ als auch quantitativ bestimmt werden. Die Schwierigkeit der quantitativen Bestimmung von Sudanfarbstoffen in Fleischerzeugnissen liegt neben der Entfernung der großen Mengen an Fett darin, die Farbstoffe vom Eiweiß zu lösen, da sie aufgrund ihrer chemischen Struktur eine besonders feste Bindung zum Eiweiß aufbauen. Für die allgemeine Probenvorbereitung wurde zunächst eine Modellbrühwurst (Lyoner) hergestellt. Dabei handelt es sich um handelsübliche Brühwürste, denen nach dem Garen Farbstofflösungen zugesetzt wurden. Bei diesen Modellwürsten konnte die Abtrennung großer Mengen Fett erarbeitet werden. Durch den Zusatz von Farbstofflösungen zum Brät wurde im Anschluss die Anwendbarkeit der Methode an realen Produkten und nochmals die Extraktion überprüft. Damit konnte das Lösen der Farbstoffe vom Eiweiß besser simuliert und später überprüft werden. Vorläufige Methode zur Aufarbeitung von Fleischerzeugnisproben für die Sudan- und Azofarbstoffbestimmung 20 g homogenisierte Probe werden im Bühlerhomogenisator dreimal mit jeweils 40 ml Extraktionsgemisch (n-hexan/ Cyclohexan/Ethylacetat/Acetonitril/Aceton, 1/1/1/1/1) extrahiert und über eine 1G3- Fritte abfiltriert. Nach Abrotieren des Lösungsmittels wird der Fettrückstand mit 50 ml Petrolether (40-60 C) wieder aufgenommen und mit 50 ml Dimethylformamid (DMF) ausgeschüttelt. Die DMF- Phase wird mit Petrolether gereinigt und anschließend mit ca. 200 ml 10%iger Zitronensäure verdünnt bzw. angesäuert. Die Farbstoffe werden aus der DMF- Phase durch Cyclohexan extrahiert. Die Extraktion wird nach erneutem Ansäuern mit 30 ml konzentrierter Salzsäure wiederholt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels aus den vereinigten Extrakten werden die zu bestimmenden Farbstoffe mit Acetonitril aufgenommen und mittels HPLC-UV/VIS bzw. HPLC-MS vermessen (Abb. 1). Dafür wurden die HPLC-Bedingungen nach Hönicke et al. (2006) [5] mit verändertem Fluss verwendet: Säule Zorbax Eclipse XDB-C8, 150 x 4,6 mm, 5 µm (Agilent) Säulenofen 40 C Eluent Fluss Injektionsvolumen Detektion A: H 2 O (0,1 % Ameisensäure) B: Acetonitril (0,1 % Ameisensäure) Start: A: 30 %; B: 70 % In 5 min auf A: 5 %; B: 95 %, dann 25 min konstant 0,2 ml/min 3 µl - UV/VIS-Spektrometer: 480 nm - Ionenfalle (ESI-Quelle) 23

4 Tab. 1: Strukturformeln und Bezeichnungen der Farbstoffe, die mit der entwickelten Methode bestimmt werden können Substanz Synonyme CAS-Nr. Strukturformel Sudan I Sudan Gelb Sudan Orange R Solvent Yellow 14 1-Phenylazo Sudan II Sudan Orange Solvent Orange 7 1-(2,4-Dimethylbenzolazo) Sudan III Sudan red Ceresinrot Solvent Red 23 1-[(4-Benzolazo)-benzolazo] Sudan IV Scharlachrot Solvent Red 24 Ölrot 2B 2,3-Dimethyl-4-(2-hydroxy-1- naphthylazo)-azobenzol Pararot Nitroanilinrot 1-(4-Nitrobenzolazo)-2-1-(4-Nitrophenylazo) Buttergelb Dimethylgelb Sudanrot 7B Ceresrot 7B Solvent Red 19 N-ethyl-1-[[p- (phenylazo)phenyl]azo]-2- naphthalenamin Sudanrot G Fettrot G Oelrot 113 Solvent Red 1 1-(2-Methoxyphenylazo)

5 Die zu bestimmenden Farbstoffe wurden auf Sudan I bis Sudan IV, Pararot, Buttergelb, Sudanrot G und Sudanrot 7B (Tab. 1) eingegrenzt. Bei den HPLC- MS/MS-Messungen wurden in Standardfarblösungen die Nachweisgrenzen für Sudan I, II und IV ebenso wie für Buttergelb, Sudanrot G und Sudanrot 7B mit Werten unter 10 ng/ml erreicht. Die beiden Farbstoffe Sudan III und Pararot waren bei Konzentrationen bis zu 20 ng/ml nachzuweisen. Bei der zu verwendenden Probeneinwaage von 20 g Fleischerzeugnis können Farbstoffe bis zu einem Gehalt von unter 1 µg/kg (ppb) nachgewiesen werden. Pararot Sudanrot G Sudan 1 Sudan 4 Sudan 3 Sudan 2 Buttergelb Sudanrot 7B Abb. 1: In türkis: UV/VIS-Chromatogramm eines Farbstoffgemisches in Brühwurst, das nach dem beschriebenen Clean-up aufgearbeitet wurde, nach Auftrennung mittels genannter HPLC- Methode. Als Beispiel für die sehr empfindliche MS/MS-Detektion sind für diesen Lauf in rot der MS/MS-Peak für Buttergelb und in grün der MS/MS-Peak für Sudanrot 7B dargestellt. Es ist eine minimale zeitliche Verschiebung festzustellen, da das UV/VIS-Spektrometer dem Massenspektrometer vorgeschaltet ist Mit dieser Aufarbeitungsmethode konnten in gegarten Fleischerzeugnissen am Beispiel von Brühwürsten, die im Nachhinein mit Sudanfarbstoffen aufdotiert wurden, Wiederfindungen zwischen 86 und 101 % erreicht werden. Dabei wurde das Fett quantitativ entfernt und die Sudanfarbstoffe konnten noch sehr gut vom Eiweiß abgelöst werden, da sie noch keine zu festen Bindungen mit dem Eiweiß aufgebaut hatten. Das Problem der zu festen Bindung an Eiweiß tritt erst dann auf, wenn die zu analysierenden Farbstoffe bereits dem rohen Brät zugesetzt werden. Sie erhöhen sich sogar noch, wenn dieses Brät anschließend erhitzt wird. Bei solchen Produkten wurden weniger zufriedenstellende Wiederfindungsraten erreicht, die noch verbessert werden müssen. Erste positive Ergebnisse konnten durch Ansäuern der Probenlösung mit Zitronensäure bereits während der Extraktion erzielt werden. Schlussfolgerung Aufgrund der Tatsache, dass Lebensmittel keine Sudan- und Azofarbstoffe enthalten dürfen, sind die unbefriedigenden Wieder- 25

6 findungsraten ohne Belang. Ausschlaggebend ist nämlich bereits ein qualitativer Nachweis von Sudanfarbstoffen, der eine Beanstandung des Produkts nach sich zieht, da Sudanfarbstoffe in Lebensmitteln grundsätzlich verboten sind, auch wenn sie nicht zum Färben eingesetzt wurden, sondern lediglich in nicht mehr färbenden Konzentrationen durch Kontamination ins Produkt gelangt sind. Deshalb ist es wichtig, dass diese Farbstoffe auch in Fleischerzeugnissen und nicht nur in Gewürzen nachweisbar sind. Literatur [1] Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Schnellwarnungen RASFF: Lebensmittelsicherheit / Täglich aktualisierte Liste: Dezember / Stand [2] BfR, Bundesamt für Risikobewertung, Farbstoffe Sudan I bis IV in Lebensmitteln, Stellungnahme vom [3] EU-Kommission (2003/460/EG): Entscheidung der Kommission vom 20. Juni 2003 über Dringlichkeitsmaßnahmen hinsichtlich scharfer Chilis und scharfer Chilierzeugnisse; Amtsblatt Nr. L 154 vom 21/06/2003 S [4] EU-Kommission (2004/92/EG): Entscheidung der Kommission vom 21. Januar 2004 über Dringlichkeitsmaßnahmen hinsichtlich Chilis und Chilierzeugnissen; Amtsblatt Nr. L 027 vom 30/01/2004 S [5] Hoenicke, K.; Mass, S.; Gatermann, R.; Ultraspurenkonzentrationen von Sudanfarbstoffen und anderen verbotenen Farbstoffen in Gewürzen und Oleoresinen Ein analytischer Artefakt oder eine Kontamination? Poster zum 35. Lebensmittelchemikertag 2006 in Dresden 26