Probenvorbereitung für die REM- und AFM-Analyse

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1 Probenvorbereitung für die REM- und AFM-Analyse Einleitung Entscheidend für die Abbildung und Analyse biologischer Strukturen ist die Methode, mit der die Probe für die Untersuchung im Rasterelektronenmikroskop oder Rasterkraftmikroskop vorbereitet wird. Die Auflösungsgrenze der Elektronenmikroskopie selbst liegt bei ca. 1 nm, die der Rasterkraftmikroskopie (AFM) reicht bis in den atomaren Bereich. Um eine hohe Abbildungsqualität zu gewährleisten, ist es wichtig, eine lebensnahe Abbildung zu erzielen. Die Präparationsmethode muss also das Ziel haben, die biologische Struktur zum Zeitpunkt der Probenentnahme zu fixieren und alle funktionellen Abläufe in der Probe zu unterbinden, bis diese mit den Mikroskopen charakterisiert werden kann. Im Praktikum wird dies durch eine chemische Fixierung bei Raumtemperatur erreicht. Hierzu werden zu Beginn des Versuchs die Proben mit Glutaraldehyd versetzt, welches die Proteine innerhalb einer Zelle vernetzt (Abb. 1). Abb.1: Ablauf der Probenpräparation für eine REM Analyse. 1

2 Das Fixativ wird durch einen Puffer transportiert und berührt als erstes die Zellmembran der Probe. Während diese quervernetzt, diffundiert das Glutaraldehyd weiter ins Zentrum der Probe. Je dicker die zu fixierende Probe ist, desto langsamer erfolgt die Fixierung. Die Ursachen hierfür sind: - Konzentrationsunterschiede, die beim Eindringen des Fixativs in die Probe entstehen. - Minderung der Diffusionsgeschwindigkeiten durch bereits erfolgte Quervernetzung. Ein Nachteil der chemischen Fixierung besteht darin, dass sie nur sehr rigide Strukturen unbeschadet lässt. Die Reaktion der Fixantien mit dem biologischen System, besitzt ein hohes Artefaktpotential. Bei der Fixierung von Mikroorganismen sind hierfür besonders Gram-negative Arten anfällig. Alternative Fixierungsmethoden, wie z.b. die Kryofixierung, sind schonender und besitzen ein geringeres Artefaktpotential. Der hohe Wassergehalt der chemisch fixierten Proben zwingt zu einer anschließenden Entwässerung des biologischen Materials. Unter Hochvakuumbedingungen (z.b. in einem Rasterelektronenmikroskop) würde das Wasser verdampfen und die biologische Struktur schädigen. Das Trocknen der Präparate durch Verdunstung des Wassers führt zu starken Strukturzerstörungen aufgrund der Einwirkung von Oberflächenspannungen. Ein Austausch des Wassers gegen Flüssigkeiten mit geringerer Oberflächenspannung (=Entwässerung) und anschließender Trocknung durch Verdunstung der Substitutionsflüssigkeit bringt eine gewisse Verbesserung für den morphologischen Strukturerhalt. Ein Beispiel hierfür ist die Lufttrocknung mit Hexamethyldisalazan (HMDS). Erstrebenswert ist eine Trocknung, bei der Oberflächenspannungen überhaupt nicht auftreten und deshalb auch nicht stören können. Diese Bedingungen findet man vor, wenn ein flüssigkeitsgetränktes Präparat jenseits des "kritischen Punktes" der Flüssigkeit getrocknet wird. In einem geschlossenen Behälter ist der kritische Punkt einer Flüssigkeit durch eine bestimmte Temperatur (kritische Temperatur = größtmögliche Temperatur, bei der die flüssige Phase einer Substanz noch auftreten kann) und einen dazugehörigen bestimmten Druck (kritischer Druck) definiert. Diese Art der Trocknung wird als. Kritische-Punkt-Trocknung (KPT; englisch: CPD von "critical point drying") bezeichnet. Der kritische Punkt von Wasser liegt bei 219 bar und einer Temperatur von 374 C. Diese Werte sind für biologisches Material unbrauchbar. Man verwendet deshalb für die Kritisch-Punkt-Trocknung biologischer Proben andere Substanzen, wie z.b. CO 2 (Kritischer Punkt bei 73,8bar und 31 C) (Abb.2). Jenseits des Kritischen Punktes liegt CO 2 als überkritisches Fluid (CO 2 (sc), Abb.2) vor. In diesem Zustand sind Flüssigkeits- und Gasform nicht mehr unterscheidbar. 2

3 Abb. 2: Phasendiagramm von CO 2. Pt, Tripelpunkt; Pc, kritischer Punkt, CO 2 (s), festes CO 2 (Trockeneis); CO 2 (l), flüssiges CO 2 ; CO 2 (g), gasförmiges CO 2 ; CO 2 (sc), überkritisches Fluid; A, Ausgangszustand bei der Kritischen-Punkt-Trocknung (KPT), B, Trocknung am Kritischen-Punkt, C. Endzustand bei der KPT. Als Voraussetzung für die Kritische-Punkt-Trocknung bzw. eine Lufttrocknung mit Hexamethyldisilazan (HMDS) muss das Wasser aus den Proben entfernt werden, indem man dieses durch eine aufsteigende Alkoholreihe mit 30%, 50%, 70%, 90% und 100 % Propanol oder Ethanol substituiert. Bei der Kritische-Punkt-Trocknung werden die Proben anschließend in die Druckkammer der KPT-Anlage überführt, Um eine Austrocknung des Präparates durch verdunstenden Alkohol zu vermeiden darf die Probe erst kurz vor dem Start der KPT- Trocknung in den Probenhalter überführt werden. In der Druckkammer der KPT-Anlage wird der Alkohol schrittweise durch C0 2, das bei Zimmertemperatur bereits unter einem Druck von ca. 55bar flüssig ist (Fig. 2, A), verdrängt. Ist die Probe vollständig mit reinem C0 2 durchtränkt und umgeben, kann die Temperatur in der Druckkammer erhöht werden. Damit steigt auch der Druck in der Kammer an. Liegen Druck und Temperatur über den kritischen Werten, wird der Druck gesenkt, wobei die Temperatur weiterhin über der kritischen Temperatur bleiben muss (Fig. 2, B). Sobald der Normaldruck erreicht ist, kann die Probe getrocknet entnommen werden (Fig. 2, C). 3

4 Im Vergleich zur Kritische-Punkt.Trocknung ist der apparative Aufwand bei der Lufttrocknung mit HMDS deutlich geringer. Hierbei werden die Proben nach der Entwässerung mit Hexamethyldisilazan (HMDS) inkubiert und anschließend an der Luft getrocknet. Material und Methoden Verwendete Lösungen: - Fixierlösung: 100mM Phosphatpuffer, ph 7,5, 2,5% Glutaraldehyd - Phosphatpuffer: 100mM, ph 7,5-30%, 50%, 70%, 80%, 90%,100% Ethanollösung - H 2 O deion. - Hexamethyldisalazan (HMDS) Lösung - Glutaraldehydlösung 50% GLUTARALDEHYD UND HMDS SIND GIFTIGE SUBSTANZEN! HANDSCHUHE TRA- GEN UND FLÜSSIGABFÄLLE GESONDERT SAMMELN! ARBEITEN MIT HMDS (AGGRESSIVE DÄMPFE) ERFOLGEN NUR UNTER DEM ABZUG BZW. DER STERILEN WERKBANK! Verwendete KPT-Apparatur Für die Kritische-Punkt-Trocknung wird eine Leica EM CPD030 Apparatur verwendet. Probenmaterial: Als Probenmaterial werden folgende Mikroorganismen-haltige Materialien eingesetzt: Einzellig wachsende Hefe-/Bakterienstämme - Flüssigkultur von Saccharomyces cerevisiae - Flüssigkultur von Staphylococcus carnosus - Flüssigkultur von Bacillus megaterium Bewachsene Membranfilter: - bewachsener Membranfilter mit Streptomyces coelicolor M146 - bewachsener Membranfilter mit Aspergillus niger - bewachsener Membranfilter mit Streptomyces viridochromogenes - bewachsener Membranfilter mit Actinoplanes friuliensis 4

5 Sporensuspensionen - Sporensuspension von Streptomyces coelicolor M146 - Sporensuspension von Streptomyces viridochromogens Tü494 Verwendet Medien zur Anzucht von Mikroorganismen: LB- Medium: Bacillus megaterium, Staphylococcus carnosus, PYD-Medium: Saccharomyces cerevisiae Hefe-Malz-Medium (HM)-Medium: Aspergillus niger Sojamehl-Mannit-Medium: Streptomyces coelicolor M146, Streptomyces viridochromogenes Tü494 Anzucht von Mikroorganismen (im Praktikum werden die Kulturen gestellt) Einzellige Mikroorganismen: 20ml des jeweiligen Anzuchtmediums in 100ml Erlenmeyerkolben werden mit 750µl Zellsuspension von Übernachtkulturen der verwendeten einzellig wachsenden Stämme beimpft und im Schüttelinkubator kultiviert. Die Kulturen werden bis zu einer OD 600nm von 0,7 im Schüttelinkubator angezogen (Saccharomyces cerevisiae bei28 C; Bacillus megaterium, Staphylococcus carnosus bei 37 C). Myzelartigwachsende Bakterien und Pilze: Auf die entsprechenden Nährmedienagarplatten werden sterile Celluloseacetatfilter (0,45µm Porengröße) aufgelegt. Die Platten werden anschließend mit Zellmaterial von einer bewachsenen Agarplatte oder einer Flüssigkultur bzw. mit Sporen flächig beimpft. Danach erfolgte eine Inkubation für 5-7 Tage bei 28 C. Vorgehensweise Probenvorbereitung für die REM-Analyse: Bakterien-/Hefe-Flüssigkulturen (Luftrocknung mit HMDS): - Zellen von 5ml einer Flüssigkultur werden durch Zentrifugation (3500rpm = 2451g, 7min) in einem 15ml Falcontube pelletiert. - Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden einmal mit 3ml Phosphatpuffer (100mM, ph 7,5) gewaschen (Zentrifugation s. oben). Proteinfixierung: - Die Zellen werden abzentrifugiert (s.o) und das erhaltene Pellet in einer geringen Menge (100µl) Phosphatpuffer resuspendiert. Die Zellsuspension wird dann in ein 2ml Eppendorfgefäß überführt. Anschließend erfolgt die Zugabe von 2ml Fixierungslösung. - Fixierung durch Inkubation für 20min bei RT auf dem Schüttler 5

6 Entwässerung der Proben: - Zentrifugation (Biofuge Pico, 6000rpm, 2500g) und anschließendes Resuspendieren der Zellen in 2ml H 2 O deion.; Inkubation für 7 min - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Zellen zuerst im Rücklauf und dann in 2ml 30% - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Zellen in 2ml 50% - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Zellen in 2ml 70% - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Zellen in 2ml 90% - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Zellen in 2ml 100% - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Zellen in wenig (Abschätzung anhand der Größe des erhaltenen Zellpellets) Hexamethyldisalazan (HMDS); Inkubation mindestens 7min. - Auftropfen bzw. Aufsaugen von 10-50µl Zellsuspension (bei niedrig konzentrierten Lösungen auch mehr) auf Celluloseacetatfilter (0,2µm Porengröße) und trocknen der Filter unter dem Abzug bzw. der sterilen Werkbank - Lagerung der getrockneten Proben im Exsikkator bis zur Detektion im REM. Bewachsener Membranfilter mit Streptomyces coelicolor, Streptomyces viridochromogenes, Actinoplanes friuliensis und Aspergillus niger (Kritische.Punkt- Trocknung) Fixierung: - Stücke eines gut bewachsenen Membranfilters werden in ein Gefäß mit 3ml Phosphatpuffer überführt und für mindestens 5min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. - danach vorsichtiges Abgießen der Lösung und dann Zugabe von 3ml Fixierungslösung und Inkubation für 20min bei RT. Entwässerung der Proben: - danach vorsichtiges Abgießen der Lösung und dann Zugabe von 3ml H 2 O deion. ; Inkubation für mindestens 7min bei Raumtemperatur (RT) - danach vorsichtiges Abgießen der Lösung und dann Zugabe von 3ml 30% Ethanol; Inkubation für mindestens 7min bei RT. - danach vorsichtiges Abgießen der Lösung und dann Zugabe von 3ml 50% Ethanol; Inkubation für mindestens 7min bei RT. - danach vorsichtiges Abgießen der Lösung und dann Zugabe von in 3ml 70% Ethanol; Inkubation für mindestens 7min bei RT. - danach vorsichtiges Abgießen der Lösung und dann Zugabe von in 3ml 90% Ethanol; Inkubation für mindestens 7min bei RT. - danach vorsichtiges Abgießen der Lösung und dann Zugabe von 3ml 100% Ethanol; Inkubation für mindestens 7min. 6

7 - um eine Austrocknung durch verdunstenden Alkohol zu vermeiden werden die entwässerten Proben erst kurz vor Beginn der Kritische-Punkt-Trocknung in den Probenhalter überführt. Sporensuspensionen von Streptomyceten (Lufttrocknung mit HMDS): - Sporen von 200µl Sporensuspenison werden durch Zentrifugation pelletiert (Biofuge Pico, 13000rpm, 12000g, 3min). - Der Überstand wird verworfen und die Sporen einmal mit 1ml Phosphatpuffer gewaschen (Zentrifugation s. oben) - Die Sporen werden dann in 1ml Fixierungslösung für 20min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Sporen in 1ml H 2 O deion ; Inkubation mindestens 7min. - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Sporen zuerst im Rücklauf und dann in 1ml 30% Ethanol; Inkubation mindestens 10min. - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Sporen in 1ml 50% - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Sporen in 1ml 70% - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Sporen in 1ml 90% - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Sporen in 1ml 100% - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Sporen in 0,2ml Hexamethyldisilazan (HMDS); Inkubation mindestens 7min. - Auftropfen bzw. Aufsaugen von 10-50µl Sporensuspension auf Celluloseacetatfilter und Trocknen der Filter unter dem Abzug bzw. der sterilen Werkbank - Lagerung der getrockneten Proben im Exsikkator bis zur Detektion im REM. Durchführung der Kritische-Punkt-Trocknung (Kurzanleitung Leica EM CPD030) - Probenkammer mit 99,8% Ethanol p.a. füllen, Flüssigkeitsstand unteres Drittel des Sichtfensters - Präparate in den Probenhalter überführen, diesen verschließen und in die Probenkammer mit Ethanol einbringen - Darauf achten, dass der Probenhalter richtig eingebracht wird (Führungsschiene). Der Probenhalter muss ganz unten auf Boden aufliegen und gerade so von Ethanol bedeckt sein! - Probenkammer schließen, Rührer anschalten: Stirrer drücken - Cooling" drücken, Probenkammer auf 10 C kühlen - Die CO 2 -Gasflasche (Gasflasche mit Steigrohr) aufdrehen und das CO 2 durch Drücken von "Medium-in" in die Probenkammer einlassen, bis der Flüssigkeitsstand gerade noch im Sichtfenster zu sehen ist 7

8 - CO 2 -Zufuhr durch erneutes Drücken von "Medium-in" anhalten - Es bildeten sich Schlieren, welche durch Rühren nach kurzer Zeit verschwinden, dann Medium-out" drücken bis die Proben gerade noch mit Flüssigkeit bedeckt sind. - Ablassen der Flüssigkeit durch erneutes Drücken von "Medium-out" beenden. - Den gesamten Vorgang zum Mischen von CO 2 und Ethanol viermal durchführen, bis sich keine Schlieren mehr bilden. - Heating drücken - Probenkammer auf 40 C aufheizen (Druck steigt auf >73bar) - Druck ablassen: Ventil (metering valve) ganz schließen (im Uhrzeigersinn drehen) und Gas-out drücken - Vorsichtiges Öffnen des Ventils, Druck kontrolliert ablassen (dauert ca. 10min) - Heating und Gas-out erneut drücken, Ventil schließen. - Anschließend können die getrockneten Proben entnommen und bis zur REM- Analyse im Exsikkator gelagert werden. Vorgehensweise Probenvorbereitung für die AFM-Analyse (Schritte sind zum größten Teil identisch mit den ersten Schritten der REM Probenpräparation) Die Probenherstellung erfolgt für einzellige Bakterien (Bacillus megaterium, Staphylococcus carnosus), die Hefe Saccharomyces cerevisiae und die Exosporen von Streptomyces coelicolor M146 bzw. Streptomyces viridochromogenes Tü494. Bakterien-/Hefe-Flüssigkulturen: - Zellen von 5ml einer Flüssigkultur werden durch Zentrifugation in einem 15ml Falcontube pelletiert (3500rpm = 2451g, 7min) - Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden einmal mit 3ml Phosphatpuffer (100mM, ph 7,5) gewaschen (Zentrifugation s. oben). - Die Zellen werden abzentrifugiert (s.o) und das erhaltene Pellet in einer geringen Menge (100µl) Phosphatpuffer resuspendiert. Die Zellsuspension wird dann in ein 2ml Eppendorfgefäß überführt. Anschließend erfolgt die Zugabe von 2ml Fixierungslösung. - Fixierung durch Inkubation für 20min bei RT auf dem Schüttler - Pelletieren der Zellen durch Zentrifugation (s.o.), Überstand verwerfen. - Resuspendieren der Zellen in 2ml H 2 O deion. - Auftropfen von 15-20µl Zellsuspension auf Glasdeckgläser (mit Ethanol gereinigt und anschließend Plasma-behandelt) bzw. Glasobjektträger; Zellsuspension mit der Pipettenspitze flächig ausstreichen. - die Glasdeckgläser/-objektträger mit den jeweiligen Zellen werden bei Raumtemperatur im Exsikkator bis zur AFM Analyse gelagert. 8

9 Sporensuspensionen von Streptomyceten (Lufttrocknung mit HMDS): - Sporen von 200µl Sporensuspenison werden durch Zentrifugation pelletiert (Biofuge Pico, 13000rpm, 12000g, 3min). - Der Überstand wird verworfen und die Sporen einmal mit 1ml Phosphatpuffer gewaschen (Zentrifugation s. oben) - Die Sporen werden dann in 1ml Fixierungslösung für 20min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. - Zentrifugation (s. oben) und anschließendes Resuspendieren der Sporen in 1ml H 2 O deion ; Inkubation mindestens 7min. - Auftropfen von 15-20µl Zellsuspension auf Glasdeckgläser (mit Ethanol gereinigt und anschließend Plasma-behandelt) bzw. Glasobjektträger; Zellsuspension mit der Pipettenspitze flächig ausstreichen. - die Glasdeckgläser/-objektträger mit den jeweiligen Zellen werden bei Raumtemperatur im Exsikkator bis zur AFM Analyse gelagert. 9