Translationsstrategien

Transkript

1 Translationsstrategien Hans-Georg Kräusslich Abteilung Virologie, Universitätsklinik Heidelberg Mechanismen eukaryontischer Translation Cap-abhängige Initiation IRES-Elemente und cap-unabhängige Initiation Virale Strategien zur Modulation der Translation Translationsinhibition als zellulärer Abwehrmechanismus, virale Verteidigungsmechanismen

2 Aufbau eukaryontischer mrna cap 5 UTR AUG ORF stop 3 UTR AAAAA 5 cap: Bindung von Initiationsfaktoren Kurze 5 UTR ( nt) Monocistronisch: ein ORF 3 UTR, PolyA Prokaryontische mrna: polycistronisch

3 Virale Translationsstrategien Viren nutzen den kompletten Translationsapparat der Wirtszelle ABER Kodierungskapazität muss möglichst effizient genutzt werden Funktionell polycistronische mrna Virale Translation soll bevorzugt werden Host cell shutoff

4 Translation Initiation Cap abhängig geschwindigkeitsbestimmend Elongation Termination Gesteuert von Translationsfaktoren

5 Aufbau des Translations-Initiations Komplexes Initiator-tRNA Ribosom 40S UE Ternärer Komplex 43S Präinitiations-Komplex Initiations-Komplex Cap-Bindung Flint et al. Principles of Virology

6 Translations-Initiation Helikase Komplex gleitet entlang der RNA auf der Suche nach einem Startcodon ( Scanning ) Üblicherweise wird 1. AUG genutzt GTP Hydrolyse löst Dissoziation des Komplexes aus Flint et al. Principles of Virology

7 Translationshemmend wirken... Fehlen der cap-struktur Ausgeprägte RNA-Sekundärstruktur (bes. 5 -Ende) Lange 5 UTR Schlechter Kontext des AUG (Kozak-Regel) Optimal: GCCACCAUGG nur 5% der euk. mrna haben optimalen Kontext (Regulation)

8 Translations-Initiation bei Poliovirus VPg AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG 741 nt +Strang RNA, kein cap, 5 Ende verknüpft mit VPg Lange 5 UTR Ausgeprägte Sekundärstruktur am 5 Ende 7 nicht genutzte AUG in der 5 UTR Translationsinitiation am 5 Ende und scanning bis zum Initiator-AUG ist unwahrscheinlich Effiziente Translation von Poliovirus RNA bei vollständiger Abschaltung der Translation zellulärer mrnas Mechanismus?

9 Hypothese: 5 unabhängiges Binden ribosomaler Untereinheiten an interne RNA-Strukturen 40S-Komplex AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG Internal Ribosomal Entry Site (IRES) Testsystem zum Nachweis (Bicistronische mrna): 5 UTR von Protein B > nur Protein A wird translatiert cap ORF A ORF B AAAAAA 5 UTR von Poliovirus > Proteine A und B werden translatiert

10 Inhibierung der Proteinsynthese in Poliovirus-infizierten Zellen In Poliovirus-infizierten Zellen wird die zelluläre, Cap-abhängige Translation vollständig abgeschaltet Poliovirus RNA wird weiterhin effizient translatiert Mechanismus: Zerstörung von eif-4g Cap-unabhängige Initiation bei Poliovirus Flint et al. Principles of Virology

11 IRES-abhängige Translation IRES-tragende RNA nutzen ebenfalls Translationsinitiationsfaktoren: Typ 1/2 IRES: eif2, eif1/3, eif4a, eif4b (Picorna) Kein eif4e (kein Cap!) eif4g oder Spaltprodukt Typ 3 IRES: (HCV) eif2, eif3 Kein eif4a/4b/4e/4g Darüber hinaus gibt es spezifische IRES-Bindungsfaktoren, die vermutlich modulierend wirken (RNA-Chaperone): La: Regulator von Pol III PTB: Poly-Y-Trakt Bindungsprotein PCBP: Poly-C Bindungsprotein

12 Ein Primärtranskript mehrere Translationsprodukte Genetische Ökonomie AAAA Polyprotein Prozessierung Initiation an verschiedenen Startcodons: Reinitiation leaky scanning Internal ribosomal entry Ribosomal shunting Leseraster- Wechsel splicing Ribosomal Frameshifting RNA editing Überlesen von Stopcodons

13 Genomorganisation von Poliovirus und Prozessierung des Polyproteins zu den viralen Proteinen Synthese aller Proteine als Polyprotein, Prozessierung durch 2 virale Proteasen 2A: Trennung Struktur- und Nicht-Strukturproteine 3C: Alle weiteren Prozessierungen Flint et al. Principles of Virology

14 Genomorganisation und Polyprotein- Prozessierung von Flaviviren Synthese aller Proteine als Polyprotein, Prozessierung durch zelluläre und virale Proteasen: Prozessierung der Strukturproteine: Signal-Peptidase Prozessierung der Nicht-Strukturproteine: NS3 Flint et al. Principles of Virology

15 Re-Initiation z.b. Cauliflower Mosaic Virus: Influenza B Virus: 21 AUG Codons 100% 25% Flint et al. Principles of Virology

16 Ein Reinitiationsfaktor (TAV) von CaMV interagiert mit der Translationsmaschinerie der Zelle Park et al., Cell 2001

17 Überlesen von Startcodons (leaky scanning) Met Scanning Translationsstart am 1.AUG cap UAC AUG AUG Met Leaky scanning cap UAC aug AUG Translationsstart Ungünstiger Sequenzkontext ( Kozak-Regeln ) -> AUG wird überlesen

18 Überspringen von Startcodons (ribosome shunting) Met Scanning Translationsstart am 1.AUG cap UAC AUG AUG Met Transport des Initiationskomplexes vom cap zum AUG nicht linear entlang der RNA cap UAC AUG AUG Translationsstart

19 Ribosomales frameshifting ORF ORF (-1) Pausieren des Ribosoms (bewirkt durch benachbarte Pseudoknotenoder stem-loop-strukturen) an einer slippery sequence oberhalb des stop-codons das Ribosom rutscht bei der Translation in das 1 oder +1 Leseraster Effizienz abhängig vom Sequenzkontext der slippery site Variiert zwischen 2% und 20% Regulationsmöglichkeit Hefevirus L-A: pseudoknot 2% frameshifting CUCAGCAGGGUUUGGAGU Mutieren UUUUUU 12% frameshifting

20 Sekundärstrukturen stromabwärts von frameshift Stellen Struktur des Pseudoknoten am gag-pro Übergang von MMTV

21 Ribosomales frameshifting Rous Sarkom Virus gag pol gag ORF ACA AAU UUA UAG pol ORF. AC AAA UUU AUA G.. slippery sequence Flint et al. Principles of Virology

22 RNA editing Veränderung der mrna Sequenz durch: Einfügen zusätzlicher Nukleotide (während der Transkription) Veränderung einzelner Basen in situ (posttranskriptionell) mrna Sequenz korreliert nicht mit der kodierenden Sequenz im Genom Führt zu: Leserasterwechsel C-terminale Extension (stop > Aminosäure) Änderung der Aminosäuresequenz

23 Modell des co-transkriptionellen RNA editing: Paramyxoviren Masern -virus Mumps -virus RNA-Pol pausiert an einem Übergang C n -U n im template Der Pol-mRNA-Komplex verrutscht um 1-2 Basen entlang des templates ( Stottern ; vgl. PolyA-Synthese) Dadurch werden zusätzliche Basen in das Transkript eingefügt Die Stabilität der entstehenden RNA- Duplexe bestimmt, um wieviele Basen Die RNA-Pol verrutscht: Masernvirus: -1 Base Mumsvirus: -2 Basen Flint et al. Molecular Virology

24 Posttranskriptionelles RNA editing: Hepatitis delta satellite virus Kleines delta Antigen: Genomreplikation Grosses delta Antigen: Inhibiert Genomreplikation Assoziation der RNA mit HDV env +19 AS Transkription Replikations- Intermediat dsrna Adenosin Deaminase I: Basenpaarung mit C (U > C) Editing (50%) Flint et al. Molecular Virology

25 Unterdrückung der Termination Sindbis Virus Mo-MLV capping Helikase Potease RNA Pol RNA pseudoknot stop (ca. 10%) Opal stop P123 + P4: -Strang Synthetase P1+ P2 + P3 + P4: +Strang Synthetase Relative Menge von Protease (P2) zu Polymerase (P4) reguliert die RNA Synthese Amber -> Gln Suppression in 4-10% der Transkripte Reguliert die relativen Mengen Gag (Strukturproteine): Pol (Enzyme) Flint et al. Principles of Virology

26 Virale Translationsstrategien (mehrere Proteine von einer mrna) Polyproteinsynthese Picornaviruses Flaviviruses Alphaviruses Retroviruses Leaky scanning Sendai virus P/C mrna Influenza B RNA 6 AUG AUG Reinitiation Influenza B RNA 7 CMV gp48 mrna Suppression dertermination Alphavirus nsp4 Retrovirus Gag-Pol stop stop Ribosomales frameshifting Coronavirus orf1a-1b Retrovirus Gag-Pol Internal ribosomal entry Picornavirus Flavivirus IRES

27 Maximale Nutzung einer RNA Sequenz zur Translation verschiedener Proteine: Sendai-Virus P/C/V Gen Leaky scanning: Proteine C, P, C Zunehmende Effizienz der Startcodons von 5 nach 3 (ACG; AUG, Kontext; AUG Kontext Ribosome shunting: Proteine Y1, Y2 Expression dieser Proteine variiert in verschiedenen Zellinien Regulation des ribosome shunting durch zelluläre Faktoren??? RNA editing: Protein V, W Einfügen eines nicht im template enthaltenen Guanosins Leserasterwechsel V-Protein

28 Maximale Nutzung einer RNA Sequenz zur Translation verschiedener Proteine: Sendai-Virus P/C/V Gen Flint et al. Principles of Virology

29 Regulation der Translation Host-cell shutoff Interferon-induzierte zelluläre Abwehrstrategie virale Verteidigungsmechanismen

30 Inhibierung der Proteinsynthese in Poliovirus-infizierten Zellen Mechanismus: Zerstörung der eif-4g Untereinheit cap-unabhängige Initiation bei Poliovirus Flint et al. Principles of Virology

31 Inaktivierung des zellulären eif4f-komplexes durch virale Faktoren Flint et al. Principles of Virology

32 Modelle für Initiationskomplexe an cap oder IRES Elementen Keine eif4e-bindung Flint et al. Principles of Virology

33 Hemmung der Wirts-Proteinsynthese durch Stören der eif4g-pabp Interaktion Aneinanderlagerung beider Enden der mrna Interaktion von eif4g und PABP stimuliert die Translation Rotavirus: Virales NSP3 bindet an eif4g und blockiert Interaktion eif4g:pabp Inhibition der Translation zellulärer mrna Rotavirus mrna: cap, aber kein polya NSP3 bindet an das 3 Ende der viralen mrna und ersetzt PABP in der Stimulierung der Translation viraler mrna

34 Inhibierung der Translationsinitiation als zellulärer Abwehrmechanismus Protein kinase, RNA activated (Pkr) Interferon induziert die Sythese von Pkr (und RNaseL) Virale dsrna aktiviert Pkr Phosphorylierung von Pkr-Substraten u.a. eif2α > Block der Initiation Flint et al. Principles of Virology

35 Wirkung der eif2a Phosphorylierung auf das katalytische Recycling in der Initiation eif2*gtp bringt trna i zum Initiationskomplex Recycling von eif2*gtp Aktivierte Pkr peif2α bindet irreversibel an eif2b Menge an freiem eif2b nimmt ab Kein eif2*gtp recycling Translationsinititation wird inhibiert Flint et al. Principles of Virology

36 Virale Strategien zur Inhibierung der eif2α- Phosphorylierung Bindung an dsrna HSV-1 Us11 Vaccinia E3L Reovirus σ3 Aktivierung des zellulären PKR-Inhibitors I-P58 IPK Influenza Verhindern der eif2α Phosphorylierung HCMV + PKR dsrna P P P P PKR PKR eif2α eif2α P PKR-bindende RNA Adeno VA RNAI EBV EBER RNA HIV TAR? PKR-bindende Proteine HHV8: virf-2 Vaccinia K3L EBV SM HCV NS5a eif2α-dephosphorylierung HSV-1 γ34.5