Virale Expressionsstrategien

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1 Virale Expressionsstrategien Ziel: Abruf der im Genom gespeicherten Information zur richtigen Zeit und in der richtigen Menge

2 Genomgrössen von verschiedenen sequenzierten Organismen Amoeba dubia 670 billion (= 10 9 ) bp Plasmodium falciparum billion bp

3 Genomgroessen von verschiedenen Viren: DNA Viren DNA Virus: Mimivirus Wirt: Amoeba DS DNA Genom 1.2 x 10 6 BP 911 Gene > 400 nm ø. DNA Virus: Circovirus Wirte: Schwein, Vögel ES (-) DNA Genom x 10 3 Basen nm ø;.

4 Genomgroessen von verschiedenen Viren: RNA Viren Coronavirus Wirt: Säugetiere SS (+) RNA Genom x 10 3 Basen nm ø; Behüllt. Picornavirus Wirt:Wirbeltiere, Insekten ES (+)RNA Genom x 10 3 Basen 28-30nm ø; Unbehüllt.

5 Baltimore Klassifikation zur Einteilung der Viren.

6 DNA Viren der Wirbeltiere: Baltimore Klassen I-II Properties Family name Virion polymerase Virion ø(nm) Genome size (kbp) Classification Criteria Nucleic Acid Capsid Symmetry Naked or enveloped Genome architecture Baltimore class From Fig Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

7 RNA Viren der Wirbeltiere: Baltimore Klassen III-V From Fig Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

8 Retroviren: Baltimore Klasse VI Beispiel HIV Classification criteria Properties Nucleic Acid RNA Symmetry of capsid? conical morphology Naked or enveloped enveloped Genome architecture (+) SS Baltimore class VI Family name Retro Virion polym erase Yes Virion diameter (nm) 145 ± 25 Genome size (kbp) ~10

9 Anforderungen an Informationsspeicherung und -Abruf bei Viren Maximale Ausnutzung der Speicherkapazität des Genoms; Zeitliche Koordination der Synthese viraler Bestandteile; Behauptung in der Konkurrenz um zelluläre Ressourcen; Erhaltung der Virusfamilie: Vermehrung; Erhaltung auch unter ungünstigen Bedingungen;

10 Maximale Ausnutzung der Speicherkapazität des Genoms Beispiel HIV: 1 Gen ergibt 15 Proteine vif

11 Maximale Ausnutzung der Speicherkapazität des Genoms Beispiel HIV: Überlappende Leseraster LTR Gag Pol Vif Vpr Vpu Rev Tat envenv Nef LTR

12 Der Preis: Veränderung eines Nukleotids kann sich auf mehrere Proteine auswirken Env Rev Tat... C T C C C A A T C L G T T T C A G A C C C A C C T C C C A A T C C C G A G G G G A C C C G A C A G G C C C G A A G G A A Env (gp 41) F Q T H L P I P R G P D R P E G Rev Exon 2 D P P P N P E G T R Q A R R N Tat Exon 2 P T S Q S R G D P T G P K E Substitution: C -> T S P P Q N G T T T C A G A C C C A C C T C C T A A T C C C G A G G G G A C C C G A C A G G C C C G A A G G A A Env (gp 41) F Q T H L L I P R G P D R P E G Rev Exon 2 D P P P N P E G T R Q A R R N Tat Exon 2 P T S I Auswirkungen: Env (gp 41) CCA -> CAA P -> Q Rev Exon 2 CCC -> CCA kein Effekt Tat Exon 2 CAA -> AAA Q -> K

13 Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information RNA-Prozessierung Alternatives Splicing von einem Primär-Transkript Beispiele: Adenoviridae Orthomyxoviridae Papillomaviridae Polyomaviridae Retroviridae From Fig Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

14 Voraussetzung: mrnas müssen in den Zellkern Balt. Genom 1 Familien RNA Klasse (Beispiele) Syntheseort 2 I dsdna Herpesviridae K Adenoviridae K Papovav iridae K Poxviridae Z II esdna Parvovoridae K III dsrna Reoviridae Z (segmentiert) IV (+) esrna Picornaviridae Z Coronaviridae Z Flaviviridae Z Togaviridae Z V (-)ssrna Orthomyxov iridae K (segmentiert) unsegm. Paramyxovi ridae Z Rhabdov iridae Z VI RNA ->DNA Retroviridae K VII DNA 3 ->RNA Hepadnaviridae K 1 Ds: doppelsträngig; es: einzelsträngig. 2 Z = Zytoplasma; K = Kern 3 DNA-Viren mit RNA als Zwischenstufe

15 Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information RNA-Synthese Überlappende Transkriptionseinheiten: Bildung von verschiedenen Primär-Transkripten Beispiele: Adenoviridae Hepadnaviridae From Fig Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

16 Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information RNA-Prozessierung Editieren der RNA Sequenz: Gezielte Veränderung des Ribonukleotids während oder nach Synthese Beispiele: Paramyxoviridae: Filoviridae: Hepatitis delta Satelliten virus: Ko-transkriptionell Ko-transkriptionell Post-transkriptionell

17 Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information Proteinsynthese Leaky Scanning: Start der Translation an verschiedenen Start-Kodons möglich Beispiele: Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Polyomaviridae Retroviridae

18 Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information Proteinsynthese Wiederbeginn der Translation an einem stromabwärts gelegenen Start-Kodon: Voraussetzung: Strom-Aufwärts gelegenes Start Codon. Beispiele: Orthomyxoviridae Herpesviridae

19 Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information Proteinsynthese IRES (internal ribosmal entry site): Bindung von Ribosomen an interne Sequenzen des Transkripts Beispiele: Flaviviridae Picornaviridae

20 Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information Proteinsynthese Überlesen von Translations-Stop-Signale Beispiele: Alphaviruses Retroviridae

21 Translationsstrategien von Viren Proteinsynthese von poly-cistronischen mrnas UTR: Untranslated region ORF: Open reading frame Fig Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

22 Regulation der Initiation der Translation Translationsinitation von zellulären mrnas: Vorrangiger Mechanismus Interaktion der 40S Untereinheit der Ribosomen mit verschiedenen Initiationsfaktoren und mit Met-tRNA i ; Interaktion des Prä-Initiationskomplexes mit der mrna; Scanning der mrna bis zum Start-Codon (oft das erste ATG) Freisetzung der Initiationsfaktoren und Zusammenbau des vollständigen Ribosoms Proteinsynthese

23 Regulation der Initiation der Translation Das RNA Cap : Essentiell für die Translation von vielen mrnas in eukaryotischen Zellen 5 Ende der mrna

24 Regulation der Initiation der Translation: Fig. 11.3A. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

25 Regulation der Initiation der Translation Leaky Scanning : Überlesen des ersten Start-Kodons beim Scanning Beispiele: Viral Source Identifier Sequenc e Proteins flanking first AUG codon SV40 Late 19S mrna UCCaugG VP2 u. VP3 Cellular Hepatitis B Virus capsid proteins 2.1 kb mrna GCCaugC Middle and small surface proteins HIV-1 Spliced mrna CCUaugG Rev and Nef regulatory proteins Glucocorticoid receptor gene Optimal sequence human CUGaugG Long and short trans-activators GCCR*CCaugG Kozak M., Gene 299, 1-34 *R = Purine (A oder G)

26 Regulation der Initiation der Translation Wiederbeginn der Translation durch erneute Gewinnung von mettrnai durch die an RNA gebundenen 40 S Untereinheit. Voraussetzungen: Stromaufwärts-gelegener offene Leseraster; CMV gp48 Influenza B Virus RNA Segment 7 Stop Start Fig Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

27 Alternative Strategien zur Translationsinitiation IRES: Internal Ribosomal Entry Site Initiation der Translation ist abhängig von einer RNA- Sekundärstruktur, nicht von der CAP-Struktur.

28 Alternative Strategien zur Translationsinitiation: IRES Type I: Poliovirus Type II: Encephalomyocarditis virus From Fig Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

29 Alternative Strategien zur Translationsinitiation: IRES Cap-abhängige Initiation IRES-gesteuerte Initiation Bei Poliovirus: Spaltung von eif4g durch virale protease 2A pro : => Hemmung der zellulären mrna Synthese; Stimulation der Translation an der IRES Fig. 11.3C. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

30 Schematic representation of the cap-dependent ribosome scanning (left panel) and internal initiation (right panel) pathways for the formation of 80 S initiation complexes Komar, A. A. et al. J. Biol. Chem. 2005;280: ITAF: IRES trans-acting factors

31 Alternative Strategien zur Translationsinitiation: IRES Hepatitis C Virus: Typ III IRES Direkte Bindung von 40S Untereinheit mit IRES Konformationsänderung der 40S Untereinheit => Positionierung des ATG; Bindung von Met-tRNAieiF2-GTP Komplex Translationsstart Fig and 11.3A,C. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

32 Verwendung von IRES fuer die Molekularbiologie: Koexpression von Selektions-Bzw. Markergenen. Box Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

33 Leserasterverschub Problem: Gag und Protease bzw. Gag und Protease und Pol werden von unterschiedlichen Lesrastern kodiert. Lösung: kontrolliertes Rutschen der Ribosomen in ein anderes Leseraster.

34 Programmierter -1 Leserasterverschub Gag-Protein Leserasterverschub: Gag-Protease-Pol Gag; 1. Leserasterverschub: Gag-Protease 2. Leserasterverschub: Gag-Protease-Pol

35 FIGURE 1. Overview of programmed -1 ribosomal frameshifting Linker Region Rutsch-Stelle: X XXY YYZ G GGA AAC XXX: 3 identische Nukleotide YYY: 3 identische Nukleotide Z: A,C oder U; nicht G Ribosom pausiert während der Elongation Pseudoknoten Verlagerung des Ribosoms um eine Position in 5 Richung EWAN P. PLANT et al. RNA 2003; 9: Verschiebung des Leserasters; Auflösen des Pseudoknotens

36 Leserasterverschub bei dem SARS-Coronavirus. S: Spike; E: Envelope; N: Nucleocapsid; M: membrane protein; ORF, X: weitere Leseraster. Ramos, FD et al., 2004, BiochemSoc Transact.32,

37 RNA Pseudoknoten Strukturen in verschiedenen Coronaviren. Ramos, FD et al., 2004, BiochemSoc Transact.32,

38 Modell für den Beitrag von Pseudoknoten zum Leserasterverschub. EWAN P. PLANT et al. RNA 2003; 9:

39 Überlesen vom Terminations-Kodon: Murines Leukämie Virus Gag Pro Pol Pseudoknoten Staple DW and Butcher SE 2005.PLoS 3, Fig Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

40 Die Wunderwaffe der Viren Regulationsfaktoren Aufgaben: Aktivierung/Hemmung der Expression von viralen Proteinen; Priming der Zelle für die Virusreplikation; Zeitliche Koordination der Virusreplikation Gemeinsame Eigenschaften Multifunktionell; Interagieren mit vielen verschiedenen Proteinen

41 Virale Transkriptionsaktivatoren Beispiele von viralen Transkriptions-Regulatoren, die keine Sequenz-spezifische DNA Bindung zeigen. Faktor Virus Interaktion mit Effekt zellulären DNAbindenden Proteinen E1A Adenovirus TFIID Aktivierung/Repression (289; 243 AS) Tax HTLV CREB VP16 Herpes OCT-1 Aktivierung simplex virus EBNA2 EBV RBP-J Aktivierung

42 Virale Transkriptionsaktivatoren Beispiele von viralen Transkriptions-Regulatoren, die an spezifische Nukleinsäure Signale binden. Faktor Virus Wirkung Effekt durch direkte Bindung an Signale in Nukleinsäuren ICP4 Herpesvirus DNA Aktivierung/Repression T-Antigen Polyom avirus DNA Aktivierung (spät Gene); Repression (frühe Gene) Tat HIV RNA Aktivierung

43 Einige Grundlagen zur Transkription: Der Promoter Aus Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

44 Einige Grundlagen zur Transkription: Beipiele für virale Promotoren Fig. 8.4 Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

45 Beispiel eines wichtigen zellulären Transkriptionsfaktors: NFkappaB Fig. 8.6A aus Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition

46 Beispiel eines wichtigen zellulären Transkriptionsfaktors Beispiele für virale Promotoren die durch NFkappaB aktiviert werden: HTLV-I HIV-1 SV40

47 Beispiel eines viralen Transkriptionsregulators: Polyoma T-Antigen Aus Fields Virology, D.M.Knipe, P.M. Howley, Lippincott Williams & Wilkins.2001, p

48 Die Kontrollregion im SV40 Genom Aus Fields Virology, D.M.Knipe, P.M. Howley, Lippincott Williams & Wilkins.2001, p

49 Beispiel eines viralen Transkriptionsregulators: HSV VP16 VP molecules α-genes Immediate early Latency β-genes early + - γ-genes late Virus particle:

50 VP16 funktioniert als Komplex mit zellularen Faktoren Acidic activation domain HCF-1: human factor C1 Oct-1: Octamer 1 transcription factor Wysocka J and Herr W TIBS 28, POU domains

51 VP16 Domänen AD: Transkriptions-Aktivierungsdomäne Core-Domäne: Essentiell für die Bildung von VIC (VP16-induced complex); Interagiert mit Oct-1 und HCF-1; Nur schwache DNA Bindung alleine; Sequenz konserviert zwischen verschiedenen α-herpesviren; Wysocka J and Herr W TIBS 28,

52 VIC: Warum so kompliziert? Mögliche Erklärung: Oct-1 und HCF-1 sind wichtig für die Zellproliferation; Durch die Interaktion mit diesen beiden Faktoren tastet VP16 die Bereitschaft der Zelle für die Virusreplikation ab (lytische Phase).