Ultrastruktur von Viren

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1 PD Dr. Jürgen Stech Ultrastruktur von Viren QUELLEN: Fields Virology 5 th Edition Flint Principles of Virology Bozzola & Russell Electron Microscopy Rolle & Mayr PDF der Vorlesung zum Download

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3 Ziele dieser Vorlesung Ultrastruktur-Typen Aufbau und Unterschiede Von der Struktur zur Funktion

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6 SEM TEM

7 Art der Diagnostik Direkter Erregernachweis Virus-Isolierung Methode Nachweis von Vorteile/ Nachteile Anzüchtung auf Zellkulturen Infektiösität, Zytopathogenität empfindlich, aber langsam Elektronenmikroskopie (EM) Negativ- Kontrastierung, Transmissions-EM Viruspartikel schnell, aber wenig empfindlich Antigen-Nachweis im Pat.-Material Immunfluoreszenz, Ag-ELISA Virusproteine schnell, aber nur z.t. verfügbar Nukleinsäure- Nachweis im Pat.-Material Indirekter Nachweis Serologie Gensonde, Polymerase- Kettenreaktion Immunfluoreszenz ELISA Hämagglutinations -Hemmtest Western Blot viraler Nukleinsäure (DNA oder RNA) spezifischen antiviralen Antikörpern im Serum des Patienten schnell, aber kein dir. Nachweis der Infektiösität retrospektive Diagnose

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10 Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels

11 Definitionen Strukturbegriffe I Virion infektiöses Viruspartikel Kapsid (Umhüllung, Coat) Proteinschicht, umgibt die genomische Nukleinsäure Nukleokapsid (Kern, Core) Kapsid als diskrete Substruktur im Viruspartikel

12 Definitionen Strukturbegriffe II Kapsomer morphologische Oberflächenstruktur aus Elektronenmikroskopie(!), mit Protomer nicht zwingend identisch! Protomer (asymmetrische (Struktur-)Einheit) bildet Kapside oder Nukleokapside, kann aus einer oder mehreren gleichen oder verschiedenen Protein- Untereinheiten bestehen Proteinuntereinheit einzelne gefaltete Polypeptid-Kette

13 Genome Protection Genome Delivery Other interactions with the host

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15 Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels Rotavirus Tabakmosaikvirus (TMV) Herpesvirus Vesikuläres Stomatitisvirus (VSV)

16 Nukleokapside: Ausnahmen Komplexes Nukleokapsid bei Pockenviren Konisches Nukleokapsid bei Lentiviren, z. B. HIV

17 Komplexes Nukleokapsid der Poxviridae

18 Konisches Nukleokapsid der Lentiviren

19 Bei den Retroviren wurde die alte Einteilung nach Morphologie des Kapsids durch funktionelle Kriterien ersetzt.

20 Neuere Ausnahme: Riesenviren

21 Neuere Ausnahme Riesenviren Parachlamydia Verrucomicrobia Archaea Mimivirus microbe mimicking virus

22 Symmetrie-Regeln für konventionelle Nukleokapside ermöglichen die Selbst-Assemblierung. Jede Untereinheit hat identische Bindungsstellen zu ihren Nachbarn. Diese regelmäßigen Interaktionen chemisch komplementärer Oberflächen ermöglichen ein symmetrisches Arrangement. Bei ikosaedrischen Nukleokapsiden mit mehr als 60 Untereinheiten gilt das Prinzip der Quasi-Äquivalenz (s. dort). Diese Bindungskontakte sind nicht kovalent. Die reversible Bildung nicht-kovalenter Bindungen korrekt gefalteter Untereinheiten führt zu einem fehlerfreien Aufbau und minimiert die freie Energie.

23 Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels Rotavirus Tabakmosaikvirus (TMV) Herpesvirus Vesikuläres Stomatitisvirus (VSV)

24 Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels Ikosahedrales Rotavirus Nukleokapsid Herpesvirus

25 Problem: Runde Kapside aus unregelmäßig geformten Proteinuntereinheiten? Zwei Hinweise führten zum Alle runden Kapside haben genaue Zahlen an Untereinheiten: Vielfache von 60 (60, 180, 240, ). Diverse Kapsidgrößen sind bekannt, aber die Größen der Kapsid-Proteine variieren von ca. 20 bis 60 kda. Strukturkonzept von Caspar & Klug (1962). Watson & Crick: Runde Kapside sind Ikosaeder, aber keine anderen platonischen Körper. Kapsid-Untereinheiten sind präferentiell als Hexamere und Pentamere arrangiert. Anzahlen dieser Untereinheiten sind Vielfache von 60.

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27 Ikosahedrales Nukleokapsid Ikosaeder = Zwanzigflächner größtes Volumen unter den Tetraedern geschlossene Struktur 3 Rotationsachsen mit unterschiedlichen Freiheitsgraden fünffach dreifach zweifach

28 Maul- und Klauenseuche- Virus Poliovirus Hepatitis-A-Virus Pico RNA viren

29 Nur bei den einfachsten Ikosaedern mit T=1 entspricht 1 Kapsomer einer asymmetrischen Einheit!

30 Triangulationszahl: Wieviele Dreiecke je Seitenfläche? Ikosaeder: 20 Seitenflächen Im einfachsten Ikosaeder findet sich 1 Seitenfläche = 1 Dreieck T=1 mit jeweils 3 Kapsomeren. 3 x 20 Seitenflächen = 60 Kapsomere Alle größeren ikosahedralen Kapside haben T x 60 Kapsomere.

31 Alle Ecken sind von Pentameren umschlossen. Jede (dreieckige) Seitenfläche grenzt an drei Pentamere. h und k sind Anzahlen an Hexameren als Abstände von einem zu den beiden anderen Pentameren.

32 Geometrische Herleitung von T

33 T= 2 h + hk + 2 k

34 T = h 2 + hk + k 2 h = 1, k = 1 T = x T = 3

35 Zwei Beispiele zur Berechnung

36 Zwei Beispiele zur Berechnung T = h 2 + hk + k 2 h = 2, k = 1 T = x T = 7

37 Zwei Beispiele zur Berechnung T = h 2 + hk + k 2 h = 4, k = 0 T = x T = 16

38 Prinzip der Quasi-Äquivalenz Bei mehr als 60 Untereinheiten besetzt jede eine räumlich quasi-äquivalente Position. Die nicht-kovalenten Bindungen dieser Untereinheiten sind einander ähnlich und nicht identisch.

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40 Adenoviridae h = 5, k = 0, T = 25 Zwar ist das Virion ohne Hülle, jedoch ist das Ikosaeder sehr komplex!

41 Zwei Ikosaeder-Schichten

42 Ikosaeder und Lipidhülle

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44 Ikosahedrales Nukleokapsid bei DNA-Viren unbehüllt Parvoviridae Parvovirus B19 Papillomaviridae humane Papillomviren Adenoviridae humane Adenoviren A-F behüllt Hepadnaviridae Hepatitis-B-Virus Herpesviridae Herpes-simplex-Virus I

45 Ikosahedrales Nukleokapsid bei RNA-Viren unbehüllt Reoviridae Blauzungenvirus Birnaviridae Virus der infektiösen Bursitis Caliciviridae Norwalkvirus Picornaviridae Poliomyelitisvirus behüllt Flaviviridae Gelbfiebervirus Togaviridae Rötelnvirus

46 Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels Rotavirus Tabakmosaikvirus (TMV) Herpesvirus Vesikuläres Stomatitisvirus (VSV)

47 Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels Helikales Nukleokapsid Tabakmosaikvirus (TMV) Vesikuläres Stomatitisvirus (VSV)

48 Helikales Nukleokapsid Symmetrie: P = µ x p µ Untereinheiten pro Windung p Zuwachs pro Untereinheit P Abstand pro Windung

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50 Helikales Nukleokapsid DNA-Viren Baculoviridae Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) RNA-Viren Tobamovirus Tabakmosaikvirus Coronaviridae SARS-Coronavirus Filoviridae Ebola-Zaire-Virus Rhabdoviridae VSV, Lyssavirus Bunyaviridae Hantaanvirus Orthomyxoviridae Influenzavirus A Paramyxoviridae Respiratorisches Synzytialvirus Arenaviridae Lymphocytic Choriomeningitis Virus

51 Baltimore-Klassifikation: Genom mrna David Baltimore: Expression of Animal Virus Genomes. Bacteriological Reviews 1971.

52 Klassifikation DNA-Viren Ikosaedrische und helikale Nukleokapside innerhalb der Baltimore-Klasse I!

53 Klassifikation RNA-Viren Ikosaedrische und helikale Nukleokapside innerhalb der Baltimore-Klasse IV!

54 Jenseits der Nukleokapside

55 Coronavirus Taxonomie: Ordnung: Nidovirales Familie: Coronaviridae, Genus: Coronaviren Eigenschaften: - Spike-Proteine bilden Corona im EM-Bild - einzelsträngiges RNA-Genom positiver Polarität von kb Länge - umhüllte Virionen von nm Größe - Nukleokapsid-Protein umhüllt RNA-Genom

56 Genus Coronavirus Namensgebung: lat. corona Krone, nach Morphologie im EM Systematik: Ordnung Nidovirales, (nested set of mrnas), Familie Coronoviridae, 3 Serotypen Genomaufbau: 1 einsträngige plussträngige polyadenylierte RNA mit Cap am 5 -Ende, 27 bis 32 kb (grösstes RNA-Virusgenom). Virionstruktur: umhülltes Nukleokapsid, in Hülle eingelagert: S (spike) Glykoprotein, bei allen CV, bei manchen Hämagglutinin-Esterase, M, transmembrane protein, envelope protein Replikationsstrategie und Expression: zwei PolyproteineORF 1a 1b, ribosomaler Frameshift und für kleinere Proteine diskontinuierliche Transkription in mehrere mrnas Epidemiologie und Krankheitsbilder: humanes CV: banale respiratorische Infekte von Nase, Trachea, Alveolen, Reinfektionen häufig, auch Darminfektionen; SARS schwere Pneumonie Virusreservoir: Mensch, Schwein und div. Säugetiere, Hühnervögel

57 Familie Arenaviridae - Namensgebung Murphy & Whitfield Bull WHO 1975

58 Familie Arenaviridae Namensgebung lat. arena Sand, sandartiges Bild in EM wg. eingelagerten Ribosomen im Virion Systematik 2 Genera: Mamm- und Reptarenavirus Genomaufbau 2 ambisense -Segmente Virionstruktur helikales Nukleokapsid (RNA, L-, N-Protein), umhüllt, GP1/GP2, Z- Protein, zelluläre Ribosomen Replikationsstrategie und Expression Transkription von vrna in mrna des L- und N-Proteins, Replikation von vrna zu crna zu vrna, von crna Transkription in mrna der Z- und GPC-Proteine (Replikation im Zytoplasma) Epidemiologie und Krankheitsbilder weltweit, hämorrhagisches Fieber, Lassa-Fieber, lymphozytäre Choriomeningitis Virusreservoir Nager oder auch früchtefressende Fledermäuse

59 Abgrenzung aller Viren zu anderen intrazellulären Pathogenen wie Rickettsien, Chlamydien oder Mykoplasmen besteht weder in Größe (Ultrafiltrierbarkeit) noch im obligaten Zellparasitismus sondern in der Abwesenheit von Ribosomen.

60 Typische Morphologie Rotavirus Picornavirus Tabakmosaikvirus (TMV) Coronavirus Adenovirus Vesikuläres Stomatitisvirus (VSV) Arenavirus Herpesvirus Influenzavirus A Masernvirus

61 Nukleokapside: Ausnahmen Komplexes Nukleokapsid bei Pockenviren Konisches Nukleokapsid bei Lentiviren, z. B. HIV

62 Rhabdoviridae (VSV)

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64 Cryo-EM Model of the Bullet-Shaped Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Ge et al., Science 2010 Virion enthält zwei Helices: Nukleo(N)-Protein + RNA sowie Matrix(M)-Protein Andere umhüllte Viren sind pleomorph: rigide Geschoßform der Rhaboviren durch N-N und M-N Interaktionen zu erklären

65 Cryo-EM Model of the Bullet-Shaped Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Ge et al., Science 2010 Kristallstruktur des M-Proteins in Elektronendichtekarte eingepasst Interaktion zwischen N und M gezeigt

66 Kristallstruktur (Decamer-Ring) von N-Protein und RNA in Elektronendichtekarte eingepasst -> Orientierung der vrna im Virion: 5 -Ende beginnt mit Spitze Hypothese: Assembly beginnt mit Bildung der Spitze, durch elektrostatische Wechselwirkung mit RNA werden die Windungen vergrößert

67 Cryo-EM Model of the Bullet-Shaped Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Ge et al., Science 2010 C-Terminus des G-Proteins interagiert mit M

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70 Familie Paramyxoviridae Namensgebung: lat. para neben, myxa Schleim Systematik: 2 Unterfamilien: Paramyxovirinae (Genera: Respirovirus, Rubulavirus, Avulavirus, Morbillivirus und Henipavirus) und Pneumovirinae (Genera: Pneumovirus und Metapneumovirus) Genomaufbau: 1 nichtsegmentierte negativsträngige RNA ca kb, (mindestens) 5 Gene: N-P-M-F-H/HN-L, unterbrochen durch intergenische Regionen; 5 -Ende: Trailer, 3 -Ende Leader f. Initiation der Genom-Replikation Virionstruktur: 1 helikales Nukleokapsid (RNA, N, P, Polymerase L (=RNP)) umhüllt von Matrixprotein M und Lipidhülle, darin eingelagert F-Protein sowie genus-spezifisches Glykoprotein Replikationsstrategie und Expression: nach Freisetzung ins Zytoplasma Synthese von polyadenylierten monocistronischen mrnas in polarer Häufung vom 3-5 -Ende des Nukleokapsides, Transkriptionsstartstellen, Genomreplikation: crna durch Antitermination als Template für vrna Epidemiologie und Krankheitsbilder: Bronchiolitis, Bronchopneumonie, Masern, Mumps Virusreservoir: Mensch, je nach Genus auch diverse Säuger und Vögel

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72 Die Virus-Knospung ist polarisiert. Influenza- und Masernviren werden am apikalen Pol, VSV hingegen am basolateralen Pol freigesetzt.

73 Familie Orthomyxoviridae (Influenza A und B) Namensgebung: griech. orthos richtig, myxa Schleim Systematik: 6 Genera: Influenzavirus A, B, C, Thogotovirus, Isavirus, Quaranjavirus Genomaufbau: 8 negativsträngige Segmente Virionstruktur: 8 helikale Nukleokapside (RNA, NP, Polymerase (=RNP)) umhüllt von M1+Hülle, darin eingelagert Oberflächenproteine HA, NA, M2 Replikationsstrategie und Expression: primerunabhängige Replikation der vrna zu crna zu vrna im Zellkern, Transkription von vrna im Zellkern nach Cap-Snatching zu mrna, Spleißen einzelner mrna, alternative ORF Epidemiologie und Krankheitsbilder: Pandemien (Influenza A), jährliche Epidemien, Bronchiolitis, Bronchopneumonie Virusreservoir: Influenza A: vor allem Entenvögel, Hühnervögel, Schwein, Mensch

74 Influenza-A-Viren

75 Ribonukleoprotein(RNP)-Komplexe von Influenza-A-Viren Nukleoproteine (NP) heterotrimerer Polymerase- Komplex

76 Structural Organization of a Filamentous Influenza A Virus Calder et al., PNAS 2010 Virionen kapselförmig oder filamentös RNP Coil (M1) HA NA Virion polar organisiert: Ribonukleoproteine (RNP) beginnen am Knospungs-Ende, Neuraminidase (NA) vorwiegend am entgegengesetzten Pol

77 Matrix(M1)-Proteine bilden Helix.

78 Niedriger ph führt zum Verlust der Filament-Struktur.

79 Verpackung der vrnp-segmente: zufällig oder spezifisch? Gerber // Marquet, Trends Microbiol 2014

80 Begrenzt die spezifische Verpackung der vrnp-segmente das Reassortment? Gerber // Marquet, Trends Microbiol 2014

81 Von Struktur zur Funktion Eine effiziente Kodierung des Nukleokapsides im Virusgenom wird durch den Aufbau aus identischen Untereinheiten ermöglicht. Ikosahedrale Nukleokapside führen zu einer sehr effizienten Nutzung des Volumens und damit dichten Verpackung des Genoms, erlauben aber deutlich weniger Veränderungen. Helikale Nukleokapside hingegen tolerieren Anpassungen in der Genom-Länge. Oft ist das Nukleoprotein in die Replikation und Transkription involviert.

82 Vielen Dank!