Aus dem Institut für Umweltmedizin und Krankenhaushygiene der Albert-Ludwigs-Universtät Freiburg i. Br.

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1 Aus dem Institut für Umweltmedizin und Krankenhaushygiene der Albert-Ludwigs-Universtät Freiburg i. Br. In vitro Wirksamkeit von Antibiotika gegenüber resistenten Pseudomonas aeruginosa- und Acinetobacter spp.-isolaten sowie Charakterisierung Metallo-beta-Laktamase-positiver Stämme INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Vorgelegt: 2010 von Irina Götz geboren in Karaganda

2 Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Hubert Erich Blum 1. Gutachter: Prof. Dr. med. Daniel Jonas 2. Gutachter: Prof. Dr. med. Manfred Kist Jahr der Promotion: 2010

3 Inhaltsverzeichnis TABELLENVERZEICHNIS... 4 ABBILDUNGSVERZEICHNIS... 5 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS EINLEITUNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA ACINETOBACTER SPP ANTIBIOTIKA THERAPIE Beta-Laktam- Antibiotika Aminoglykoside Fluorchinolone RESISTENZMECHANISMEN Metallo-β-Laktamasen Integrons und Genkassetten Ziel der Arbeit MATERIAL UND METHODEN BAKTERIENSTÄMME Nachidentifizierung MATERIALIEN FÜR DIE MIKROBIOLOGISCHEN ARBEITEN MIKROBIOLOGISCHE METHODEN Agardilution Bouillon-Mikrodilution Auswertung und statistische Methoden Agardiffusion und der MBL-CD Test MATERIALIEN FÜR DIE MOLEKULARBIOLOGISCHEN ARBEITEN MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN Nachweis der MBL-Gene mittels PCR Sequenzierung der MBL-Gene Integron PCR Genotypisierung mittels AFLP Genotypisierung mittels MLST ERGEBNISSE MIKROBIOLOGISCHE ARBEITEN Agardilution Minimale Hemmkonzentrationen in vitro Resistenzverteilung aufgeschlüsselt nach Antibiotikaklassen und Ursprungsländern Kreuzresistenzen bei P. aeruginosa Kreuzresistenzen bei Acinetobacter spp Wirksamkeit der Carbapeneme Wirksamkeit der Cephalosporine Agardiffusion Phänotypisches Screening auf MBL-kodierende Isolate Isolate mit heterogenem Resistenz-Phänotyp ERGEBNISSE DER MOLEKULARBIOLOGISCHEN ARBEITEN AFLP-Genotypbestimmung Genotypische Bestimmung MBL-kodierender Isolate mittels MBL-PCR MLST bei P. aeruginosa DISKUSSION ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS ANHANG LEBENSLAUF DANKSAGUNG

4 Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis TABELLE 1 KLASSIFIKATION DER BETA-LAKTAMASEN (AMBLER, 1980; BUSH AND JACOBY, 2010) TABELLE 2 INTEGRONBESTANDTEILE (BENNETT, 1999) TABELLE 3 ANZAHL DER ISOLATE UND ITS AUFGESCHLÜSSELT NACH URSPRUNGSLAND UND STAMMSAMMLUNG TABELLE 4 ISOLIERUNGSORTE DER BAKTERIENSTÄMME TABELLE 5 ANGABEN DER EINSENDEN LABORATORIEN TABELLE 6 GERÄTE FÜR DIE MIKROBIOLOGISCHEN ARBEITEN TABELLE 7 MATERIALIEN FÜR DIE MIKROBIOLOGISCHEN ARBEITEN TABELLE 8 ANTIBIOTIKA FÜR DIE AGARDILUTION TABELLE 9 ANTIBIOTIKA-TESTBLÄTTCHEN FÜR DIE AGARDIFFUSION TABELLE 10 LÖSEN DER ANTIBIOTIKA TABELLE 11 KREUZTABELLE FÜR DEN Χ 2 UNABHÄNGIGKEITSTEST AM BEISPIEL VON IMIPENEM TABELLE 12 GERÄTE FÜR DIE MOLEKULARBIOLOGISCHEN ARBEITEN TABELLE 13 MATERIALIEN FÜR DIE MOLEKULARBIOLOGISCHEN ARBEITEN TABELLE 14 PCR PRIMER FÜR DIE DETEKTION VON MBL BEI P. AERUGINOSA TABELLE 15 PCR-PRIMER FÜR DIE DETEKTION VON MBL BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 16 PCR-ZYKLEN TABELLE 17 PRIMER ZUR AMPLIFIKATION UND SEQUENZIERUNG DER HAUSHALTSGENE BEI P. AERUGINOSA TABELLE 18 BREAKPOINTS DER AGARDILUTION NACH (NCCLS, 1999) TABELLE 19 P. AERUGINOSA MHK-WERTE (IN MG/L) TABELLE 20 ACINETOBACTER SPP. MHK-WERTE TABELLE 21 RESISTENZVERTEILUNG VON P. AERUGINOSA AUFGESCHLÜSSELT NACH LÄNDERN TABELLE 22 RESISTENZVERTEILUNG VON ACINETOBACTER SPP. AUFGESCHLÜSSELT NACH LÄNDERN TABELLE 23 KREUZRESISTENZEN ZU IMIPENEM BEI P. AERUGINOSA TABELLE 24 ERGEBNIS DES Χ 2 UNABHÄNGIGKEITSTESTS ZWISCHEN DEN ACHT ANTIBIOTIKA BEI P. AERUGINOSA TABELLE 25 - PEARSON-KORRELATIONSKOEFFZIENT R DER TITERSTFEN BEI P. AERUGINOSA TABELLE 26 ERGEBNIS DES Χ 2 UNABHÄNGIGKEITSTESTS ZWISCHEN DEN ACHT ANTIBIOTIKA BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 27 - PEARSON-KORRELATIONSKOEFFIZIENT R DER TITERSTUFEN BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 28 VERGLEICH VON MHK-ERGEBNISSEN FÜR IMIPENEM UND MEROPENEM FÜR P. AERUGINOSA TABELLE 29 VERGLEICH VON MHK-ERGEBNISSEN FÜR IMIPENEM UND DORIPENEM BEI P. AERUGINOSA TABELLE 30 VERGLEICH VON MHK-ERGEBNISSEN FÜR MEROPENEM UND DORIPENEM BEI P. AERUGINOSA TABELLE 31 VERGLEICH VON MHK-ERGEBNISSEN FÜR IMIPENEM UND MEROPENEM BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 32 VERGLEICH MHK-ERGEBNISSEN FÜR DORIPENEM UND IMIPENEM BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 33 VERGLEICH DER DORIPENEM UND MEROPENEM MHK-ERGEBNISSE FÜR ACINETOBACTER SPP TABELLE 34 AGARDILUTION UND AGARDIFFUSION BEI DEN ISOLATEN MIT HETEROGENEM RESISTENZ-PHÄNOTYP TABELLE 35 PHÄNOTYPISCHE UND GENOTYPISCHE UNTERSUCHUNGEN AUF MBL IM VERGLEICH TABELLE 36 - MBL-KODIERENDE ISOLATE MIT IHREN ISOGENEN AFLP-FOLGEISOLATEN NACH STATION SORTIERT TABELLE 37 MLST VON P. AERUGINOSA ERSTISOLATEN MIT MBL KODIERENDEN GENEN TABELLE 38 MHK-VERTEILUNG VON 8 ANTIBIOTIKA GEGENÜBER 528 P. AERUGINOSA - ISOLATEN TABELLE 39 MHK-VERTEILUNG VON 8 ANTIBIOTIKA GEGENÜBER 97 KLINISCHEN ACINETOBACTER SPP. ISOLATEN TABELLE 40 GENODIVERSITÄT DER STATIONEN, DIE P. AERUGINOSA EINGESCHICKT HABEN TABELLE 41 GENODIVERSITÄT DER STATIONEN DIE ACINETOBACTER SPP. EINGESCHICKT HABEN TABELLE 42 KREUZRESISTENZEN ZU IMIPENEM BEI P. AERUGINOSA TABELLE 43 KREUZRESISTENZEN ZU MEROPENEM BEI P. AERUGINOSA TABELLE 44 KREUZRESISTENZEN ZU DORIPENEM BEI P. AERUGINOSA TABELLE 45 KREUZRESISTENZEN ZU CEFTAZIDIM BEI P. AERUGINOSA TABELLE 46 KREUZRESISTENZEN ZU CEFEPIM BEI P. AERUGINOSA TABELLE 47 KREUZRESISTENZEN ZU PIPERACILLIN BEI P. AERUGINOSA TABELLE 48 KREUZRESISTENZEN ZU AMIKACIN BEI P. AERUGINOSA TABELLE 49 KREUZRESISTENZEN ZU CIPROFLOXACIN BEI P. AERUGINOSA TABELLE 50 KREUZRESISTENZEN ZU IMIPENEM BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 51 KREUZRESISTENZEN ZU MEROPENEM BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 52 KREUZRESISTENZEN ZU DORIPENEM BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 53 KREUZRESISTENZEN ZU CEFTAZIDIM BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 54 KREUZRESISTENZEN ZU CEFEPIM BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 55 KREUZRESISTENZEN ZU PIPERACILLIN BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 56 KREUZRESISTENZEN ZU AMIKACIN BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 57 KREUZRESISTENZEN ZU CIPROFLOXACIN BEI ACINETOBACTER SPP TABELLE 58 VERGLEICH DER CEFTAZIDIM UND CEFEPIM MHK-ERGEBNISSE FÜR 528 P. AERUGINOSA TABELLE 59 VERGLEICH DER CEFTAZIDIM UND CEFEPIM MHK-ERGEBNISSE FÜR 97 ACINETOBACTER SPP TABELLE P.S AERUGINOSA ISOLATE MIT IHREM AFLP-GENOTYP, IHREN ERGEBNISSEN IM MBL-CD TEST UND IHREN MHK-WERTEN FÜR 8 ANTIBIOTIKA TABELLE ACINETOBACTER SPP. ISOLATE MIT IHREM AFLP-GENOTYP, DEN ERGEBNISSEN IM MBL-CD-TEST UND IHREN MHK-WERTE FÜR 8 ANTIBIOTIKA

5 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis ABBILDUNG 1 SCHEMATISCHE DARSTELLUNG EINES INTEGRONS KLASSE ABBILDUNG 2 SCHEMATISCHE DARSTELLUNG EINER AFLP BEI P. AERUGINOSA ABBILDUNG 3 VERTEILUNG DER MHK VON IMIPENEM, MEROPENEM UND DORIPENEM BEI 528 P. AERUGINOSA ISOLATEN ABBILDUNG 4 VERTEILUNG DER MHK VON CEFTAZIDIM UND CEFEPIM BEI 528 P. AERUGINOSA ISOLATEN ABBILDUNG 5 VERTEILUNG DER MHK VON PIPERACILLIN BEI 527 P. AERUGINOSA ISALATEN ABBILDUNG 6 VERTEILUNG DER MHK VON AMIKACIN BEI 528 P. AERUGINOSA ISOLATEN ABBILDUNG 7 VERTEILUNG DER MHK VON CIPROFLOXACIN BEI 528 P. AERUGINOSA ISOLATEN ABBILDUNG 8 VERTEILUNG DER MHK VON IMIPENEM, MEROPENEM UND DORIPENEM BEI 97 ACINETOBACTER SPP. ISOLATEN ABBILDUNG 9 VERTEILUNG DER MHK VON CEFTAZIDIM UND CEFEPIM BEI 97 ACINETOBACTER SPP. ISOLATEN 46 ABBILDUNG 10 VERTEILUNG DER MHK VON PIPERACILLIN BEI 97 ACINETOBACTER SPP. ISOLATEN ABBILDUNG 11 VERTEILUNG DER MHK VON AMIKACIN BEI 97 ACINETOBACTER SPP. ISOLATEN ABBILDUNG 12 VERTEILUNG DER MHK VON CIPROFLOXACIN BEI 97 ACINETOBACTER SPP. ISOLATEN... 47

6 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis AB Antibiotikum AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism AME Aminoglykosid modifizierende Enzyme AMK Amikacin ATCC American Type Culture Collection B Belgien BG BURST group BURST Based upon related Sequence Types CAZ Ceftazidim CEF Cefepim CIP Ciprofloxacin CLSI Clinical Laboratory Standards Institute D Deutschland dntp Desoxynucleosid-Triphosphat DDD defined daily dose DOR Doripenem EARSS European Antimicrobial Resistance Surveillance System EDTA Ethylendiamintetraacetat GENARS German Network for Antimicrobial Resistance Surveillance H Ungarn I Italien IMP Metallo-β-Laktamase vom Imipenemase-Typ IPM Imipenem IPSE Improving Patient Safety in Europe ITS Intensivpflegestation IUK Institut für Umweltmedizin und Krankenhaushygiene Freiburg KBE Koloniebildende Einheiten MBL Metallo-beta-Laktamase MBL-CD Metallo-beta-Laktamase Combined Disc MDR Multi drug resistant: Resistenz ggü. Imipenem, Ceftazidim, Piperacillin und Ciprofloxacin MER Meropenem MHD Minimaler Hemmhofdurchmesser MHK Minimale Hemmkonzentration MLST Multi Locus Sequence Typing Mt Malta MYSTIC Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection Na 2 CO 3 Natriumcarbonat NaOH Natriumhydroxid PCR Polymerase-Ketten-Reaktion PIP Piperacillin Ru Rumänien RR relatives Risiko SARI Surveillance der Antibiotikanwendung und bakterieller Resistenzentwicklung auf Intensivpflegestationen SDS Sodiumdodecylsulfat Sk Slowakei ST Sequenztyp VIM Metallo-β-Laktamase vom Verona Imipenemase-Typ

7 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa ist ein gram-negatives, obligat aerobes, nicht fermentierendes Stäbchenbakterium. Es gehört in die Familie der Pseudomonaceae gelang zum ersten Mal die Anzüchtung einer Reinkultur dieses Keims aus dem blaugrünen Eiter, woher auch sein ursprünglicher Name Bakterium pyocyaneum herrührte. Aufgrund seiner bescheidenen Nährstoffansprüche ist P. aeruginosa ein ubiquitär in der Umwelt vorkommender Nass- und Pfützenkeim (Pitt, 1998) und hat wegen dieser hohen Umweltpersistenz eine große Bedeutung als nosokomialer Erreger erlangt. Er kann unter Umständen sogar in ungenügend konzentrierten Desinfektionsmitteln wachsen (Siebor et al. 2007). P. aeruginosa ist ein opportunistischer Keim und verursacht nur selten Infektionen bei gesunden Personen. Für eine Infektion muss entweder die natürliche physikalische Barriere des Körpers gestört sein, z. B. durch intravenöse Katheter, oder eine Schwächung des Immunsystems vorliegen (Gales et al. 2001). P. aeruginosa ist die wichtigste Ursache von beatmungsassoziierten Pneumonien (NNIS, 2004). Laut dem National Nosocomial Infection Surveillance System Report, der Daten von 1986 bis 1998 ausgewertet hat (NNIS, 1998), ist P. aeruginosa mit 14% der zweithäufigste Erreger nosokomialer Pneumonien. Er stellt 7% der Harnwegsinfektionserreger dar, 8% der chirurgischen Infektionen, und 2% bei den Bakteriämieerregern. Betrachtet man alle Infektionen, stellt P. aeruginosa nach Staphylococcus aureus (13,3%), Enterococcus spp. (11,0%) und E. coli (11%) mit 9% den viert häufigsten Infektionserreger dar. Außerdem ist er eine gefürchtete Komplikation bei Patienten mit großen Brandwunden oder bei Zystischer Fibrose, denn 90% der Todesfälle bei Patienten mit Zystischer Fibrose lassen sich auf chronische P. aeruginosa- Infektionen der Lunge zurückführen (Cystic Fibrosis Foundation, 2002). In den letzten Jahren gewinnt er immer mehr an Bedeutung, weil er zahlreiche Resistenzen auch gegen Reserveantibiotika erlangt. Auf Intensivstationen finden sich neben besonders kranken und in ihrem Immunsystem geschwächten Patienten zahlreiche Risikofaktoren, die die Infektion mit einem resistenten Keim begünstigen, wie z. B. der Einsatz von künstlicher Beatmung, intravenösen Kathetern und Blasenkathetern, ein doppelt so hoher Antibiotikaverbrauch als auf normalen Stationen und lange Aufenthaltsdauer der Patienten (Kollef and Fraser, 2001). Natürliche Resistenzen P. aeruginosa weist einige intrinsische, natürliche Resistenzen auf, welche die Behandlung einer Infektion mit diesem Erreger erschweren. Die wichtigsten intrinsischen Resistenzmechanismen sind eine im Vergleich zu anderen gram-negativen Krankheitserregern geringere Permeabilität der outer membrane, ein Breitspektrum-Effluxsystem und die Ausstattung mit einer chromosomal kodierten, induzierbaren AmpC-β-Laktamase (Hancock, 1998; Pitt, 1998). Sie werden im Folgenden kurz erläutert. 7

8 Einleitung Damit hydrophile Antibiotika in die Bakterienzelle eindringen können, sind so genannte Porine notwendig. Das häufigste Porin bei P. aeruginosa stellt OprF dar. Es ist ein unspezifischer Kanal und lässt nur Moleküle penetrieren, die kleiner als 9 kda sind (Pitt, 1998). Es stellt somit einen uneffektiven Eintrittsweg für viele Antibiotika dar (Hancock, 1998). Die Efflux-Pumpen-Proteine MexA, MexB und OprM werden konstitutiv auf niedrigem Niveau exprimiert und tragen zur natürlichen Resistenz beim Wildtyp bei, indem sie eindringende Antibiotika wieder aus der Bakterienzelle hinausbefördern. Durch Knock-out- Mutationen an diesen kodierenden Genen steigen die Empfindlichkeitsraten gegenüber Chinolonen, β-laktamen, Tetracyclin und Chloramphenicol (Hancock, 1998). Wie viele andere gram-negative Nonfermenter besitzt P. aeruginosa eine induzierbare, chromosomal kodierte AmpC-β-Laktamase. Diese hydrolysiert über einen Serin- Rest im katalytischen Zentrum β-laktam-antibiotika wie Ampicillin und die meisten Cephalosporine. Außerdem ist sie meist gegenüber den handelsüblichen β -Laktamase-Hemmern, wie z. B. Sulbactam unempfindlich (Jacoby, 2009). Sie wird nicht konstitutiv exprimiert, kann aber von β-laktamen, Cephalosporinen und insbesondere von Imipenem, das durch die AmpC-beta-Laktamase kaum hydrolysiert wird, induziert werden (Hancock, 1998; Jacoby, 2009). Ureidopenicilline (z. B. Mezlocillin) und Breitspektrum- Cephalosporine (z. B. Ceftazidim) werden von der AmpC-Laktamase gehemmt, induzieren diese jedoch nur schwach. Sie sind deshalb solange wirksam, so lange die AmpC-Laktamase nicht exprimiert wird (Livermoore, 1995b). Aus dem Zusammenspiel dieser drei Mechanismen resultiert der natürliche Resistenzphänotyp von P. aeruginosa, der sich durch Resistenz gegenüber den folgenden β-laktamen auszeichnet: Aminopenicilline (auch in Kombination mit Clavulansäure), Cephalosporine der ersten und zweiten Generation (wie Cefazolin und Cefuroxim) sowie Cephalosporine der dritten Generation (wie Cefotaxim und Ceftriaxon). Darüber hinaus werden Resistenzen gegenüber Tetracyclin, Chloramphenicol, Makroliden und Lincosamiden vermittelt. (Hancock, 1998; Livermore, 2002) 1.2 Acinetobacter spp. Zu der Gattung Acinetobacter spp. zählen aerobe, gram-negative, nicht fermentierende, unbewegliche, Katalase-positive und Oxidase-negative Bakterien (Peleg et al. 2008). Im Jahr 1968 fassten Baumann et. al verschiedene Spezies unter diesem Gattungsnamen zusammen. Sie konnten jedoch keine weitere Unterteilung der Arten vornehmen, die sich auf funktionelle Merkmale stützte (Baumann et al. 1968). Die Einteilung wurde erst 1986 mit Hilfe einer DNA-DNA- Hybridisierung möglich. Sie ist bis heute die Goldstandard- Methode, die für die Routinediagnostik jedoch zu aufwendig ist. Deswegen fasst man auch heute noch unter dem Begriff A. calcoaceticus A. baumannii Komplex insgesamt vier Arten zusammen: A. calcoaceticus, A. baumannii, 8

9 Einleitung Acinetobacter Genospezies 3 und Acinetobacter Genospezies 13TU, weil diese sehr nah verwand sind und durch funktionelle Methoden schwer von einander zu unterscheiden sind (Gerner-Smidt et al. 1991). Aufgrund dieser Schwierigkeit wurde in der vorliegenden Arbeit darauf verzichtet, die einzelnen Spezies zu identifizieren, weswegen im Weiteren lediglich von Acinetobacter spp. gesprochen wird. Die drei wichtigsten klinisch relevanten Spezies sind dabei A. baumannii, Acinetobacter Genospezies 3 und Acinetobacter Genospezies 13TU. Acinetobacter spp. stellen geringe Ansprüche an ihre Umgebung und sind gegenüber Umwelteinflüssen sehr resistent. Sie können mehrere Wochen in unbelebter Umgebung überleben (Wendt, 1997), was eine Übertragung durch kontaminierte Gegenstände ermöglicht (Gastmeier, 2006). Acinetobacter spp. kommen in der Umwelt und als natürliche Körperflora des Menschen bei bis zu 44% der Bevölkerung vor. Unter hospitalisierten Patienten sind 75% kolonisiert. Die wichtigen nosokomialen Arten wie A. baumannii sind unter diesen jedoch selten (Seifert et al. 1997). Als Erreger von Hospitalismusinfektionen, vor allem auf Intensivstationen verursachen sie Pneumonien bei künstlich beatmeten Patienten. Die Mortalitätsrate dieser Infektionen reicht von 30-75% und ist mit derjenigen von P. aeruginosa vergleichbar (Garncho-Montero et al. 2005). Acinetobacter spp. verursachen auch häufig Bakteriämien, die von einer transitorischen Bakteriämie bis zum fulminanten septischen Schock reichen können (Joly-Guillou, 2005). Der Infektionsherd liegt häufig im Respirationstrakt. Außerdem begünstigen Verbrennungen Haut- und Weichteilinfektionen und Katheterismus die Entstehung von Harnwegsinfektionen durch Acinetobacter spp. (Gaynes and Edwards, 2005). Meningitiden kommen als sekundäre Infektion nach Schädel-Hirn-Traumen oder neurochirurgischen Eingriffen vor. Trotz einer hoch dosierten Antibiotika-Therapie steigt die Letalität hier bis auf 70 % (Metan et al. 2007), weil aufgrund der Blut-Hirnschranke die Penetration der antibiotischen Wirkstoffe ins Hirngewebe erschwert ist. Insgesamt ist Acinetobacter spp. für ungefähr 9 % aller nosokomialen Infektionen verantwortlich (Joly-Guillou, 2005). 1.3 Antibiotika Therapie Aufgrund der natürlichen Resistenz von P. aeruginosa steht dem behandelnden Arzt nur eine eingeschränkte Auswahl an Antibiotika für die Therapie zur Verfügung. Zu dieser zählen heutzutage folgende β-laktame: die Carbapeneme Imipenem, Meropenem und Doripenem, das Ureidopenicillin Piperacillin, das Carboxypenicillin Ticarcillin und die Cephalosporine Ceftazidim und Cefepim. Des Weiteren können auch Chinolone wie Ciprofloxacin und in Kombination mit anderen Aminoglykoside wie Gentamicin, Amikacin und Tobramycin eingesetzt werden (Gilbert et al. 2009). Die ersten Studien zu Acinetobacter spp. vor ungefähr 40 Jahren zeigten, dass diese Erreger Resistenzen gegenüber Penicillin, Ampicillin, Cephalosporinen der 1. Generation und gegenüber Chloramphenicol aufwiesen, während sie gegenüber Carbenicillin und Tetracyclinen und 9

10 Einleitung Aminoglykosiden sensibel waren. Aber im Laufe der Zeit entwickelten die klinischen Isolate besonders schnell Resistenzen, so dass sie mittlerweile gegenüber den meisten Antibiotika resistent geworden sind. Darunter fallen die Breitspektrum Cephalosporine, Fluorchinolone und zu einem gewissen Maß auch die Carbapeneme (Towner, 1998). Weil Alternativen fehlen, sind Breitspektrumpenicilline und -cephalosporine sowie Imipenem mit oder ohne zusätzliche Gabe von Aminoglykosiden immer noch als die wirksamste Therapie in der Literatur beschrieben (Munoz-Price and Weinstein, 2008) Beta-Laktam-Antibiotika Zu den β-laktam-antibiotika gehören Penicilline, Cephalosporine, Carbapeneme, Monobaktame und Beta-Laktamase Inhibitoren. Sie alle zeichnen sich durch einen β-laktamring aus und wirken, indem sie den letzten enzymatischen Schritt der bakteriellen Peptidoglycan-Synthese hemmen. Sie interagieren mit Enzymen der Bakterien, die sowohl als Transpeptidasen (auch Penicillin-binding- Protein (PBP) genannt) als auch als Transglykosylasen wirken, indem sie als falsches Substrat an das aktive Zentrum der Transpeptidase binden und dieses acetylieren. Dadurch wird die Quervernetzung der Peptidketten verhindert. Die osmotische Resistenz der Bakterienzelle nimmt dadurch ab und die Zelle wird lysiert (Walsh, 2000). Beta-Laktam- Antibiotika wirken nur in der Wachstumsphase bakterizid. Penicilline bestehen aus einem Tiazolidinring gebunden an einen β-laktamring, diese beiden bilden die Kernstruktur, die 6-Amino-Penicillan-Säure (6-APA), die für die antibakterielle Wirkung sorgt. Cephalosporine sind halbsynthetische Derivate des Cephalosporin C, das erstmals 1948 isoliert wurde. Sie besitzen eine 7-Amino-Chephalosporin-Säure (7-ACA) als Grundstruktur (Abraham, 1987). Ihre Einteilung nach dem Aktivitätsspektrum erfolgt in vier Generationen (1 bis 4), von denen in dieser Arbeit Ceftazidim als Vertreter der Generation 3b und Cefepim als Vertreter der vierten Generation verwendet wurden. Diese zeigen eine gute Aktivität gegenüber gram-negativen Bakterien und vor allem gegenüber Pseudomonaden, weil sie nicht die AmpC-β-Laktamase induzieren (Pitt, 1998). Alle Cephalosporine sind unwirksam gegenüber Enterokokken und kaum wirksam gegenüber Acinetobacter spp. und Stenotrophomonas maltophilia (Gilbert et al. 2009). Eine weitere Gruppe der β-laktame stellen die Carbapeneme Imipenem, Meropenem, Ertapenem und Doripenem dar. Diese bestehen aus einem β-laktamring und einem 5er-Ring, der ungesättigt ist und statt des bei Penicillinen üblichen Schwefelatoms ein C-Atom enthält. Sie haben ein weites Wirkungsspektrum und zeigen eine höhere Stabilität gegenüber β-laktamasen als andere β-laktame (Kattan et al. 2008). Sie sind Mittel der Wahl, wenn andere β-laktame versagen und resistente Erreger zu erwarten sind. Ertapenem wirkt nicht gegen gram-negative Nonfermenter wie P. aeruginosa und Acinetobacter spp. (Kattan et al. 2008). Doripenem ist ein neues Breitspektrum- Carbapenem. Es 10

11 Einleitung wurde 2005 unter dem Namen Finibax in Japan eingeführt. Im Oktober 2007 wurde es von der Food and Drug Administration unter dem Namen Doribax in den USA zugelassen Aminoglykoside Aminoglykoside wie das Amikacin hemmen die Proteinsynthese von aeroben gram-negativen Bakterien, indem sie die 30S Untereinheit der prokaryonten Ribosomen hemmen (Walsh, 2000). Aminoglykoside sind nicht die erste Therapiewahl bei P. aeruginosa Infektionen, weil sie vergleichsweise toxisch sind (Ototoxizität und Nephrotoxizität). Stattdessen werden sie in Kombination mit Imipenem, Piperacillin, Ceftazidim oder Ciprofloxacin bei schweren Infektionen verabreicht (Paramythiotou et al. 2004). Amikacin ist insbesondere schwerwiegenden Infektionen durch gram-negative, Gentamicin- oder Tobramycin- resistente Bakterien vorbehalten Fluorchinolone Fluorchinolone, wie das Ciprofloxacin setzen an der bakteriellen DNA-Replikation an. Sie binden kovalent an einen Komplex aus DNA und DNA-Gyrase oder Topoisomerase IV. Beide Enzyme gehören zu den Topoisomerasen Typ II Enzymen. Sie setzen bei Transkriptions- und Replikationsprozessen Doppelstrangbrüche in die DNA, um die DNA Superhelix zu entwinden. Durch die Bindung der Chinolone an diesen Komplex können die DNA-Stränge nicht wieder legiert werden. Die Defekte häufen sich in der Zelle an und lösen letztendlich das SOS Reparatur System aus, dass zum Zelltod durch Apoptose führt (Drlica and Zhao, 1997; Walsh, 2000). 1.4 Resistenzmechanismen Zusätzlich zu den natürlichen Resistenzmechanismen gibt es auch Resistenzmechanismen, die im Laufe der Zeit als Anpassung an die äußeren Umwelteinflüsse entstehen können. Dies geschieht durch Mutation und Konjugation unter einem Selektionsdruck. Zu diesen Resistenzmechanismen zählen der Verlust des in der outer membrane lokalisierten Porins OprD, das der Passage von Carbapenemen durch diese Membran dient, und die Überexpression der Efflux-Systeme MexAB-OprM bzw. die Expression von MexXY-OprM, MexCD-OprJ und MexEF- OprN, die gleichzeitig mehrere Antibiotikaresistenzen (β-laktame, Aminoglykoside, Chinolone) bewirken können (Livermore, 2002). Ein weiterer Resistenzmechanismus ist die Überexpression der chromosomalen AmpC-β-Laktamase, die die Empfindlichkeit gegenüber Piperacillin, Ticarcillin und Ceftazidim (Livermore, 1995 a) vermindert und durch die im Extremfall sogar Carbapeneme unwirksam werden können (Mushtaq and Livermore, 2004 b). Die Modifikation der Typ-II- Topoisomerasen bewirkt eine Chinolon-Resistenz (Livermore, 2002) und die Modifikation der PBP 11

12 Einleitung bewirkt eine Resistenz gegenüber β-laktamen. Desweiteren können zusätzliche Resistenzgene wie Aminoglykosid- modifizierende Enzyme (AME) (Poole, 2005) und verschiedene weitere β-laktamasen, die über mobile genetische Elemente in die Bakterienzelle eingebracht werden können, vorhanden sein. OprD (outer membrane protein) gehört zu den substratspezifischen Porinen und dient der Aufnahme von basischen Aminosäuren und von Carbapenemen (Hancock, 1998). Der häufigste Resistenzmechanismus gegenüber Carbapenemen bei P. aeruginosa ist der Verlust des Porins OprD, was zumeist auf Mutationen im Gen oprd beruht (Pai et al. 2001). Dabei kommt es zur Resistenz gegenüber Imipenem, aber nur zu verminderter Empfindlichkeit gegenüber Meropenem. Effluxsysteme können Resistenzen gegenüber den meisten Antibiotika-Klassen bewirken. Wichtige Effluxsysteme bei P. aeruginosa sind MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN (Pechere and Kohler, 1999). MexAB-OprM ist eine konstitutiv expremierte Effluxpumpe (Pechere and Kohler, 1999). MexXY-OprM kann Resistenz gegenüber Aminoglykosiden (z. B. Gentamicin), Erythromycin, Tetracyclinen und Glycylcyklinen vermitteln (Poole, 2005). Darüber hinaus ist es das einzige System, das durch eben diese Wirkstoffe induzierbar ist. Und es wird in Zusammenhang mit der adaptiven Aminoglykosid- Resistenz gebracht, welche bei P. aeruginosa beobachtet wurde (Hocquet et al. 2003). Modifikationen in den Typ-II-Topoisomerasen DNA-Gyrase und Topoisomerase IV, sind die häufigsten Resistenzmechanismen gegenüber Fluorchinolonen bei P. aeruginosa (Jalala and Wretlind, 1998). Diese Modifikationen werden durch Mutationen in den Genen gyra, gyrb, (A und B Untereinheit der DNA-Gyrase), und parc und pare (Untereinheiten der Topoisomerase) verursacht. Die meisten dieser Mutationen sind in dem Gen gyra lokalisiert. Die A-Untereinheit der DNA-Gyrase ist die primäre Zielstruktur der Fluorchinolone bei gram-negativen Bakterien. Diese Mutationen liegen zumeist innerhalb der QRDR (quinolone-resistance-determining region). Für das Erreichen hoher Fluorchinolon-Resistenz sind bei P. aeruginosa neben Doppel-Mutationen in gyra auch Modifikationen in der ParC-Untereinheit der Topoisomerase IV, der sekundären Zielstruktur der Chinolone, essentiell (Jalal and Wretlind, 1998). An Aminoglykosid- modifizierenden Enzymen (AME) gibt es N-Acetyltransferasen (AAC), O-Nukleotidyltransferasen (AAD oder ANT) und O-Phosphorylasen (APH), die spezifische Aminound Hydroxylgruppen der Aminoglykoside modifizieren und dadurch die Affinität des Antibiotikums an seine Zielstruktur, die prokaryontischen Ribosomen, signifikant reduzieren (Poole, 2005). Es wurde auch eine Variante einer N-Acetyltransferase (AAC(6 )-Ib-cr) identifiziert, die neben Aminoglykosiden auch Chinolone zu modifizieren vermag und dadurch gegenüber zwei nicht verwandten Antibiotika- Gruppen zugleich Resistenzen vermittelt (Robicsek et al. 2006). Die Gene Aminoglykosid- modifizierender Enzyme sind häufig Plasmid-kodiert oder auf Transposons in z. T. hoher Stückzahl als Genkassetten auf Integrons (siehe unten) lokalisiert. 12

13 Einleitung Viele Umweltkeime tragen Beta-Laktamasen natürlicherweise in ihrem Genom. Die Gründe dafür und ihr Ursprung sind noch unklar. Diese Enzyme spalten den β-laktam-ring der β-laktam- Antibiotika und inaktivieren sie. Beta-Laktamasen können chromosomal kodiert sein oder sich auf übertragbaren Genabschnitten, wie z. B. Transposons, Plasmiden oder Integrons befinden (Walsh et al. 2005). Es gibt zwei verschiedene Klassifikationsschemata für die Einteilung von β-laktamasen. Die Ambler- Klassifikation richtet sich nach der molekularen Struktur und teilt die β-laktamasen in vier verschiedene Gruppen A, B, C und D ein. Die Gruppen A, C, D sind Serin-β-Laktamasen und die Gruppe B beinhaltet die Metallo-β-Laktamasen (Ambler, 1980), die meist ein Zink-Ion in ihrem aktiven Zentrum aufweisen. Die Klassifikation nach Bush richtete sich nach den Substraten und den Inhibitoren der Enzyme, und damit den funktionellen Eigenschaften (Bush et al. 1995, Bush and Jacoby, 2010; Rasmussen and Bush, 1997). 13

14 Einleitung Tabelle 1 Klassifikation der beta-laktamasen (Ambler, 1980; Bush and Jacoby, 2010) Bush Jacoby Gruppe (2009) Ambler/ Molekulare Klasse kennzeichnendes Substrat Hemmbar durch: CA/ TZB* EDTA Beispiele 1 C Cephalosporine Nein Nein E. coli AmpC, P99, ACT-1, CMY-2, FOX-1, MIR-1 1e C Cephalosporine Nein Nein GC1, CMY-37 2a A Penicilline Ja Nein PC1 2b A Penicilline, frühe Cephalosporine Ja Nein TEM-1, TEM-2, SHV-1 2be A Extended-spectrum Cephalosporine, Monobaktame Ja Nein TEM-3, SHV-2, CTX-M-15, PER-1, VEB-1 2br A Penicilline Nein Nein TEM-30, SHV-10 2ber A Extended-spectrum Cephalosporine, Monobaktame Nein Nein TEM-50 2c A Carbenicillin Ja Nein PSE-1, CARB-3 2ce A Carbenicillin, Cefepim Ja Nein RTG-4 2d D Cloxacillin Variabel Nein OXA-1, OXA-10 2de D Extended-spectrum Cephalosporine Variabel Nein OXA-11, OXA-15 2df D Carbapeneme Variabel Nein OXA-23, OXA-48 2e A Extended-spectrum Cephalosporine Ja Nein CepA 2f A Carbapeneme Variabel Nein KPC-2, IMI-1, SME-1 3a B (B1) Carbapeneme Nein Ja IMP-1, VIM-1, CcrA, IND-1 B (B3) L1, CAU-1, GOB-1, FEZ-1 3b B (B2) Carbapeneme Nein Ja CphA, Sfh-1 NI unbekannt NI: not included, wurde in der Bush-Klassifikation von 1995 als Gruppe 4 definiert. * CA: Clavulansäure, TZB: Tazobactam 14

15 Einleitung Metallo-β-Laktamasen Zur Gruppe der Metallo-β-Laktamasen gehören die Enzyme der sogenannten Typen IMP, VIM, GIM, SPM und SIM. Sie gehören zur Klasse B1 nach Ambler. Metallo-β-Laktamasen ordnen mit ihrem Zink-Ion Wassermoleküle so an, dass sie als Nucleophile dienen, welche die Amidbindung des Beta-Laktamrings angreifen und zerstören. Aufgrund der großen strukturellen Unterschiede unter den MBLs ist deren Einteilung nicht ganz einfach (Walsh et al. 2005). In der Bush-Klassifikation werden sie der Gruppe 3 zugeteilt, die sich noch in weitere Untergruppen unterteilen lässt. MBLs der Gruppe 3a haben ein breites Wirksamkeitsspektrum, diejenigen der Gruppe 3b haben eine ausgeprägte Wirksamkeit bei den Carbapenemen, während Gruppe 3c Carbapeneme im Vergleich zu anderen β-laktamasen kaum hydrolysiert (Queenan and Bush, 2007). Anfang der 1990er Jahre gab es die ersten Berichte über IMP-1 positive gram-negative Keime in Japan (Watanabe et al. 1991). Später wurden IMP positive Keime auch in Europa entdeckt; 1997 in Portugal und Italien (Cornaglia et al. 1999; Da Silva et al. 1999). Und es folgten die VIM-Enzyme: VIM-1 wurde 1997 aus P. aeruginosa in Verona, Italien isoliert. Vom Stadtnamen rührt auch die Abkürzung her Veronese Imipenemase (Lauretti et al. 1999), VIM-2 in Frankreich (Poirel et al. 2000), Griechenland (Mavroidi et al. 2000) Italien (Pallecchi et al. 2001), Korea (Lee et al. 2002) und in Spanien (Pournaras et al. 2002), VIM-3 wurden in Taiwan (Yan et al. 2001) gefunden und VIM-4 in Isolaten aus Griechenland (Pournaras et al. 2002) Weitere Varianten der VIM-Typ Enzyme werden in einer Arbeit von Walsh (Walsh et al. 2005) beschrieben. Die Gene, die für IMP und VIM Enzyme kodieren befinden sich meistens als Genkassetten auf Integrons oder Plasmiden. Obwohl IMP-1 zuerst gefunden wurden, ist mittlerweile VIM-2 die weltweit am meisten verbreitete MBL (Walsh, 2008). Als dritte übertragbare MBL-Gruppe wurde die SPM-Typ MBL (Sao Paulo-MBL) im Jahr 1997 in P. aeruginosa entdeckt (Toleman et al. 2002). Sie wurde in Brasilien in bis zu 70% der klinischen Isolate gefunden (Cipriano et al. 2007). Die Metallo-β-Laktamase GIM (German Imipenemase) wurde erstmal 2002 in Düsseldorf beschrieben (Castanheira et al. 2004). In den letzten Jahren nahmen weltweit die Nachweise von Metallo-β-Laktamasen produzierenden gram-negativen nosokomialen Krankheitserregern inklusive P. aeruginosa stetig zu (Walsh et al. 2005). Metallo-β-Laktamasen hydrolysieren bis auf Aztreonam oder Polymyxin sämtliche β-laktame einschließlich der Carbapeneme, die sich als stabil gegenüber den meisten β-laktamasen der Klassen A, C, und D erwiesen haben. Die Produktion von Metallo-β-Laktamasen stellt ein ernsthaftes therapeutisches Problem dar, nicht zuletzt, weil bis heute kein klinisch einsetzbarer Inhibitor dieser Enzyme bekannt ist (Walsh et al. 2005). 15

16 Einleitung Integrons und Genkassetten Fast alle Gene, die für VIM- und IMP-MBLs kodieren, befindet sich in Genkassetten auf Integrons der Klasse 1 oder 3 (Walsh et al. 2005) oder werden durch die ISCR-Elemente (Insertion-Sequenz) von Transposons mobilisiert (Toleman et al. 2006). Integrons sind Elemente des Genoms, die eine spezifische atti1-rekombinationsstelle besitzen, in die Resistenzgene in Form von promotorlosen Genkassetten eingebaut und wieder mobilisiert werden können (Walsh et al. 2003). Sie stellen den Promotor für die Transkription der Kassettengene, die in der Regel keinen Promotor besitzen, zur Verfügung. Integrons weisen zwei stark konservierte und einen sehr variablen Bereich auf. Zu den essentiellen Bestandteilen eines Klasse-1-Integrons gehören: ein inti-gen, das für die ortspezifische Integrase kodiert, der angrenzende atti- Bereich, der von der Integrase erkannt wird und an dem die Genkassetten insertiert werden, sowie ein Promotor für die Integrase und ein Promotor für die Genkassette. Diese stark konservierten Elemente am 5 -Ende des Integrons werden als 5 -CS (5 -conserved segment) zusammengefasst. An den 5 -CS-Bereich schließt sich der variable Bereich des Integrons an, in dem Genkassetten liegen, deren Anzahl und Art stark variieren kann (Recchia and Hall, 1995, 1997). Stromabwärts der variablen Region liegt ein zweiter konservierter Bereich, der als 3 -CS (3 -conserved segment) bezeichnet wird. Das 3 -CS umfasst die drei Gene qace 1, suli und orf5. Das verkürzte Gen qace 1 kodiert für ein Effluxprotein, das Resistenz gegenüber quaternären Ammonium-Verbindungen vermittelt (Paulsen et al. 1993), während sul1 für eine alternative Dihydropteroat-Synthase kodiert und Resistenz gegenüber Sulfonamiden vermittelt (Stokes and Hall, 1989). Das für orf5 postulierte Gen-Produkt besitzt Ähnlichkeit mit Acetyltransferasen. Es ist jedoch noch unklar welche Funktion das entsprechende Protein erfüllt (Bissonnette and Roy, 1992). In der variablen Region von Integrons werden neben Genen für AME, die Resistenzen gegenüber Aminoglykosiden vermitteln, und β-laktamase-genen u. a. das Gen cmla gefunden, das für ein Chloramphenicolresistenz-vermittelndes Effluxprotein kodiert und zu den wenigen Genkassetten gehört, die mit einem eigenen Promotor ausgestattet sind (Bissonette and Roy, 1992). Integrons sind zumeist in Transposons der Tn21-Gruppe (Grinsted et al. 1990) der Tn3-Familie lokalisiert oder liegen frei auf Plasmiden vor (Bennett, 1999). Bislang wurden fünf Resistenz- Integron-Klassen identifiziert, die Genkassetten enthalten. Unter diesen stellen die Klasse-1-Integrons die zugleich häufigste und am besten charakterisierte Gruppe dar (Piorel et al. 2001) (Abbildung 1). inti1 att1 qace 1 sul1 ORF 5 5 conserved sequence inserted gene cassette(s) 3 conserved sequence Abbildung 1 schematische Darstellung eines Integrons Klasse 1 16

17 Einleitung Tabelle 2 Integronbestandteile (Bennett, 1999) Gen Protein und Aufgabe Konservierte Abschnitte qace 1 Effluxprotein, vermittelt Resistenz gegenüber Antiseptika und quaternären Ammoniumverbindungen inti1 Integrase suli1 Effluxpumpe, vermittelt Resistenz gegenüber Sulphonamiden ORF5 Offenes Leserraster für horizontalen Gentransport attl Attachment, Rekombinationsschnittstelle Genkassetten (Bsp.) bla VIM-2 aaca4, aaca7 Metallo-Beta-Laktamase Aminoglykosid-Acetyltransferase cmla Chloramphenicol-Resistenz vermittelndes Effluxprotein (Bissonnette et al. 1991) pse1 Beta-Laktamase, Carbanecillinase aada Aminoglykosid-Antibiotika-Adenyltransferase attc-sequence = 59be flankiert die Genkassetten Gen-Kassetten sind kleine DNA-Abschnitte von ungefähr 1 kbp, die aus einem Gen, das meistens für eine Antibiotika-Resistenz (MBL und/ oder AME) kodiert und einer Rekombinationsschnittstelle, dem 59-base Element, bestehen (Bennett, 1999). Sie liegen entweder frei in zirkulärer Form vor oder werden in Integrons eingefügt. Genkassetten können von einem Integron auf ein anderes übertragen werden. Sie brauchen jedoch die Hilfe von Plasmiden bzw. Transposons, um auf ein anderes Bakterium übertragen zu werden (Bennett, 1999). Es sind mehr als 60 unterschiedliche Resistenz- Genkassetten identifiziert worden (Martinez-Freijo et al. 1998). Transposons sind DNA-Sequenzen, die zwischen verschiedenen nicht homologen Gen-Loci bewegt werden können. Sie können außer den Transpositionsgenen weitere, den Phänotyp verändernde Determinanten, z. B. Resistenzgene, aufweisen. Sie bestehen aus einem Gen für die Transposase, tnp, der Regulatorsequenz tnpr und einem Gen für die Resolvase, sowie einem Resistenzgen. Diese Elemente liegen zwischen zwei inverted repeats und stellen als mobile Elemente ein Bindeglied zwischen chromosomal- und Plasmid-kodierter Resistenz dar. Mit ihrer Hilfe können Resistenzgene vom Chromosom auf Plasmide transferiert und durch Konjugation verbreitet werden. Plasmide sind zirkuläre DNA-Doppelstränge (3x10 3 4,5x10 5 bp), die separat vom Chromosom repliziert werden und neben Resistenzdeterminanten auch Virulenzfaktoren beherbergen können. Sie werden vertikal bei der Zellteilung an die Tochterzellen oder horizontal durch Konjugation weitergegeben. Der horizontale Transfer kann zwischen den Individuen einer Spezies oder zwischen Mitgliedern verschiedener Arten ablaufen. Viele MBL-Gene sind auf Plasmiden lokalisiert (Walsh et al. 2005). Das erhöht die Gefahr, die von diesen Genen ausgeht, denn es macht sie für den lateralen Gentransfer zugängig. 17

18 Einleitung Ziel der Arbeit Mit dieser Arbeit sollte die in vitro Empfindlichkeit von resistenten, vorselektionierten 528 P. aeruginosa Isolaten und 97 Acinetobacter spp. Isolaten gegenüber Pseudomonas-wirksamen Antibiotika (Imipenem, Meropenem, Doripenem, Ceftazidim, Cefepim, Piperacillin, Amikacin und Ciprofloxacin) untersucht werden. Die insgesamt 625 Isolate stammen von europäischen Intensivpflegestationen (ITS) und waren als Carbapenem-resistent und/ oder Chinolon-resistent und/ oder Amikacin-resistent eingestuft worden. In Agardilutionstechnik sollten die Minimalen Hemmkonzentrationen bestimmt werden. Mithilfe der Genotypisierung durch Amplified Fragment Length Polymorphism sollte nach Kreuzübertragungs- oder Ausbruchs-Ereignissen innerhalb der jeweiligen ITS gesucht werden, um den verzerrenden Einfluss einzelner, resistenter Ausbruchsstämme auf Resistenzraten beschreiben zu können. Unter den vorhandenen Isolaten sollten MBL-tragende Stämme mit Hilfe des Metallo-beta- Laktamase-combined Disk-Test (MBL-CD) mit EDTA und anschließender Bestätigung durch PCR- Nachweis bla IMP oder bla VIM kodierender DNA-Abschnitte identifiziert werden. Damit sollte eine Aussage zur Verbreitung MBL-positiver Isolate auf europäischen Intensivstationen und dem vorherrschenden MBL-Typ getroffen werden. Da MBL auf Integrons kodiert werden, die oft weitere Resistenzgene enthalten, sollte sowohl die Größe der Integrons als auch mögliche weitere Resistenzgene auf diesen Integrons mittels der Integron PCR bestimmt werden. Mithilfe von MLST sollte schließlich die These von Rossolini et al. geprüft werden, dass bei MBLpositiven P. aeruginosa-stämmen einzelne genetisch verwandte Gruppen prädominieren. Diese Annahme ist unerwartet, weil MBL in der Regel von genetisch mobilen Elementen kodiert werden und die Spezies P. aeruginosa sich durch eine hohe Rate an Rekombination mittels horizontalem Gentransfer auszeichnet. 18

19 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Bakterienstämme Es wurden im Rahmen dieser Arbeit insgesamt 625 vorwiegend resistente, klinische Isolate untersucht. Sie wurden im Rahmen der Surveillance Projekte SARI (Surveillance of Antimicrobial Use and Antimicrobial Resistance in Intensive Care) (Meyer et al. 2003) und IPSE (Improving Patient Safety in Europe, im Zeitraum von 2004 bis 2007 isoliert. SARI ist Teil eines Forschungsnetzwerkes zur Epidemiologie von Antibiotikaverbrauch und Resistenzraten bei Infektionserregern. Es erfasst seit Februar 2000 die Anwendungsraten von Antibiotika und das Auftreten von multi-resistenten pathogenen Bakterien auf Intensivstationen. IPSE ist ein Europaweites Projekt zu nosokomialen Infektionen und Antibiotikaresistenzen. Für das SARI Projekt sollten zusätzlich zu den Surveillance Daten gezielt resistente Bakterienstämme wie MRSA, Glycopeptidresistente Enterokokken, Cephalosporin-resistente K. pneumoniae, Quinupristin/ Dalfoprostinresistente Staphylokokken und Enterokokken sowie gram-negative Bakterien mit Carbapenem-, Chinolon- und/ oder Amikacin-Resistenz eingeschickt werden. Für die vorliegende Arbeit wurden aus den zuletzt genannten drei Gruppen die P. aeruginosa und Acinetobacter spp. verwendet. Im Rahmen des IPSE Projektes schickten die Teilnehmer erst 20 Isolate bestimmter Spezies mit Resistenzen gegenüber verschiedenen Wirkstoffen und anschließend 10 Isolate derselben Spezies unabhängig von ihrem Resistenzverhalten ein. Für die vorliegende Arbeit wurden daraus A. baumannii und P. aeruginosa mit einer Fluorchinolon- und/ oder Carbapenem-Resistenz verwendet. Bei den 625 Isolaten handelte es sich um 513 Pseudomonas aeruginosa (371 SARI-Isolate, 142 IPSE- Isolate) und 97 Acinetobacter spp (19 SARI-Isolate und 78 IPSE-Isolate), die von 38 verschiedenen europäischen Intensivpflege-Stationen (ITS) stammen, sowie um 5 VIM-2 produzierende P. aeruginosa Isolate von A. Deplano et al., die in Belgien isoliert wurden (Deplano et al. 2007) und 10 phänotypisch MBL-positive Isolate aus dem Heidelberger Limbach Labor. Unter den 38 ITS waren 25 deutsche, 8 italienische Stationen, eine rumänische, eine ungarische Station, sowie zwei Stationen der Slowakischen Republik und eine ITS aus Malta. Die Ursprungsländer und die Anzahl der eingeschickten Isolate sind in Tabelle 3 dargestellt. Unter den ITS waren internistische, chirurgische und interdisziplinäre Stationen. Die meisten Isolate wurden aus dem Respirationstrakt und dem Harnwegssystem isoliert. Siehe dazu Tabelle 4. 19

20 Material und Methoden Tabelle 3 Anzahl der Isolate und ITS aufgeschlüsselt nach Ursprungsland und Stammsammlung P. aeruginosa Acinetobacter spp. Projekt Land Anzahl der ITS Anzahl der Isolate Anzahl der ITS Anzahl der Isolate Belgien, Brüssel 5 Deutschland, Heidelberg (Labor 10 Limbach) SARI Deutschland IPSE Deutschland Italien Malta Rumänien 1 20 Slowakei Ungarn Summe Tabelle 4 Isolierungsorte der Bakterienstämme Respirationstrakt n (%) Harnwege n (%) Blut und Serum n (%) Wunden n (%) Sonstiges n (%) ohne Angaben n (%) P. aeruginosa 344 (65%) 76 (14%) 9 (1,2%) 16 (3%) 29 (5,5%) 54 (10,2%) Acinetobacter spp. 48 (49,5%) 9 (9,3%) 3 (3,1%) 4 (4,1%) 19 (19,6%) 14 (14,4%) Auswahlkriterium für die Isolate war das Vorhandensein entweder einer Carbapenem-, Cephalosporin-, Chinolon- und/ oder einer Amikacin- Resistenz, welche von den einsendenden Laboratorien durch phänotypische Messungen festgestellt wurden (Tabelle 5). Für die Stammsammlung wurden die Isolate mit einem Spezieskürzel und einer laufenden Nummer versehen und im defibrinierten sterilen Pferdeblut bei -80 C eingefroren. 20

21 Material und Methoden Tabelle 5 Angaben der einsenden Laboratorien Resistenzangaben Anzahl der Isolate P. aeruginosa Acinetobacter spp. Carbapenem-resistent Chinolon-resistent Amikacin-resistent 35 6 Cephalosporin-resistent 50 3 keine Resistenz-Angaben Nachidentifizierung Die Nachidentifizierung der P. aeruginosa Stämme wurde mittels Oxidase-Teststreifen von heipha Dr. Müller GmbH (Heidelberg, Deutschland) zum Nachweis einer Cytochromoxidase und durch Anzüchten auf dem Selektivagar Cetrimid bei 42 C mit phänotypischer Bestimmung des vorrangig produzierten Pigments durchgeführt. Bei Stämmen, bei denen die Ergebnisse dieser mikrobiologischen Verfahren nicht eindeutig waren, wurde eine Identifizierung mit dem VITEK System (biomèrieux, Marcy l Etoile, Frankreich) durchgeführt. Dieses ermöglicht eine automatische Identifizierung mittels biochemischer Testmethoden und einer spezifischen Datenbank (O Hara et al. 1997). Acinetobacter Arten lassen sich nicht alle eindeutig durch phänotypische Methoden identifizieren (Peleg et al. 2008). Hierzu ist eine Genotypisierung notwendig, deswegen wurde in dieser Arbeit nur das Genus mittels VITEK System bestimmt. 21

22 Material und Methoden 2.2 Materialien für die Mikrobiologischen Arbeiten Tabelle 6 Geräte für die mikrobiologischen Arbeiten Gerät Hersteller Firmensitz 8-Kanal-Pipette µl Biohit Proline Rosbach v. d. Höhe, Deutschland Autoklav Münchener Medizin Mechanik Planegg, Deutschland Vakulab S3000 und Vaculab HP Brutschrank 36 C Memmert Schwabach, Deutschland Brutschrank 42 C Heraeus Leonberg, Württ., Deutschland Bunsenbrenner IBS IntegraBiosciences Schweiz Fireboy eco Dispenser bis 10 ml Fortuna Optifix Wertheim, Deutschland Dispenser bis 30 ml Fortuna Optifix Wertheim, Deutschland Feinwaage: max. 210 g; min. 1 mg; Sartorius Göttingen, Deutschland d=0,05 mg Gaspatronen CV 360 Butan Campingaz Frankreich Heizplatten Janke & Kunkel GmbH & Co. KG Staufen i. Br., Deutschland IKA RCT classic IKAMAG RET IKA Labortechnik Kühlschrank +5 C Bosch Stuttgart, Deutschland Kühlschrank +5 C (ML305C) Dometic Siegen, Deutschland Kühlschrank -20 C (MF285) Dometic Siegen, Deutschland Kühlschrank -80 C (UF756) Dometic Siegen, Deutschland Multipoint-Inokulator Mast Diagnostics Ltd. Reinfeld, Deutschland Pipette 1-10 µl AnalyticConDiscovery GmbH Brandenburg, Deutschland Pipetten µl u µl Eppendorf Hamburg, Deutschland Pipetten 1 ml-5 ml Ratiolab GmbH Dreieich, Deutschland Spektrophotometer DADE Behring West Sacramento, USA MicroScanTurbidityMeter Spiegel für Mikrotiterplatten Boehringer Mannheim GmbH Mannheim, Deutschland Micur -Viewer Spülmaschine Miele Karlsruhe, Deutschland Stempel für Antibiotikablättchen Becton Dickinson Deutschland Sterilisator Memmert Schwabach, Deutschland VITEK System biomérieux Marcy l Etoile, Frankreich Vortexer Janke & Kunkel GmbH & Co. KG Staufen i. Br., Deutschland IKA Labortechnik Waage (Nr.2353) max g; d=0,1 g Sartorius Göttingen, Deutschland 22

23 Material und Methoden Tabelle 7 Materialien für die mikrobiologischen Arbeiten Material Hersteller Firmensitz Cetrimid-Agar-Platten heipha Dr. Müller GmbH Heidelberg, Deutschland Columbia-Blutagar-Platten heipha Dr. Müller GmbH Heidelberg, Deutschland EDTA-Lösung 0,1 M Erlenmeyerkolben Schott Duran Wertheim, Deutschland Glasflaschen Schott Duran Wertheim, Deutschland GNI+ Karten (Identifikationskarten biomérieux Marcy l Etoile, Frankreich für gram-negative Nonfermenter für das VITEK System) Mueller-Hinton-Agar nach NCCLS Merck Darmstadt, Deutschland Mueller-HintonII-Bouillon, Kationen optimiert Becton, Dickinson GmbH Sparks, USA Le Pont de Claix, Frankreich Natriumcarbonat Na 2 CO 3 Riedel-de Häen AG Seelze, Deutschland Oxidase-Teststreifen heipha Dr. Müller GmbH Heidelberg, Deutschland Pipettenspitzen Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland PS-Abdeckplatten 127,0/ 85/ 11 Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland oder Neuburg, Deutschland PS-Microplate, 96K, 127,0/ 85/ 11 Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland (Mikrotiterplatte) Schalen 94/16 mm (Petrischalen) Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland oder Kremsmünster, Österreich Sterile Wattestäbchen Applimed SA Chatel-St.-Denis, Schweiz Wägepapier Macherey-Nagel Düren, Deutschland Tabelle 8 Antibiotika für die Agardilution Reinsubstanz Abkürzung Hersteller und Firmensitz Amikacin AMK Fresenius Bad Homburg v. d. H. Cefepim FEP Bristol-Myers Squibb GmbH in München Ceftazidim CAZ Glaxo Smith Kline GmbH & Co. KG in München Ciprofloxacin CIP Bayer AG Pharma, Leverkusen Doripenem DOR Johnson&Johnson, USA Imipenem IPM MSD Sharp & Dolime GmbH in Haar Meropenem MEM Astra Zeneca Pharmaceuticals, Deutschland Piperacillin PIP Wyeth Pharma GmbH, Münster 23

24 Material und Methoden Tabelle 9 Antibiotika-Testblättchen für die Agardiffusion Antibiotikum Beladung Hersteller Firmensitz CAZ 30 µg Becton, Dickinson GmbH Heidelberg, Deutschland CIP 5 µg Oxoid Hampshire, England CIP 5 µg Becton, Dickinson GmbH Heidelberg, Deutschland IPM 10 µg BBL TM Sparks, USA Pure Antibiotikum- Blättchen - Whtaman GmbH Schleicher & Scheull Dassel, Deutschland 2.3 Mikrobiologische Methoden Die Herstellung der Mueller-Hinton-Bouillon (MHB) erfolgte gemäß den Richtlinien des Clinical and Laboratory Standarts Institute (CLSI) ehemals NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standarts) (NCCLS, 1999), indem 22 g MHB-Pulver in 1 L demineralisiertem Wasser aufgelöst und bei 121 C 20 min. lang autoklaviert wurden. Nach Abkühlung der Bouillon wurde diese mit Hilfe eines Dispensers in sterile Reagenzröhrchen abgefüllt. Zur Herstellung von Mueller-Hinton-Agar (MHA) wurden 34 g MHA-Pulver in 1 L demineralisiertem Wasser aufgelöst und bei 121 C 20 min. lang autoklaviert. Der auf ca. 50 C abgekühlte Agar wurde mit Hilfe eines Dispensers in Petrischalen (16 ml) oder in Abdeckplatten (27 ml) gegossen und erstarrte bei Zimmertemperatur. Die Isolate der Stammsammlung, die bei -80 C gelagert wurden, wurden auf Columbia- Blutagarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37 C bebrütet. Am nächsten Tag wurden die Bakterien in den Reagenzglasröhrchen mit MHB suspendiert. Die Konzentration dieser Suspension wurde mittels eines Photometers auf 1x10 8 KBE/ml bzw. 0,5 McFarland Standard eingestellt. Das entspricht bei einer Messung im Photometer Extinktionswerten von 0,16 bei P. aeruginosa, 0,15 bei Acinetobacter spp. und 0,11 bei Staphylococcus aureus ATCC 29213, der als zusätzlicher Kontrollstamm neben P. aeruginosa ATCC 27853, zur Sicherung der Reproduzierbarkeit, verwendet wurde Agardilution Zur Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK) wurde die Agardilution nach den CLSI/ NCCLS Richtlinien durchgeführt (NCCLS, 1999). Die verwendeten Antibiotika wurden entsprechend ihrer Löslichkeit und ihrer Aktivität aufgelöst (Tabelle 10) und mit demineralisiertem Wasser auf eine Konzentration von 1280mg/l verdünnt. Bei dieser Konzentration beginnend wurde eine geometrische Verdünnungsreihe in Erlenmeyerkolben bis zu einer Konzentration von 0,15mg/l durchgeführt. 24