Aminosäuren nennt man die Carbonsäuren, in denen ein oder mehrere Wasserstoffatome des Alkylrests durch eine Aminogruppe ersetzt sind.

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1 Aminosäuren Aminosäuren nennt man die arbonsäuren, in denen ein oder mehrere Wasserstoffatome des Alkylrests durch eine Aminogruppe ersetzt sind. 1. Experiment: Etwas Glycin wird in einem eagenzglas mit Wasser angefeuchtet, mit 3 Plätzchen atriumhydroxid versetzt und erhitzt. Über die eagenzglasöffnung hält man Indikatorpapier. Beobachtung: Das eagenzglas erhitzt sich bereits bevor mit dem Bunsenbrenner gearbeitet wird. Beim Erhitzen der Lösung bildet sich ein Gas, das den Indikatorstreifen blau färbt. Die toffe Glycin und atriumhydroxid reagieren unter Bildung eines alkalischen Gases. 2. Experiment: Man stellt eine Lösung von alzsäure und Glycein (je 0,1 mol l 1 ) her. 20 ml davon werden mit atronlauge (c = 0,1 mol l 1 ) titriert, indem man anfangs jeweils 1 ml und später jeweils 0,5 ml hinzutropft. eaktion von Glycin mit alzsäure: l heterolytischer Bindungsbruch l Das hloridion ist in der Lösung beweglich.

2 Titrationstabelle: Titrationskurve: V(a) in ml pwert V(a) in ml pwert 0 1,75 19,5 4,57 1 1,8 20 7,14 2 1, ,2 3 1,9 23 8,4 4 1, ,54 5 2, ,68 6 2, ,78 7,3 2, ,87 8 2,2 28 8,98 9 2, , , , , ,2 12,1 2, ,28 13,1 2, , , , , ,53 15,5 2, , , ,71 16,5 2,9 38 9, , ,5 3, , , ,4 18,5 3, ,5 19 3, ,1

3 Auswertung der Titrationskurve V(Aminosäure) = 20 ml c(aminosäure) = 0,1 mol l 1 c(a) = 0,1 mol l 1 Die Auswertung von Titrationskurven erfolgt vor allem mit der endersonasselbalchgleichung (G): ( ) c A p pk lg c A = s ( ) Diese Gleichung gilt allerdings nur für Werte, an denen keine der beiden Konzentrationen ull ist, weil der Logarithmus von 0 zur Basis 10 nicht definiert ist. Der Beginn der Titration sieht wie folgt aus: Die positiv geladene Aminosäure gibt das Wasserstoffatom der arboxylgruppe ab, so dass sowohl eine positive als auch eine negative Teilladung innerhalb des Moleküls vorliegt. Da das Molekül nach außen hin neutral ist, wird es Zwitterion genannt: 3 2 ach Zugabe von 10 ml atronlauge liegen das positiv geladene Molekül (A ) und das Zwitterion (A / ) in gleichen Mengen vor. Mit der G heißt das: 50% p = pks lg 50% p = pk lg 1 s () p = pk ÄP s 1 Da der erste pk s Wert bei 2,35 liegt, ist nun auch der pwert am ÄP 1 (albäquivalenzpunkt) bestimmt. ach Zugabe von 20 ml a liegt das Zwitterion zu 100 % vor, es ist also ein Äquivalenzpunkt erreicht. Dieser kann durch Messungen (z.b. Tabelle) oder graphisch bestimmt werden.

4 Graphische Bestimmung des ÄP an einer beliebigen Titrationskurve: Die beiden durchgezogenen Geraden sind Tangenten gleicher teigung und die gestrichelte Gerade, die durch den ÄP geht, wird so gesetzt, dass sie von beiden Tangenten gleich weit entfernt ist. ach Zugabe von 30 ml a liegt wiederum ein Gleichgewicht vor, diesmal wird das Wasserstoffatom der Aminogruppe abgegeben: Mit der G heißt das: 3 s () 50% p = pks lg 50% p = pk lg 1 p = pk ÄP s 2 2 Der zweite pk s Wert liegt bei 9,78. Der pwert am ÄP 2 ist somit 9,78. Am Äquivalenzpunkt 1, an dem das Zwitterion zu 100 % vorliegt, ist die Lösung nach außen hin neutral. Dieser Zustand wird mit isoelektrischer Punkt (IEP) bezeichnet.

5 isoelektrischer Punkt: Der pwert bei dem das Zwitterion zu 100 % vorliegt heißt isoelektrischer Punkt. Beide Gruppen haben entgegengesetzte Ladungen in gleicher Menge. Er wird im Allgemeinen nach folgender Formel berechnet: pk pk 2 s1 s2 ( ) = p IEP Beispiel: Leucin (pk s1 = 2,36, pk s2 = 9,60) pks1 pks2 2,36 9,60 p( IEP) = = = 5, Beispiel: Asparaginsäure (pk s1 = 1,88, pk s2 = 9,60, pk s = 3,60) Bei sauren Aminosäuren wird der Wert ausgeschlossen, der im basischen Milieu liegt: pks1 pks 1,88 3,60 p( IEP) = = = 2, Beispiel: Lysin (pk s1 = 2,18, pk s2 = 8,95, pk s = 10,53) Bei alkalischen Aminosäuren wird der Wert ausgeschlossen, der im sauren Milieu liegt: pks2 pks 8,95 10,53 p( IEP) = = = 9, Bei sauren bzw. alkalischen Aminosäuren wird der Wert ausgeschlossen, der im entgegengesetzten Milieu liegt, weil der IEP stets im selben Milieu liegt wie die A. Bedeutung des IEP: Der IEP spielt zum Beispiel bei der Trennung von Aminosäuren eine wichtige olle. Ein Gemisch mit einem bestimmten pwert wird in ein elektrisches Feld gebracht. Das der IEP bei jeder Aminosäure woanders liegt, treten A mit verschiedenen Ladungen auf. A mit gleichen Ladungen wandern zum selben Pol, Zwitterionen werden dabei nicht beeinflusst. Dieses Trennverfahren wird Elektrophorese genannt.

6 Einige Aminosäuren 1. eutrale Aminosäuren mit Kohlenwasserstoffrest : 2 2 Glycin (Gly) IEP = 6, Leucin (Leu) IEP = 6, Alanin (Ala) IEP = 6,1 Isoleucin (Ile) IEP = 6, Valin (Val) IEP = 6,0 2 2 Phenylalanin (Phe) IEP = 5,5 2. eutrale Aminosäuren mit,, Atomen im est: 2 2 ystein (ys) IEP = 5, Prolin (Pro) IEP = 6, Methionin (Met) IEP = 5,7 2 erin (er) IEP = 5,7 Threonin (Thr) IEP = 5, Tyrosin (Tyr) IEP = 5,6 Asparagin (Asn) IEP = 5,4 Glutamin (Gln) IEP = 5,7 Tryptophan (Trp) IEP = 5,9

7 3. aure Aminosäuren: Asparaginsäure (Asp) IEP = 2,9 2 Glutaminsäure (Glu) IEP = 3,2 4. Basische Aminosäuren: Arginin (Arg) IEP = 10,8 Lysin (Lys) IEP = 9,7 istidin (is) IEP = 7,6 achweise bei Aminosäuren 1. tickstoffnachweis: Um die Aminogruppe nachzuweisen, kocht man die A mit konzentriertem a auf. Färben die entstehenden Dämpfe ppapier blau, liegt einen Aminogruppe vor. Vereinfacht läuft die eaktion so ab: a Dabei färben die Ionen das Papier blau. 2. Xanthoproteinreaktion (xanthos = gelb): Bringt man halbkonzentrierte alpetersäure mit z.b. Tyrosin zusammen, tritt eine Verfärbung nach gelb ein. Gleiches gilt für alpetersäure mit Tryptophan. Dieser achweis ist jedoch nicht auf alle A anwendbar, istidin, Phenylalanin und Prolin reagieren z.b. nicht unter Gelbfärbung.

8 3. eaktion mit inhydrin: Die Aminosäure wird in ein wenig Wasser gelöst und mit einigen Tropfen einer Lösung von inhydrin in 2Propanol zum ieden gebracht. inhydrin weist ebenfalls nach, dass eine Aminogruppe vorhanden ist, Die eaktion läuft wie folgt ab: Verläuft der achweis positiv, verfärbt sich die Lösung bläulich bis violett. eaktionen mit Aminosäuren Versuch: Wasserlöslichkeit Eine patelspitze Tyrosin wird mit ein wenig Wasser aufgeschlämmt und mit alzsäure betropft bis sich die A gelöst hat. Danach wird tropfenweise atronlauge hinzugegeben. Beobachtung: Gibt man die atronlauge hinzu, bildet sich nach und nach ein iederschlag, der allerdings nach noch mehr Zugabe wieder verschwindet. Erklärung: Das Zwitterion ist schlecht wasserlöslich, weil die beiden ydrathüllen umgekehrt polarisiert sind, und somit keine einheitliche ydrathülle möglich ist: δ δ δ δ δ δ 3 δ δ δ

9 Wird die alzsäure hinzugegeben, geschieht folgendes: l 3 3 l 3 2 Jetzt kann sich eine einheitliche ydrathülle bilden die Aminosäure löst sich in Wasser. Wird die atronlauge hinzugegeben, wird anfangs der durch die alzsäure erzielte Effekt rückgängig gemacht: l 3 l 3 2 Liegen alle Moleküle in der Zwitterionenstruktur vor, muss das nächste Wasserstoffatom abgegeben werden: l 3 l 2 2 Auch in diesem Fall kann sich eine einheitliche ydrathülle bilden die Aminosäure löst sich in Wasser. Ein toff ist nur dann wasserlöslich, wenn eine einheitliche ydrathülle möglich ist. Bemerkung: at eine Aminosäure zwei arboxylgruppen, so hat die obere arboxylgruppe eine größere äurestärke. Das liegt an der positiven Ladung der Aminogruppe, die eine Elektronenwanderung bedingt:

10 Versuch: erstellung von atriumglutamat Eine patelspitze Glutaminsäure wird tropfenweise mit atronlauge versetzt: a a a Dinatriumglutamat Die klare Lösung wird anschließend im Porzellantiegel eingedampft. Versuch: xidation von ystein 5 ml ysteinlösung (1 %) werden im eagenzglas mit 1 ml Eisen(III) chloridlösung versetzt. Die Lösung wird nach der Entfärbung geschüttelt. Beobachtung: ach Versetzung mit Eisen(III)chlorid färbt sich die Lösung blau und entfärbt sich wieder. chüttelt man die Lösung. färbt sich sie sich erneut blau. Entfärbungsreaktion (in Lösung): Fe xidation: 2 est estest 2e eduktion: Fe 3 1e Fe 2 2 edox: 2 II 2Fe 3 2 I 2Fe 2 2 Fe 2 2

11 Erklärung der Blaufärbung: Die ysteinmoleküle und die Fe 3 Ionen gehen eine Komplexbindung mit Wasser ein. ystein ist ein zweizähniger Ligand, d.h. es kann an zwei tellen eine Komplexbindung eingehen. Die räumliche truktur des Komplexes sieht so aus (ktaederform): 3 2 Fe Komplexschreibweise: ( ) Fe ys Dieser Komplex, der blau gefärbt ist, ist nicht sonderlich stabil. Er wird durch die edoxreaktion (s.o.) zerstört. chüttelt man das eagenzglas, kommt auerstoff an das Fe 2 Ion, so dass eine weitere edoxreaktion abläuft: xidation: Fe 2 Fe 3 1e 2 eduktion: 1 2 2e 2 3 edox: Fe Fe 3 ach dieser eaktion kann sich wieder der Komplex ausbilden, der aber auch wieder zerstört wird.

12 Bildung von Dipeptiden Die Aminosäuren Alanin und Valin werden zum eagieren gebracht. Die eaktion bewirkt, dass sich unter Wasserabspaltung eine Bindung zwischen Alanin und Valin bildet, die sogenannte Peptidbindung: 2 Termimus Terminus 2 Peptidbindung: transkonfiguration 2 Die Peptidbindung ist eine ebene Bindung, was daran liegt, dass zwei mesomere trukturen auftreten: Deswegen ist die Bindung mit 137 pm in der Peptidbindung auch kürzer als normale Bindungen mit 147 pm. (p = piko) Dipeptide benennt man im Allgemeinen nach ihren Bestandteilen. Dabei Beginnt man mit einem (für das terminale Ende) und endet mit einem (für das terminale Ende). Für Alanin und Valin hieße das: Ala Val Da ohne Zusatzstoffe nicht festgelegt werden kann, welche Enden miteinander reagieren, kann auch folgendes Dipeptid entstehen: Val Ala Außerdem können noch die Fälle auftreten, in denen zwei gleiche Moleküle miteinander reagieren: Ala Ala und Val Val

13 Vorgänge bei der Dauerwelle oll eine Dauerwelle gemacht werden, müssen die Disulfidbrücken zwischen den aaren gespalten werden, damit die aare eine neue Form annehmen können. Zum palten dieser Disulfidbrücken wird Ammoniumthioglykat benutzt. Es wird wie folgt synthetisiert: 3 4 Die Disulfidbrücken werden nun mit Ammoniumthioglykat gespalten: achdem die Disulfidbrücken gespalten und die Frisur fertig gestellt ist, werden die Disulfidbrücken wiederhergestellt. Die Fixierung erfolgt mit Wasserstoffperoxid ( 2 2 ): II II I I II 2 2 I 2 2 2

14 ligopeptide ligopeptide sind Peptide, die aus bis zu 10 Aminosäuren zusammengesetzt sind. Ein Beispiel für ein ligopeptid ist Aspartam, das statt einer arboxylgruppe einen Ester beinhaltet und deshalb nicht den Dipeptiden zuzuordnen ist: Peptidbindung Ester Asp Phe 3 Ein weiteres Beispiel für ein ligopeptid ist Vasopressin: Termimus Termimus Gly Arg Pro ys Asp Glu Phr I I ys Tyr Wird Prolin (Pro) in einer equenz eingebaut, entsteht ein Knick in der rdnung, da Prolin keine 2 Gruppe besitzt. Das jede Peptidbindung unter Wasserabspaltung geschieht, ist die Peptidbindung selbst ohne Wasserstoffatom.

15 Peptidsynthesen Die Problemstellen der Peptidsynthesen sind der chutz der Amino und der arboxylgruppe sowie die Aktivierung der arboxylgruppe. Es muss dafür orge getragen werden, dass genau die beiden Gruppen miteinander reagieren, die auch miteinander reagieren sollen. 1.) Als chutzgruppe für die Aminogruppe wird unter anderem der toff tertbutyloxycarbonyl (Boc) verwendet: Die Verbindung mit der Aminosäure sieht dann wie folgt aus: Die chutzgruppe Boc lässt sich in saurer Lösung abspalten. 2.) Als chutzgruppe für die arboxylgruppe wird z.b. Benzylester (Bzl) verwendet: Die Verbindung mit der Aminosäure sieht dann wie folgt aus: 2 2 Die chutzgruppe Bzl lässt sich in alkalischer Lösung abspalten. 3.) Da die eaktion zwischen zwei Aminosäuren nicht ohne weiteres abläuft, muss ein weiterer toff, Dicyclohexylcarbodiimid (D), hinzugegeben werden:

16 Die eaktion von D mit den beiden Aminosäuren lautet dann: 2 A Boc Bzl Zusammenfassung der Gesamtreaktion (Aminosäuren: Gly und Ala): 1. chutzgruppe für die Aminogruppe des Glycins: Gly Boc Boc Gly 2. chutzgruppe für die arboxylgruppe des Alanins: Ala Bzl Ala Bzl 3. Aktivierung der arboxylgruppe des Glycins: D Boc Gly Ala Bzl Boc Gly Ala Bzl 4. Abspaltung der arboxylschutzgruppe: Boc Gly Ala Bzl Boc Gly Ala Bzl 5. Abspaltung der Aminoschutzgruppe: 3 Boc Gly Ala Gly Ala Boc Auch die ynthese von größeren Peptiden erfolgt prinzipiell nach dem gleichen chema. Man unterscheidet allerdings zwischen klassischen ynthesen in flüssiger Phase und Festphasensynthesen an einem polymeren Träger. Bei der klassischen ynthese werden sämtliche eaktionen in Lösung durchgeführt, die jeweiligen eaktionsprodukte isoliert und ggf. gereinigt. Dabei synthetisiert man in der egel zunächst einzelne Fragmente des Peptids und verknüpft diese dann zum fertigen Peptid. Eine solche konvergente trategie hat gegenüber einer linearen ynthese unter anderem den Vorteil einer größeren Gesamtausbeute. Die klassische ynthese kommt dort zum Einsatz, wo kleine Peptide in großen Mengen benötigt werden.

17 Bei den Festphasensynthese dagegen wird die erste 2 geschütze A minosäure des zu synthetisierenden Peptids über ihre arboxylgruppe kovalent an ein Polymer gebunden: Boc A 1 un wird die Aminoschutzgruppe entfernt: A 1 festes Polymer (Polysterol) Danach wird die nächste 2 geschützte Aminosäure angeknüpft: Boc A 2 A 1 Die wachsende Peptidkette bleibt also während der gesamten ynthese am Polymer gebunden, es erfolgt keine Isolierung und einigung der einzelnen Einzelstufen. Lediglich die verwendeten eagenzien und ü berschüssigen geschützten Aminosäuren werden durch intensives Waschen des Polymers nach jeder eaktion entfernt. Zum chluss wird dann das fertige Produkt abgespalten. Vorteile diese Methode sind vor allem die chnelligkeit und Automatisierbarkeit, achteile die relativ kleinen Mengen, die man mit dieser Methode erhält und die im Vergleich zur klassischen ynthese oft geringe einheit des Endproduktes. Für die schnelle ynthese kleiner Mengen ist die Festphasensynthese die Methode der Wahl. Bestimmung der Aequenz in Peptiden 1. Will man die Verhältnisformel der Aminosäuresequenz bestimmen, so genügt es das Peptid in saurer Lösung zu hydrolysieren: A A A... A A A Durch diese Fragmentierung erhält man dann zum Beispiel eine Verhältnisformel wie: ys1phe2 Ala3 Val 1

18 2. Bestimmung der terminalen Aminosäure durch den EdmanAbbau: Phenylisothiocyanat (PI) 2 A 2 A 3 A 4... A 2 A 3 A 4... l A 2 A 3 A 4... Beim EdmanAbbau lässt man das Peptid mit Phenylisothiocyanat (PI) reagieren. Dieses bindet sich an die freie Aminogruppe und spaltet sich bei der anschließenden Behandlung mit hlorwasserstoff in einem wasserfreien Lösungsmittel mit ihr zusammen vom est der Peptidkette ab. Alle anderen Bindungen des restlichen Peptids werden nicht angegriffen. Die Verbindung von PI und der A 1 wird durch vergleichende hromatographie identifiziert. 3. Bestimmung der terminalen Aminosäure durch das Enzym arboxypeptidase: A... A A PD 2 1 n A... A A PD 2 1 n

19 4. Fragmentierung durch spezifische Enzyme: Verschiedene Enzyme spalten verschiedene Peptidbindungen. Das Enzym Trypsin spaltet z.b. nur Peptidbindungen, deren Gruppen von Lysin oder Arganin stammen: 2 ys Arg Ala Lys Val Die Bruchstücke sind: Trypsin Trypsin ys Arg Ala Lys Weitere Beispiele für Proteasen sind hymotrypsin (hinter Phe, Trp, Tyr) und Pepsin (hinter Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu). Die equenzaufklärung erfolgt unter Verwendung verschiedener Enzyme: Die Peptidbruchstücke werden isoliert und wieder über Endgruppenbestimmung analysiert, so dass man durch passende Überlagerung der Fragmente die Aequenz erhält. Val hromatographie von Aminosäuren Auf der Dünnschichtchromatographieplatte wird mit einem Bleistift eine Gerade Linie im Abstand von 1 cm zur Grundkante gezogen. Diese Linie dient als tartlinie, auf der im Abstand von ca. 1,5 cm fünf Punkte markiert werden. Mit ilfe einer Pipette wird jeweils eine der vier Aminosäuren auf jeweils einen der fünf Punkte aufgetragen. Die amen der Aminosäuren werden unter die Punkte geschrieben. An fünfter telle wird das Gemisch aufgetragen. Die Flecken sollten einen Durchmesser von 35 mm haben. achdem die Aminosäuren getrocknet sind, wird die Platte in die hromatographiewanne gestellt, die vorher mit destilliertem Wasser gespült worden ist. In dieser Wanne befinden sich ca. 25 ml eines Fließmittels, das nbutanol, Eisessig und Wasser im Verhältnis 4:1:1 enthält. Wenn sich die Fließmittelfront ca. 2 cm unter dem oberen and befindet, wird die Platte entnommen und die Fließmittelfront deutlich durch Einritzen in die Kieselgelschicht markiert. un wird die Platte im laufenden Abzug mit inhydrin besprüht. Danach muss die Platte wieder trocknen. Um die hromatographie auszuwerten, müssen die blauvioletten ubstanzflecken auf einem Bogen Transparenzpapier markiert werden. Die Fließmittelfront und die tartlinie müssen ebenfalls übertragen werden. un werden die Abstände der ubstanzfleckmittelpunkte zur tartlinie gemessen und der F Wert gebildet werden.

20 Der F Wert ist wie folgt definiert: F Entfernung tartpunkt bis Fleckmittelpunkt = = Entfernung tartpunkt bis Fließmittelfront d As x d f Experimentell bestimmte F Werte einiger A: F (Ala) 0,246 0,231 0,266 0,262 F (Tyr) 0,492 0,51 0,51 0,492 F (Arg) 0,092 0,123 0,094 0,154 F (Phe) 0,538 0,538 0,546 0,51 F (ys) 0,385 0,369 0,375 0,4 F Werte sind für jede Aminosäure in bestimmten Laufmittel charakteristisch. Mit dem F Wert und der Platte werden jetzt die in dem Gemisch enthaltenen Aminosäuren bestimmt: In diesem Fall enthält das Gemisch die Aminosäuren A 13, aber nicht A 4.

21 trukturen bei Proteinen Primärstruktur: Die Primärstruktur beschreibt die equenz der Aminosäuren im Peptid. 2 A1 A2 A 3... ekundärstruktur. Die ekundärstruktur sagt aus, ob das Peptid in der α elix (maximale Anzahl von Brücken innerhalb der Kette) oder im βfaltblatt (kleiner este; maximale Anzahl von Brücken zwischen zwei Ketten) vorliegt. Auch ein sogenanntes Zufallknäuel ist möglich. Tertiärstruktur: Die Tertiärstruktur beschreibt die räumliche Anordnung (elix, Faltblatt, Zufallsknäuel) und die Bindungen (Disulfidbrücken, Ionenbindung, Brücken, VanderVaalsKräfte im polaren Teil) innerhalb eines Proteins. Quartärstruktur: In der Quartärstruktur bilden mehrere Proteinketten mit Zentralionen (Fe 2, Mg 3, ) ein Knäuel (globoläre = kugelförmige truktur) oder Firbrillen.