Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

Transkript

1 Aus der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte, Handchirurgie-Zentrum, der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. H.-U. Steinau Der Einfluß topisch applizierter Antiseptika auf die Mikrozirkulation der gesunden Haut intravitalmikroskopische Untersuchungen am Ohr der haarlosen Maus Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Marweh Sedigh Salakdeh aus München 2005

2 Inhaltsverzeichnis 2 Dekan: Referent: Koreferent: Prof. Dr. med. G. Muhr PD Dr. med. H.H. Homann PD Dr. med. M. Walz Tag der mündlichen Prüfung:

3 Inhaltsverzeichnis 3 INHALTSVERZEICHNIS 1. VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN EINLEITUNG Antiseptika Mikrozirkulation Zielsetzung und Fragestellung MATERIAL UND METHODEN Getestete Antiseptika Octenisept Lavasept Softasept Ethanol 70% Die Haarlose Maus Die Haarlose Maus als Versuchstier Das Ohr der haarlosen Maus Fluoreszenzfarbstoffe FITC-Dextran Rhodamin 6 G Mikroskopier- und Bildaufnahmeeinheit Versuchsablauf Genehmigung der Versuche Versuchsgruppen Versuchsvorbereitung Versuchsprotokoll Transmissionselektronenmikroskopie Mikrozirkulationsparameter Gefäßdurchmesser Erythrozytenfließgeschwindigkeit Funktionelle Kapillardichte Extravasation von FITC-Dextran Leukozyten-Endothelzell-Interaktion Bildauswertung Technischer Aufbau Software CapImage Messung der Parameter mit CapImage...35

4 Inhaltsverzeichnis Dokumentation Statistik Nullhypothese Statistische Auswertung ERGEBNISSE Transmissionselektronenmikroskopie Quantitative Analyse der Mikrozirkulation Gefäßdurchmesser der Venolen Gefäßdurchmesser der Arteriolen Erythrozytenfließgeschwindigkeit Funktionelle Kapillardichte Extravasation von FITC-Dextran Leukozyten-Endothelzell-Interaktion DISKUSSION Diskussion der Thematik Diskussion von Material und Methoden Das Ohrmodell der haarlosen Maus Inhalationsnarkose Intravitale Fluoreszenzmikroskopie Getestete Antiseptika Messmethoden und Mikrozirkulationsparameter Diskussion der Ergebnisse TEM Gefäßdurchmesser Erythrozytenfließgeschwindigkeit Funktionelle Kapillardichte Extravasation des Plasmamarkers Leukozyten-Endothelzell-Interaktion ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS DANKSAGUNG LEBENSLAUF...97

5 Abkürzungen 5 1. VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN Abb. Aqua dest. BG BGFA BM bzw. ca. Da d.h. EFG et al. FITC FKD g hr IFM kda kv LEI Lsg. MAK MAP max. mg Min./min ml mm MRSA MW n NaCl nm nu Abbildung Aqua destillata berufsgenossenschaftlich Berufsgenossenschaftliches Forschungsinstitut für Arbeitsmedizin Basalmembran beziehungsweise zirka Dalton das heißt Erythrozytenfließgeschwindigkeit et alteri (lateinisch) = und andere Fluoreszeinisothiozyanat funktionelle Kapilardichte Gramm hairless intravitale Fluoreszenzmikroskopie Kilo-Dalton Kilovolt Leukozyten-Endothelzell-Interaktion Lösung minimale alveoläre Konzentration mittlerer arterieller Druck maximal Milligramm Minuten Milliliter Millimeter Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus Mittelwert Anzahl Natriumchlorid Nanometer nude

6 Abkürzungen 6 PBS phosphate balanced salt solution PC Personal Computer PEG Polyethylenglykol PVP-Jod Polyvinylpyrrolidon-Jod Rh6G Rhodamin 6G ROI region of interest Sek. Sekunden SEM standard error of the mean s.o. siehe oben Tab. Tabelle TEM Transmissionselektronenmikroskop(ie) u. und v. a. vor allem vs. versus (lateinisch) = gegen z. B. zum Beispiel z. T. zum Teil µl Mikroliter µm Mikrometer

7 Einleitung 7 2. EINLEITUNG 2.1 Antiseptika Die Keimvernichtung mit Hilfe chemischer Substanzen zur Gewebedesinfektion, Prophylaxe und Therapie von Infektionen spielt im Bereich der konservativen und chirurgischen Medizin eine wichtige Rolle. In Bereichen wie z. B. Behandlung von Verbrennungswunden, chirurgische Wundreinigung, perioperative Infektionsprophylaxe und bei zahlreichen diagnostischen Untersuchungen gehören Hautdesinfektionsmittel zum Routinebedarf. Allein im Jahre 2002 wurden beispielsweise an den BG Kliniken Bergmannsheil Bochum über Liter Hautdesinfektionsmittellösungen verbraucht. Der Begriff Antisepsis (griechisch wörtlich gegen Fäulnis ) wurde vom englischen Militärarzt John Pringle Ende des 18. Jahrhunderts für fäulnisverhindernde Mittel geprägt. Jedoch erst in der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts verschafften die Mediziner Ignaz Semmelweis und Joseph Lister der Antisepsis ihre eigentliche Bedeutung für die heutige Medizin. Damals erkannte Semmelweis die Notwendigkeit der Händedesinfektion mit Chlorkalk vor einer Untersuchung zur Reduktion der Infektionsrate von hospitalisierten Kranken. Genauso trug Lister einige Jahre später mit seinem Karbolsäure-Verband zur Therapie bereits infizierter postoperativer Wunden zu einem steilen Abfall der damals hohen postoperativen Mortalität bei [79]. Seitdem sind Antiseptika in der Medizin unverzichtbar. Die weitere Entwicklung desinfizierender Substanzen lief über Sublimat und Chlorlösungen, Azofarbstoffen und Sulfonamiden bis zur Entdeckung des Penicillins und den nachfolgenden Antibiotika. Relativ jung und damit auch gegenwärtig v. a. im klinischen Gebrauch sind PVP-Jod und Biguanide. In der heutigen Zeit stehen nunmehr zahlreiche Desinfektionsmittel zur Verfügung, deren antimikrobielle Wirkung in zahlreichen Studien untersucht und belegt wurde. Neben der Bakterizidie muß auch der Wechselwirkung des Antiseptikums mit dem betroffenen Gewebe Beachtung geschenkt werden. Bisher durchgeführte Untersuchungen befassen sich überwiegend mit der Gewebeverträglichkeit von Desinfektionsmitteln hinsichtlich der Zytotoxizität [96,119]. Der Auswirkung von Antiseptika auf die lokale Gewebedurchblutung wurde bisher wenig Beachtung geschenkt. Studien zum Einfluß auf die Mikrozirkulation der Muskulatur wurden in jüngster Vergangenheit durchgeführt [102].

8 Einleitung 8 Antiseptika werden sowohl bei diagnostischen Untersuchungen, als auch bei der chirurgischen Wundreinigung in erster Linie auf die zum Teil noch intakte Haut topisch appliziert. Dabei liegt die Vermutung nahe, daß Sie v. a. Einfluß auf die Mikrozirkulation der Haut haben. Gegenwärtig liegen keine Untersuchungen zur Wechselwirkung von Antiseptika mit der kutanen Mikrozirkulation vor. 2.2 Mikrozirkulation Die Geschichte der Mikrozirkulation beginnt mit einer Entdeckung von Marcello Malpighi aus dem Jahre Bei seinen mikroskopischen Untersuchungen des Lungengewebes stieß Malpighi zufällig auf in der Art eines Haares aussehende Röhren (lat. = capillaris), als Verbindungen zwischen Arteriolen und Venolen, durch die das Blut fließt und sich somit ein Kreislauf ergibt [87]. Mit seiner Beobachtung bestätigte Malpighi die 1616 von Wiliam Harvey publizierte Theorie der Zirkulation des Blutes. Wagner beschrieb 1839 erstmals durch intravitalmikroskopische Untersuchungen gewonnene Eindrücke der Perfusion und Zell-Zell-Interaktion in leicht zugänglichen Geweben wie dem Mesenterium verschiedener Spezies [132]. Weitere intravitalmikroskopische Beobachtungen der Mikrozirkulation erfolgten mit Hilfe der Transillumination an dünnschichtigen Geweben wie z.b. der Schwimmhaut vom Frosch, am Kaulquappenschwanz und an Fledermausflügeln [22,95,142]. Seit der Einführung der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie durch Köhler im Jahre 1967 besteht auch die Möglichkeit der mikrozirkulatorischen Untersuchung solider Organe wie z.b. Leber, Gehirn und Lunge [14,59,68]. Der Fluoreszenzfarbstoff ermöglicht eine in vivo Darstellung bestimmter Zellen durch Kontrastierung und eröffnet somit die direkte Analyse von Mikrozirkulationsparametern [12,16,28,128]. Unter dem funktionellen Begriff der Mikrozirkulation werden die einspeisenden Arteriolen, die Kapillaren als Gewebeperfusionsfläche, die drainierenden Venolen und die Lymphgefäße zusammengefasst [49]. Ricker prägte im Jahre 1924 die Mikrozirkulation der Peripherie mit dem Begriff der Endstrombahn, deren Aufgabe die funktionelle Erhaltung des Gewebes ist [104]. Hier im Austauschersystem findet der weitaus überwiegende Teil des Stoffaustausches zwischen Blut und Interstitium statt. Die Mikrozirkulation ist für die Anlieferung von Nährstoffen zuständig und somit von großer Bedeutung für die Gewebephysiologie [29]. Eine inadäquate

9 Einleitung 9 Gewebeperfusion führt v. a. durch den Mangel an Nährstoffen zu pathologischen Situationen wie z. B. Wundheilungsstörungen und Gewebenekrosen. 2.3 Zielsetzung und Fragestellung Nachdem, neben zahlreichen Untersuchungen zum antimikrobiellen Wirkspektrum von Desinfektionsmitteln, auch bereits die Gewebeverträglichkeit hinsichtlich der Zytotoxizität untersucht wurde, ist es interessant die ebenfalls vermutete Wechselwirkung mit der Gewebedurchblutung näher zu untersuchen. Im medizinischen Alltag kommen Antiseptika insbesondere im Bereich der Wundbehandlung zum Einsatz. Für eine ungestörte Wundheilung ist eine intakte Mikrozirkulation genauso unabdingbar wie die Antisepsis. Das Erkennen pathophysiologischer Veränderungen setzt jedoch zunächst die Kenntnis der regelrechten Situation voraus. Auf den erhaltenen Daten basierend können dann zukünftige Untersuchungen zur Interaktion zwischen Antiseptikum und Wunddurchblutung erfolgen. Intaktes Gewebe heißt, daß die physiologische Schutzbarriere des Körpers, nämlich die Haut, unverletzt besteht. Sie stellt das mit dem Desinfektionsmittel in Kontakt kommende Gewebe dar. Aufgrund der chemischen Zusammensetzung der handelsüblichen Desinfektionsmittellösungen und der vom Hersteller angegebenen Einwirkzeiten sind wir von einer eher kurzfristigen Wechselwirkung zwischen Antiseptikum und Haut, und somit auch Mikrozirkulation, ausgegangen. Für unsere Untersuchungen ergab sich folgende Fragestellung: Welchen kurzfristigen Einfluß haben topisch applizierte Hautdesinfektionsmittel, die im täglichen Klinikgebrauch sind, auf die intakte kutane Mikrozirkulation?

10 Material und Methoden MATERIAL UND METHODEN 3.1 Getestete Antiseptika Octenisept Es handelt sich hierbei um ein farbloses, flüssiges Schleimhaut- und Wundantiseptikum. Zu den Anwendungsgebieten zählen: 1.die wiederholte, zeitlich begrenzte antiseptische Behandlung von Schleimhaut und angrenzender Haut vor diagnostischen und operativen Maßnahmen 2.Infektionsprophylaxe in der Mundhöhle 3.zeitlich begrenzte, unterstützende Therapie bei Pilzerkrankungen der Haut zwischen den Zehen (Fußpilz) 4.unterstützende antiseptische Wundbehandlung 5.MRSA-Ganzkörperwaschung Die Lösung besteht aus 0,1%igem Octenidindihydrochlorid und 2%igem Phenoxyethanol. Als weitere Bestandteile gibt der Hersteller 3- Cocosfettsäureamidopropyl-dimethylammonioacetat, Natrium-D-gluconat, Glycerol 85%, Natriumchlorid, gereinigtes Wasser und Natriumhydroxid an. Der ph-wert liegt bei 6,0 ± 0,5 und der Flammpunkt liegt bei über 99 C. Octenidindihydrochlorid ist ein Bispyridinamin aus der Substanzklasse der Bisbiguanide. Hierzu gehört beispielsweise auch das Chlorhexidingluconat. Diese Stoffe sind kationenaktive Lipide. Im Falle des Octenidins stellt das Pyridinamin den kationischen Teil der Verbindung dar [10]. Als kationenaktive Substanz wirkt Octenidin an der Zellmembran und führt somit zur Zerstörung der Zellfunktion. Das Phenoxyethanol als Derivat des Ethanols hat eine ergänzende, synergistische Wirkung. Die weiteren Bestandteile von Octenisept dienen zur ph-einstellung, Feuchthaltung des desinfizierten Areals und sorgen für eine gleichmäßige Verteilung auf der Schleimhaut bzw. Haut. Dieses Antiseptikum wirkt sowohl bakterizid als auch fungizid [41]. Sogar gegen Chlamydien und Mykoplasmen sowie Methicillin-resistenten Staphylokokken (MRSA) zeigt es eine hohe Wirksamkeit [34]. Auch hinsichtlich der Bekämpfung von Hefen, Protozoen und Viren ist Octenisept (Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt) geeignet.

11 Material und Methoden 11 Wegen der großen Breite im Wirkspektrum ist es häufig in Gebrauch. In den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil Bochum wurden beispielsweise 5488 Liter im Jahr 2002 verbraucht Lavasept Das lokale Antiseptikum Lavasept (Fresenius AG, Bad Homburg v.d.h.) ist als Rohstoff d.h. in Form von Konzentrat in Deutschland zugelassen. Für eine 0,1%ige oder 0,2%ige Anwendungskonzentration werden 1 ml bzw. 2 ml des Konzentrates in 1000ml Ringerlösung ohne Laktat verdünnt. Die Herstellung des Fertigarzneimittels geschieht in der Regel durch die Klinikapotheke. Das Konzentrat ist farb- und geruchlos und hat einen ph-wert von ca. 5,5. In 1 ml Lavasept-Konzentrat sind 200 mg Polyhexanid und 10 mg Polyethylenglykol (Macrogolum 4000) in wäßriger Lösung enthalten. Polyhexanid ist ein polymeres Biguanid aus der Gruppe der kationenaktiven Substanzen. Es handelt sich hierbei um den mikrobioziden Bestandteil des Antiseptikums. Aufgrund der starken kationischen Ladung kommt es zum engen Kontakt mit anionisch geladenen Bakterien. Dies führt zur Zerreißung der inneren Bakterienmembran und zur Denaturierung der Eiweißstrukturen [108]. Durch den Zusatz von Macrogol wird die Oberflächenspannung herabgesetzt und somit eine bessere Benetzbarkeit der Haut bzw. Wundfläche erreicht. Möglicherweise beeinflußt es ebenfalls durch hydrophobe und hydrophile Wechselwirkungen mit Zellmembranen die Bioverfügbarkeit, Penetration und Toxizität des antiseptischen Wirkstoffs [65]. Lavasept wirkt bakterizid und fungizid. Es ist sowohl gegen gram-positive als auch gegen gram-negative Bakterien wirksam. Auch gegenüber schwierigen Erregern wie Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenza und gegenüber dem methicillinresistentem (MRSA) und vancomycin-intermediärem Staphylococcus aureus (VISA) zeigt es eine gute Wirksamkeit [114]. Neben der adjuvanten antiseptischen Wundspülung und -abdeckung bei der chirurgischen Wundbehandlung zählen drohende, akute und chronische Knochenund Weichteilinfektionen z.b. bei Verbrennungswunden zum Indikationsbereich. Lavasept darf nur äußerlich am Patienten angewendet werden.

12 Material und Methoden Softasept Softasept (B.Braun Melsungen AG, Melsungen) ist eine ungefärbte alkoholische Hautdesinfektionslösung, welche zu 74% aus 100%igem Ethanol, zu 10% auch 2- Propanol und zu 16% aus gereinigtem Wasser besteht. Der ph-wert liegt bei 6,5 ± 0,5. Neben der bakteriziden, fungiziden und tuberkuloiden Wirksamkeit inaktiviert dieses Antiseptikum laut Hersteller auch lipophile Viren sowie Hepatitis-B-, Rota- und Polioviren. Zum Einsatzbereich von Softasept zählen die Hautdesinfektion vor operativen Eingriffen, bei Injektionen, Punktionen, Blutentnahmen und Impfungen. Ebenso dient es als Mittel zur Händedesinfektion %Ethanol Wie schon die Bezeichnung zeigt, handelt es sich hierbei um verdünntes Ethanol (Quadflieg GmbH, Gelsenkirchen). Die Verdünnung wurde mit Aqua dest. durch die Zentralapotheke des Bergmannsheils durchgeführt. Eines der ältesten Antiseptika ist aufgrund seiner Löslichkeitspotenz, seiner konservierenden und desinfizierenden Wirkung und aufgrund seines schnellen Wirkungseintritts gegenüber Bakterien (30 Sekunden) als Flächendesinfektionsmittel und als Basis vieler Hautdesinfektionsmittel (s.o.) häufig in Gebrauch. Nur bei einer Mischung mit 10% bis 30% Wasser können Alkohole wie Ethanol und Propanol ihre antiseptische Wirkung entfalten. Dank des Wassers kann der Alkohol die Zellwand durchdringen und z.b. in ein Bakterium eindringen, wo er Proteine denaturiert und somit das Bakterium zerstört. D.h. Alkohole wirken bakterizid (auch bei MRSA), aber auch fungizid und viruzid. Sie wirken jedoch nicht gegen bakterielle Sporen. Für die viruzide Wirkung werden bis zu 30 Minuten Einwirkzeit benötigt. Sie sind nur bedingt gegen nicht-lipoide Viren wirksam. Aufgrund des starken Brennens sollte der Einsatz von Alkoholen nach Möglichkeit bei der Behandlung von offenen Wunden und Schleimhäuten vermieden werden.

13 Material und Methoden Die Haarlose Maus Die Haarlose Maus als Versuchstier Es handelt sich um eine Maus, die bei homozygoter Ausprägung einen Defekt auf Chromosom 14 (hr/hr) besitzt. Sie wurde 1926 zufällig in einem Londoner Zoo entdeckt [19]. Bis zum 10. Lebenstag besitzt diese Maus ein normales Haarkleid, welches sie anschließend verliert. Die Haarfollikel bleiben zwar erhalten, sind jedoch überwiegend leer. Die haarlose Maus (SKH-1/hr) besitzt kein Fell und wird daher rein äußerlich leicht mit der Nacktmaus (nu/nu) verwechselt. Trotz der äußerlichen Ähnlichkeit gibt es keinen gemeinsamen genetischen Ursprung. Für die Versuche wurden 3-5 Wochen alte männliche Haarlose Mäuse mit einem Körpergewicht zwischen 18 g und 25 g (Charles River Deutschland GmbH, Sulzfeld) verwendet. Die Tiere wurden bei einem 12stündigem Tag- und Nachtrhythmus in maximal 5er-Gruppen in Polycarbonat-Käfigen (45 x 30 cm, Ebeco, Castrop-Rauxel) bei konstanter Raumtemperatur von 24 C und einer Luftfeuchtigkeit von 50% untergebracht. Sie erhielten Standardfutter (SSNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest) und Wasser ad libitum Das Ohr der haarlosen Maus Im Jahre 1980 etablierte Errikson ein Modell am Ohr der Haarlosen Maus (SKH-1/hr) als Methode zur in vivo Untersuchung der kutanen Mikrozirkulation [28]. Mit einer sowohl Länge als auch Breite von 13 mm ist das Ohr der Haarlosen Maus im Vergleich zum restlichen Körper sehr groß (6% der gesamten Körperoberfläche [36]) (Abb.1).

14 Material und Methoden 14 Abb. 1 Haarlose Maus im Alter von 4 Wochen. Man sieht deutlich das verhältnismäßig große Ohr im Vergleich zum restlichen Körper. Das Ohr ist insgesamt 300 µm dick und besteht aus zwei voll ausgebildeten Hautschichten, die von einer zentralen Knorpelschicht getrennt werden [28]. Beide Hautschichten sind mit jeweils µm dicker als die Knorpelschicht (50-70 µm). Das Epithel der Haut beinhaltet etwa 2-3 Zelllagen und weist ein hyperkeratotisches Stratum corneum auf. Die Anzahl der leeren Haarfollikel variiert entlang der gesamten Ohroberfläche. Die unter dem Stratum germinativum gelegene wellige Basalmembran ist relativ dünn und weist keine typischen Hautpapillen auf. In der subepidermalen Schicht befinden sich alle großen Blutgefäße und Nerven. Gelegentlich findet man in der Dermis auch vereinzelt Gruppen von Fettzellen, quergestreiften Muskelfasern und Kollagenfasern. Talgdrüsen sind selten unmittelbar neben den Haarfollikelzwiebeln zu erkennen [13]. Die Haut des Ohres der Haarlosen Maus ähnelt der menschlichen Haut [28] (Abb.2).

15 Material und Methoden 15 Abb. 2 Querschnitt durch das Ohr einer Haarlosen Maus. Die zwei vollständigen Hautschichten werden durch eine zentrale Knorpelschicht getrennt. (Paraffinschnitt 2 μm dick, HE-Färbung) Der Knorpel bringt das Ohr in eine nach dorsal leicht konvexe Form und wird zum Ohrrand allmählich dünner (bis 35 µm). Er wird durch Perforationen unterbrochen, die von Fettzellen ausgefüllt sind oder den Gefäßen als Zugang zur anderen Hautschicht dienen. Bei den Knorpelzellen handelt es sich um sogenannte Lipochondrozyten. Sie sind jeweils durch einen großen Lipidtropfen gekennzeichnet, welcher von einem dünnen Plasmasaum umgeben ist [13]. Die Verbindung zum Blutkreislauf wird durch 3-4 Hauptgefäßnervenbündel, die zusammen an der Basis in das Ohr gelangen, aufrechterhalten (Abb. 3). Ein Hauptgefäßnervenbündel besteht jeweils aus einer Arteriole, einer Venole und einem Nerv. Von diesen Hauptgefäßen 1.Ordnung zweigen sich Mikrogefäße bis zu präkapillären Arteriolen und postkapillären Venolen 4.Ordnung ab. Die Arteriolen 1. Ordnung haben einen Durchmesser von 50 bis 60 µm bis hin zu den Arteriolen 4.

16 Material und Methoden 16 Ordnung mit 10 bis 15 µm. Die Dicke der Venolen variiert von den großen Hauptvenolen mit µm bis hin zu den postkapillären Venolen mit einem Durchmesser von 15 bis 25 µm. Zwischen Arteriolen und Venolen 2. und 3. Ordnung findet man v.a. im peripheren Bereich des Ohres arcadenförmige Shuntgefäße mit langsamem Blutfluß. Die Mikrogefäße 4. Ordnung formen zusammen mit den Kapillaren ein subpapilläres Netzwerk im Korium. Die Kapillaren mit einem Durchmesser von 5 bis 7 µm umlaufen die leeren Haarfollikel kreisförmig in einem dreidimensionalen Netzwerk. Im mittleren Bereich des Ohres, in der Nähe des Knorpels, kommen auch parallel verlaufende Kapillaren vor, deren Muster an das Kapillarnetz im quergestreiften Skelettmuskel erinnert [13]. Abb. 3 Ausgebreitetes Ohr einer Haarlosen Maus mit den 3-4 Hauptgefäßnervenbündeln (1 Arteriole, 1 Venole und 1 begleitender Nerv) mit ihrem Ursprung an der Ohrbasis. (Gesamtvergrößerung 10 fach)

17 Material und Methoden Fluoreszenzfarbstoffe Bei der Fluoreszenz wird ein Fluoreszenzfarbstoff mit Licht angestrahlt. Dabei führt die Absorption der Lichtquanten zur Anregung von Elektronen (Exzitation). Wenn die Elektronen anschließend auf das ursprüngliche, energieärmere Niveau zurückfallen, geben sie die aufgenommene Lichtenergie in Form von Strahlung (Fluoreszenz) wieder frei (Emission). Der Vorgang der Fluoreszenz dauert nur solange an wie der fluoreszierende Stoff angestrahlt wird. Diese Eigenschaft macht man sich vor allem in der Epi-Illumination zu nutze. Fluoreszenzfarbstoffe ermöglichen durch Markierung bestimmter Zellarten oder Plasma mikrozirkulatorische in vivo Untersuchungen. Dabei wird die Bildqualität bei den in vivo Untersuchungen durch Kontrastierung angehoben FITC-Dextran Der Plasmamarker Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat (FITC), welcher an Dextran mit einem mittleren Molekulargewicht von 150 kda irreversibel gebunden ist (FITC- Dextran), wurde den Tieren vor den intravitalmikroskopischen Untersuchungen zur Visualisierung der Gefäße injiziert. Da FITC-Dextran wasserlöslich ist, nur sehr geringe Interaktionen mit organismusspezifischen Proteinen eingeht und gut toleriert wird, wird dieser Marker gerne für intravitalmikroskopische Untersuchungen verwendet [110]. Wir entschieden uns für ein Dextran mit einem relativ großen Molekulargewicht um eine möglichst lange intravasale Verweildauer zu erreichen. FITC-Dextran ermöglichte die Messung der mikrozirkulatorischen Parameter ausgenommen die Leukozyten-Endothelzell-Interaktion (LEI). Das Exzitationsspektrum von FITC-Dextran liegt im blauen Bereich mit einem Maximum bei der Wellenlänge λ=490 nm und das Emissionspektrum liegt im grünen Bereich mit einem Maximum bei λ=520 nm. Eine Injektionsmenge von 0,15 mg/kg KG FITC-Dextran wird als vermutlich nicht toxisch angegeben [116]. Um die erforderliche Konzentration zu erhalten wurde 1 mg der in Pulverform vorliegenden Substanz (Sigma Chemicals Comp., Deisenhofen) in 25 ml 0,9% NaCl-Lösung gelöst. Jeweils 250 µl Portionen aufgezogen in 1 ml Spritzen wurden vor Lichteinwirkung geschützt bei minus 20 C gelagert.

18 Material und Methoden Rhodamin 6 G Zur Kontrastanhebung der Leukozyten in der IFM wurde den Tieren der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 6 G (Rh6G) injiziert. Diese 1943 erstmals beschriebene Substanz führt bei intravasaler Gabe zur Anfärbung von Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten [53]. Rh6G akkumuliert in den zytoplasmatischen Organellen der weißen Blutkörperchen [9]. Rh 6 G wird durch Licht mit der Wellenlänge von λ = nm (grüner Bereich) angeregt und fluoresziert im roten Bereich mit einem Emissionsmaximum bei λ=555 nm. Die zur Anfärbung aller weißen Blutkörperchen benötigte Konzentration wird in der Literatur mit 0,3 mg/kg KG angegeben [9]. Zur Herstellung wurden 2 mg des in Pulverform vorliegenden Farbstoffs (MW: 479, Sigma Chemicals Comp., Deisenhofen) in 25 ml isotoner Kochsalzlösung gelöst. Die zubereitete Lösung wurde wiederum in ca. 250 µl Portionen, aufgezogen in 1ml Spritzen, vor Lichteinwirkung geschützt bei minus 20 C gelagert.

19 Material und Methoden Mikroskopier- und Bildaufnahmeeinheit Zur intravitalmikroskopischen Untersuchung des Mausohres diente ein modifiziertes Labormikroskop (Axiotech vario, Carl Zeiss, Göttingen). Als anregende Lichtquelle in der Epi-Illuminationstechnik diente eine stufenlos regelbare Quecksilber- Kurzbogendampflampe (HBO 103 W/2, Carl Zeiss, Göttingen). Für eine konstante Lichtproduktion mußte die Lampe bereits ca. 30 min vor Beginn der mikroskopischen Untersuchungen eingeschaltet werden. Im Mikroskop selbst waren ein normales Objektiv (4x/0.10, Achroplan, Carl Zeiss, Göttingen), mehrere Salzwasserimmersionsobjektive (10x0.30 W Ph1, 20x/0.50 W Ph2, 40x/0.75 W Ph2, Achroplan, Carl Zeiss, Göttingen), sowie der Ploemopack Illuminator mit einem Reflektorschieber vorhanden. Für die Fluoreszenz von FITC- Dextran und Rhodamin 6 G besaß der Reflektorschieber entsprechende Filter (I 09 / BP , FT 510, LP 520 und I 15 / BP 546, FT 580, LP 590), die die Exzitationsbereiche und Emissionsbereiche der beiden Fluoreszenzfarbstoffe abdeckten. Den Reflektorschieber mußten zum einen das Licht der Quecksilberlampe für die Exzitation des Fluoreszenzfarbstoffes im Gewebe und zum anderen das remittierende Fluoreszenzlicht vom untersuchten Gewebe passieren. Das Mikroskop war mit einem Fototubus ausgestattet, an den über einen Adapter (Mikro-Adapter 0,5x, 1/2-1/3 C-Mount/CZ-Schnittstelle, AVT Horn, Aalen) mit einer Vergrößerung von 0,5 eine hochauflösende und sehr lichtsensitive Schwarz-Weiß- CCD-Videokamera (AVT-BC 71, AVT-Horn, Aalen) angeschlossen war. Die mikroskopischen Bilder wurden über diese Kamera mit Hilfe eines S-VHS- Videorecorders (AG-7350, Panasonic, Deutschland) auf Videokassetten (S-VHS Pro SE-120, FUJI Magnetics GmbH, Kleve) gespeichert. Ein an den Videorecorder angeschlossener 12 Farbmonitor (PVM-1453 MD, HR Trinitron Color-Videomonitor, Sony, Köln) stellte die über die Kamera gewonnenen mikroskopischen Bilder während des Versuchs direkt online dar. Auf diese Weise war eine Beobachtung und Kontrolle der Videobandaufnahme fortlaufend gegeben (Abb. 4).

20 Material und Methoden 20 Abb. 4 Aufbau der Mikroskopier- und Bildaufnahmeeinheit Die untersuchten Gefäßareale wurden auf Videoband aufgezeichnet um die mikroskopischen Bilder offline zu einem späteren Zeitpunkt computerassistiert mit Hilfe des Programms CapImage (s. 3.6) auszuwerten. Hierdurch konnte die Mikroskopierzeit während des Versuchs so kurz wie möglich gehalten werden.

21 Material und Methoden Versuchsablauf Genehmigung der Versuche Gemäß den Richtlinien des deutschen Tierschutzgesetzes ( 8 Abs.1, BGB) erfolgten die Untersuchungen nach Erteilung der Genehmigung zur Durchführung von Tierversuchen der Bezirksregierung Arnsberg. Alle Versuche haben im Labor für Mikrozirkulationsforschung der Klinik für Plastische Chirurgie der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil, Universitätsklinik, Raum 144 Haus X, Bürkle-de-la-Camp-Platz 1 in Bochum, stattgefunden Versuchsgruppen Die Versuche wurden in fünf Versuchsgruppen gegliedert. Diese fünf Gruppen bestanden aus den zu untersuchenden Antiseptika (Octenisept, Lavasept, Softasept und 70%Ethanol) und einer Kontrollgruppe mit isotoner Kochsalzlösung. Jeder Gruppe wurden n = 6 Mäuse randomisiert zugeteilt. Die Berechnung der Tierzahl erfolgte unter Berücksichtigung der Erfahrungen aus ähnlichen Modellen. Die Lösungen wurden vor Beginn der Versuche von einer außen stehenden Person in fünf gleich aussehende Flaschen gefüllt und mit den Ziffern 1 bis 5 gekennzeichnet. Bis nach der Auswertung der Ergebnisse blieb die Zuteilung der Antiseptika und der Kontrolllösung auf die Versuchsgruppen verdeckt. Die Reihenfolge der Versuche erfolgte in randomisierter Verwendung der Flaschen 1 bis 5. Mit diesen Vorgaben war eine blind randomisierte Durchführung der Versuche gewährleistet.

22 Material und Methoden Versuchsvorbereitung Narkotisieren der Maus Zur Narkotisierung der Maus wurde die Methode der Inhalationsnarkose mit einem Gasgemisch aus Isofluran, Sauerstoff und Lachgas verwendet. Ein Narkoseapparat (Modell Sulla, Drägerwerk AG, Lübeck) diente als Narkosegasgemischquelle. Zunächst wurden 0,6 l/min O 2 (Messer Griesheim GmbH, Krefeld) und 1,0 l/min N 2 O (Messer Griesheim GmbH, Krefeld) gemischt mit 5 Vol% Isofluran (Forene, Abott GmbH, Wiesbaden) der Maus unter einer Plastikhaube solange zur Einatmung zur Verfügung gestellt bis sie eingeschlafen war. Anschließend wurde die Isofluran-Dosis auf ca. 1,25 Vol% reduziert (MAK: 1,2 Vol%). Das Gemisch aus 1,25 Vol% Isofluran mit ca. 0,6 l / min O 2 und ca. 1,0 l/min N 2 O wurde während der gesamten Versuchsdauer der Maus über ein Schlauchsystem zur Inhalation zur Verfügung gestellt. Die genaue Menge von O 2 und N 2 O wurde anhand eines Durchflußströmungsmeßgerätes (Dräger AG, Lübeck) und der Anteil von Isofluran anhand eines Anästhesiemittelverdunsters (Vapor, Dräger AG, Lübeck) reguliert. Zusätzlich wurde mittels eines Sauerstoffmeßgerätes (Oxydig, Dräger AG, Lübeck) der Sauerstoffgehalt in der Narkosemischung ununterbrochen kontrolliert. Um die Augen der Maus vor dem Austrocknen zu schützen wurden sie mit Bepanthen Augensalbe (= Dexpanthenol, Hoffmann - La Roche AG, Grenzach- Wyhlen) beträufelt.

23 Material und Methoden Auslagerung des Ohres Die narkotisierte Maus wurde auf eine speziell angefertigte Acrylglasplattform gelegt. Sie wurde so positioniert, daß eine stetige Zufuhr der Narkose über ein Schlauchsystem mit abschließender Röhre als Maske gewährleistet sein konnte. Die Plattform wurde mittels einer Wärmematte (Watlow Corp., St.Louis, MO, USA) kontinuierlich beheizt (Abb.5). Abb.5 Narkotisierte, auf einer beheizten Plexiglasplattform unter dem Operationsmikroskop liegende Maus mit ausgelagertem rechtem Ohr. Es erfolgte eine permanente Beatmung mit Narkosegas über eine Maske.

24 Material und Methoden 24 Um makroskopische und intravitalmikroskopische Beobachtungen sowie die topische Applikation der zu testenden Lösungen durchführen zu können, mußte das rechte Ohr der Maus auf einer Ebene der Acrylglasplattform flach ausgestreckt werden. Hierzu wurden an den beiden lateralen Ohrrändern und der Ohrspitze insgesamt drei Halteschlaufen (nicht resorbierbares chirurgisches Nahtmaterial, Polyamid 6 monofil, 10 / 0 Ethilon, Ethicon GmbH & Co. KG, Norderstedt) unter einem Operationsmikroskop (Leica M 651, Leica Microsysteme Vertrieb GmbH, Bensheim) vorsichtig mit mikrochirurgischen Instrumenten (Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) so angebracht, daß eine möglichst optimale flache Ausbreitung des Ohres möglich war. Drei weitere Fäden (nicht resorbierbares chirurgisches Nahtmaterial, Polypropylen monofil, 5 / 0 Prolene, Ethicon GmbH & Co. KG, Norderstedt) wurden jeweils in die zuvor angebrachten Halteschlaufen geführt und auf der Plexiglasplattform fest angeklebt, so daß das Ohr mit der Dorsalseite nach oben fixiert war und flach ausgebreitet werden konnte. Zusätzlich wurde isotone Natriumchlorid-Lösung (Delta-Pharma, Pfullingen) vorsichtig zwischen das ausgebreitete, fixierte Ohr und dem Untergrund gespritzt. Der Überstand wurde anschließend mittels eines Wattestäbchens wieder aufgesaugt. Auf diese Weise wurde eine plane Ausbreitung des Ohres auf dem Acrylglasuntergrund gewährleistet Injektion der Fluoreszenzfarbstoffe Die hergestellten Verdünnungen von FITC-Dextran und Rhodamin 6 G wurden im Verhältnis 1:1 gemischt und mittels einer Mikroliterspritze (0.33mm (29G) x 12.7mm, Micro-Fine U-40 Insulin, Beckton Dickinson, Irland) im Bolus mit einem Volumen von 75 µl unter dem Operationsmikroskop in eine der vier Schwanzvenen injiziert.

25 Material und Methoden Versuchsprotokoll Nach den Vorbereitungen zum Versuch (Narkotisierung der Maus, Auslagerung des Ohres, Injektion der Fluoreszenzmarker) wurde die Maus mit der beheizten Plexiglasunterlage unter dem Intravitalmikroskop positioniert. Sämtliche anschließend folgenden mikroskopischen Beobachtungen wurden auf Videoband festgehalten. Zunächst wurde der Gefäßverlauf des zu untersuchenden Ohres bei 4facher Vergrößerung (4x/0.10, Achroplan, Carl Zeiss, Göttingen) in einer Übersichtaufnahme festgehalten. Gleichzeitig wurde eine Übersichtskizze angefertigt, die Untersuchungsareale (ROIs) definiert und auf der Übersicht markiert. Es wurden stets 3-4 ROIs, auf der gesamten Ohrfläche verteilt, gewählt um die Heterogenität der Mikrozirkulation des Ohres besser zu erfassen (Abb. 6). Abb. 6 Skizze des Mausohres mit Kennzeichnung der ROIs. Jedes ROI beinhaltet Areale zur Messung der mikrozirkulatorischen Parameter Gefäßdurchmesser, EFG, FKD, Extravasation von FITC-Dextran und LEI.

26 Material und Methoden 26 Nun erfolgten nacheinander die mikroskopischen Untersuchungen der 3-4 ROIs zunächst in 10facher Vergrößerung (10x0.30 Salzwasserimmersionsobjektiv) als Teilschritt zur späteren Identifikation des jeweiligen ROIs. Auch in dieser Zwischenvergrößerung wurden wieder Skizzen angefertigt, um das spätere Wiederauffinden des jeweiligen ROIs und derselben Gefäße zu vereinfachen. Bei 20 facher Vergrößerung (20x0.50 Salzwasserimmersionsobjektiv) erfolgte dann die endgültige Erfassung der mikrozirkulatorischen Parameter und der LEI. Es wurden wiederum Skizzen in dieser Vergrößerung angefertigt, um nicht nur die wiederholte Identifikation des mikroskopierten Areals zu gewährleisten sondern auch um die spätere Auswertung zu erleichtern. Für jedes ROI wurden mit dem FITC-Dextran- Filterblock (blaues Aufflicht) ein Areal mit einer Venole, ein Areal mit einer Arteriole und ein Areal mit einem Ausschnitt eines Kapillarnetzes in unmittelbarer Umgebung der Arteriole und Venole mikroskopiert. Jede Beobachtung wurde Sekunden auf Videoband aufgenommen. Anschließend wurde mit dem Rhodamin-6G- Filterblock (grünes Aufflicht) die Venole nochmals für Sekunden aufgenommen, um das Verhalten der markierten Leukozyten erfassen zu können. Diese vorangehenden Untersuchungen dienten innerhalb des Versuchs als Ausgangspunkt, d.h. als Zeitpunkt 0 min im Flußdiagramm des Versuchs (Abb. 7). Nun folgte die Applikation der zu testenden Lösung aus einer der 5 braunen Flaschen auf das Ohr. Hierzu wurde die Lösung vorsichtig auf das Ohr geträufelt, so daß das Ohr komplett mit der Flüssigkeit benetzt war. Für die folgenden 10 min Einwirkzeit wurde darauf geachtet, daß das Ohr permanent mit der Lösung benetzt blieb. Nach der Einwirkzeit wurde die Lösung mittels eines chirurgischen Absorptionsschwämmchens (Art.Nr , Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) von der Ohroberfläche entfernt. Danach folgten die Beobachtungen der ROIs zum Zeitpunkt 10 min nach Applikation (s. Abb. 7) an den identischen Gefäßarealen und in gleicher Weise wie beim Ausgangspunkt (s. o.). Nach Abschluß der Aufnahmen zu diesem Untersuchungsabschnitt bestand eine Wartezeit von einer Stunde, in der die Körpertemperatur und Atmung der Maus regelmäßig kontrolliert wurde. Nach einer Stunde erfolgten dieselben Beobachtungen der identischen ROIs wie bei den zwei Untersuchungszeitpunkten zuvor (Zeitpunkt 60 min in Abb. 7). Wieder wurden alle mikroskopischen Bilder auf Videoband festgehalten. Nach Abschluß der Untersuchungen wurde die Plexiglasunterlage mit der Maus vom Intravitalmikroskop genommen und die Fixierung des untersuchten Ohres wurde

27 Material und Methoden 27 gelöst. Die Maus wurde in den Käfig zurückgesetzt und hatte wieder freien Zugang zu Wasser und Futter. Intravitalimikroskopie / Videoaufnahme -20 min 0 min Einwirkzeit 10 min 60 min Versuchsvorbereitung Applikation Entfernen Abb. 7 Flußdiagramm des Versuchs. Nach der Versuchsvorbereitung erfolgt die IFM-Untersuchung zu den Zeitpunkten 0 min (vor Applikation der Testlösung), 10 min (nach Entfernen der Testlösung) und 60 min. Nach Abschluß der Versuche erfolgte unter Narkose die Euthanisierung der Tiere mit einer intraperitonealen Überdosis Pentobarbital (Narcoren, Merial GmbH, Hallbergmoos).

28 Material und Methoden Transmissionselektronenmikroskopie Um eventuelle morphologisch fassbare, frühzeitige Veränderungen der kutanen Mikrozirkulation zu erfassen, wurde aus jeder der 5 Versuchsgruppen das behandelte Ohr eines Tieres für transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen aufgearbeitet. Es wurden Veränderungen im Bereich des Gefäßendothels bzw. im Bereich der kapillären Basalmembran und Entzündungszeichen (z. B. Ödem oder Makrophagenmigration) transmissionselektronenmikroskopisch untersucht. Nach Tötung der Tiere wurden die behandelten Ohren mit einer mikrochirurgischen Schere an der Ohrbasis vom Korpus abgetrennt und komplett (inklusive der Halteschlaufen) in 2,5 %iger Glutaraldehydlösung (ph 7,4) fixiert. Um Artefakte allein durch das Anbringen der Haltefäden auszuschließen wurden die unbehandelten Ohren (d.h. ohne Anbringen von Haltefäden) ebenfalls komplett fixiert und im TEM untersucht. Nach mindestens 12-stündiger Fixierung in Glutaraldehyd wurden die Präparate in 7-8 Stücke im Bereich der Gefäßnervenbündelverläufe zugeschnitten. Die weitere Aufarbeitung als Vorbereitung für die Einbettung wurde maschinell durchgeführt (3 x Auswaschen mit PBS (ph 7,4), Gewebefixation mit 1 % Osmiumtetroxid (Lsg. nach Dalton), erneutes Auswaschen mit PBS, Entwässerung in aufsteigender Alkoholreihe [30%, 50%, 70%, 2x90% und 2x100% Ethanol], weitere Entwässerung mit Propylenoxid und Ethanol im Verhältnis 1:1, gefolgt von reinem Propylenoxid und zuletzt Einsatz eines Propylenoxid/Durcupan-Gemisches). Die Präparatestücke wurden einzeln manuell in Durcupan eingebettet und bei 60 im Wärmeschrank für mindestens 12 Stunden ausgehärtet. Anschließend wurden Semidünnschnitte (500 nm dick) zur Orientierung angefertigt und in 1%-igem Toluidinblau gefärbt. Nach lichtmikroskopischer Auswahl geeigneter Untersuchungsareale wurden 70 nm dicke Ultradünnschnitte angefertigt und maschinell (Leica EM Stain, Wien) mit den Lösungen Ultrastain 1 und 2 (Leica, Wien) kontrastiert. Die Ultradünnschnitte wurden im Transmissionselektronenmikroskop (TEM 902, Carl Zeiss, Göttingen) mit 50 kv untersucht. Wesentliche ultrastrukturelle Befunde wurden im TEM auf Fotoplatten (Kodak SO-163, 83x102mm, Eastman Kodak Company, Rochester NewYork) aufgenommen und später im Fotolabor entwickelt.

29 Material und Methoden 29 Die transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen erfolgten mit Unterstützung des elektronenmikroskopischen Labors im Institut für Pathologie der Ruhr-Universität Bochum an den BG-Kliniken Bergmannsheil (Direktor: Prof. Dr. med. K.-M. Müller).

30 Material und Methoden Mikrozirkulationsparameter Durch die intravitalmikroskopischen Beobachtungen verschiedener Bereiche der Mikrozirkulation des Mäuseohres wurde die Erfassung folgender mikrohämodynamischer Standardparameter ermöglicht: Gefäßdurchmesser Bei den Untersuchungen wurden sowohl der Durchmesser von Arteriolen 3. Ordnung als auch von Venolen 3. Ordnung auf Videoband festgehalten. Hierbei wurde mit dem FITC-Dextran-Filter, d.h. bei blauem Aufflicht, jeweils eine Venole und eine Arteriole für jedes ROI mikroskopiert Erythrozytenfließgeschwindigkeit Dieser Parameter ist definiert als die Geschwindigkeit, mit der Erythrozyten das Gefäß durchfließen. Die EFG wurde in Venolen 3. Ordnung untersucht. Hierzu mußte ebenfalls aufgrund der Visualisierung des Blutplasmaflußes durch FITC-Dextran bei blauem Aufflicht mikroskopiert werden Funktionelle Kapillardichte Die durch FITC-Dextran visualisierten, unmittelbar in der Umgebung oben erwähnter Arteriolen und Venolen innerhalb der ROIs lokalisierten Kapillaren wurden mikroskopiert. Beim Mikroskopieren wurde über den Feintrieb leicht nach oben und nach unten fokussiert um die perfundierten Kapillaren aller Ebenen zu erfassen. Die funktionelle Kapillardichte ist definiert als die Länge aller perfundierten Kapillaren pro Untersuchungsfläche bzw. definiertem Beobachtungsfeld (cm/cm²) (Abb. 8). Sie gilt als Maß für die nutritive Gewebeperfusion [98].

31 Material und Methoden 31 Abb. 8 IFM-Bild (aus Filmsequenz) mit einer perfundierten Kapillare. Die schwarzen Lücken stellen die ungefärbten Erythrozyten dar (Pfeile), während das Plasma durch den Fluoreszenzmarker hervorgehoben wird Extravasation von FITC-Dextran Anhand der Extravasation des makromolekularen Plasmamarkers FITC-Dextran (150kDa) aus dem Gefäßlumen in das umgebende extravasale Gewebe wird der Integritätsverlust des Gefäßendothels ermittelt [42]. Unter physiologischen Bedingungen würde das intakte Gefäßendothel den Austritt dieses Makromoleküls in den Extravasalraum verhindern [116]. Zur Messung dienten die bei den drei Untersuchungszeitpunkten gewonnenen intravitalmikroskopischen Bilder der Venolen und Arteriolen. Es wurde die Fluoreszenzintensität intravasal und die Fluoreszenzintensität angrenzend extravasal zu jedem Untersuchungszeitpunkt gemessen und jeweils miteinander in Beziehung gesetzt (Lichtintensität extravasal dividiert durch die Lichtintensität intravasal = I e /I i ) (Abb. 9 und Abb. 10).

32 Material und Methoden 32 A V 1 V 2 Abb. 9 IFM-Bild (aus Filmsequenz) mit 2 Venolen (V 1 u. V 2 ) u. einer Arteriole (A) zum Zeitpunkt 0 min. FITC-Dextran bleibt im Gefäßlumen (Farbkontrast zw. intravasal u. extravasal). Dies ist ein Zeichen für die Gefäßendothelintegrität. A 2 A 1 V 1 V 2 Abb. 10 IFM-Bild (aus Filmsequenz) mit 2 Venolen (V 1 u. V 2 ) und 2 Arteriolen (A 1 u. A 2 ) nach 10 minütiger Einwirkzeit von 70% Ethanol. Eine Schädigung des Gefäßendothels wird durch die Extravasation des Plasmamarkers deutlich.

33 Material und Methoden Leukozyten-Endothelzell-Interaktion Mit der Untersuchung des Verhaltens von Leukozyten innerhalb des Gefäßes v.a. gegenüber dem Gefäßendothel erhält man einen weiteren Hinweis über das Ausmaß einer Gewebeirritation. Leukozyten werden bei der Untersuchung der LEI in 3 Gruppen eingeteilt, sogenannte nicht-adhärente, adhärente und rollende Leukozyten [21,20,35,116]. Die mittels Rhodamin 6G gefärbten Leukozyten werden mit dem Rhodamin 6 G - Filter bei grünem Aufflicht innerhalb der Venolen sichtbar (Abb. 11). Untersucht wurde die LEI in Venolen, da hier der Blutfluß langsamer ist als in Arteriolen und somit die markierten Zellen besser sichtbar sind. In den Untersuchungen wurde mit Hilfe des Verfahrens des einfachen Zellzählens die Präsenz der adhärenten und rollenden Leukozyten in Venolen bei den einzelnen Meßzeitpunkten untersucht. Abb. 11 IFM-Bild (aus Filmsequenz) einer Venole mit Einmündung einer kleineren Venole von rechts bei grünem Aufflicht (Rhodamin-Fraktion). Die markierten Leukozyten (weiße Punkte) sind deutlich sichtbar.

34 Material und Methoden Bildauswertung Technischer Aufbau Zur Analyse des mit der IFM gewonnenen Bildmaterials diente CapImage, ein computerunterstütztes multifunktionales Videobildanalysesystem für die Auswertung dynamischer gefäßmikroskopischer Befunde in der Mikrozirkulationsforschung [63]. Es besteht aus einem IBM-kompatiblen PC mit einer Ip-8/AT Bildverarbeitungskarte (Matrox Electronic Systems GmbH, Unterhaching bei München), einem Videorekorder als Videoquelle, einem Monitor zur Anzeige der Videobilder und der Software CapImage (Dr.H.Zeintl, Heidelberg). Die Videobilddigitalisierung erfolgte in Echtzeit (d.h. 25 Vollbilder pro Sekunde bzw. 50 Halbbilder pro Sekunde). Für die Auswertung der Untersuchungen diente ein S-VHS Videorekorder (AG-7350, Panasonic Deutschland GmbH, Hamburg). Er war über eine RS-232-Schnittstelle mit dem PC verbunden, so daß seine Ansteuerung über den PC erfolgen konnte Software CapImage Diese Software besitzt verschiedene Bildanalysefunktionen. Hierzu zählen u.a. die Blutzellgeschwindigkeitsmessung, die Leukozytenadhäsion und Zellzählung. Sowohl morphometrische Messungen beispielsweise von Durchmesser, Länge, Dichte und Torquierungsindex von Kapillaren als auch videodensitometrische Analysen (z.b. bei Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen) können durchgeführt werden. Die Korrektur von Bewegungsartefakten geschieht automatisch in Echtzeit bezogen auf das jeweilige Meßfenster. Obwohl die automatische Bewegungskorrektur aktiviert ist, ist eine Verschiebung von Meßlinien oder des Meßfensters jederzeit möglich. Die Meßwerte werden automatisch in Tabellen im ASCII-Format gespeichert. Während einer Messung wird immer die entsprechende Meßwerttabelle angezeigt. Vor dem Gebrauch unten aufgeführter Bildanalysefunktionen mußte im CapImage - Programm zunächst der Vergrößerungsmaßstab definiert werden. Hierzu wurde eine Neubauerzählkammer als Mikrometer-Eichmeßstab unter Versuchsbedingungen

35 Material und Methoden 35 videomikroskopisch aufgezeichnet. Mit Hilfe der aufgenommenen Standbilder werden dem Rechner genaue Maße unter Beachtung der zusätzlichen Manipulation der Maße durch die Videobilddatenverarbeitung zur Verfügung gestellt. Anhand dieser Informationen berechnet das Programm die letztendliche Vergrößerung der zur Auswertung genutzten Videobilder Messung der Parameter mit CapImage - Blutgefäßdurchmesser : Die Plasmakontrastierung mit FITC-Dextran haben wir uns zur Bestimmung des Gefäßdurchmessers zu Nutze gemacht. Durch manuelle Markierung der Grenze zwischen hellem Plasma und dunkler Gefäßwand an beiden Seiten des Gefäßes, senkrecht zum Gefäßverlauf, konnte eine Strecke als Durchmesser in µm berechnet werden. Auf diese Weise wurden drei repräsentative Meßwerte pro Gefäß ermittelt, aus denen ein Mittelwert berechnet werden konnte. Die Messung erfolgte am bewegten Bild, da hierbei der Kontrast zwischen Plasma und Gefäßwand deutlicher war. Damit zu den unterschiedlichen Meßzeitpunkten exakt dieselbe Meßstelle wieder gefunden werden konnte, wurde diese auf der angefertigten Skizze des ROI markiert. - Erythrozytenfließgeschwindigkeit : Zur Auswertung der Erythrozytenfließgeschwindigkeit wurde die Line-Shift- Diagramm-Methode verwendet. Die Fließgeschwindigkeit des Blutes zeigt eine paraboloide Verteilung, d.h. der zentrale Gefäßstrom weist eine höhere Fließgeschwindigkeit auf als endothelnahe Regionen. Um diese Fehlerquelle zu vermeiden wird eine gerade oder dem Gefäßverlauf entsprechend gekrümmte Linie in der Mitte des Blutgefäßes in Flussrichtung gezeichnet. Danach werden Bildsequenzen mit einer Dauer von 5 Sekunden ausgewertet. Während der Messung werden für jedes Halbbild die Grauwertedaten entlang der Meßlinie gelesen und in einem Bildspeicher im Hintergrund als vertikale Linien nebeneinander geschrieben. Nach Ablauf der Meßzeit wird automatisch der Bildspeicher mit den aneinandergereihten Meßlinien angezeigt. Ein Erythrozyt, der sich während der Meßsequenz entlang der Meßlinie fortbewegt, stellt eine Plasmalücke dar. Die Bewegung dieser Plamalücke erscheint im Diagramm der nebeneinander

36 Material und Methoden 36 gezeichneten Grauwertlinien als dunkle, schräg verlaufende Linie. Der Grund hierfür ist, dass die dunkle Plasmalücke auf der Meßlinie von Halbbild zu Halbbild je nach Flussrichtung jeweils etwas nach unten bzw. nach oben wandert. Daher auch der Name Line-Shift-Diagramm. Nun wird durch Anklicken dieser schrägen Linien im Line-Shift-Diagramm automatisch deren Steigung ermittelt und daraus die Geschwindigkeit berechnet. Es wurden gut erkennbare Meßlinien bestimmt, aus denen der Mittelwert der Erythrozytenfließgeschwindigkeit pro Gefäß errechnet wurde. - Densitometrie (Fluoreszenzintensität) : Mit Hilfe dieser Bildanalysefunktion wurde das Verteilungsverhalten des intraluminal anflutenden fluoreszierenden Plasmamarkers in den Extravasalraum untersucht (Extravasation von FITC-Dextran). Hierzu wurde in einem Standbild ein Meßfenster intravasal und ein Meßfenster extravasal positioniert. Capimage ermittelte dann die optische Dichte der Bildpunkte, die dem mittleren Grauwert in dem jeweiligen Meßfenster entspricht. Das Ergebnis wurde als Absolutwert angegeben. Anschließend wurde der Fluoreszenz-Intensitäts-Quotient (I e /I i ) bestimmt. Der Meßwert des extravasalen Fensters (Lichtintensität extravasal = I e ) wurde durch den intravasal gemessenen Wert (Lichtintensität intravasal = I i ) dividiert, so dass man einen Wert möglichst unter 1 erhielt. Ein Wert = 1 bedeutet, daß die optische Dichte der Bildpunkte beider Meßfenster identisch ist. D.h. eine komplett gleichmäßige Verteilung des Plasmamarkers sowohl im Intravasal- als auch im Extravasalraum hat stattgefunden. Ein Wert über 1 würde bedeuten, daß im Extravasalraum eine größere Lichtintensität herrscht. Demzufolge wäre dann bereits eine größere Konzentration des fluoreszierenden Plasmamarkers extravasal als intravasal. - Kapillardichte : Pro ROI wurde ein Beobachtungsfeld mit Kapillaren gemessen, so daß pro Maus 3-4 Areale zur Bestimmung der Kapillardichte bei 20facher Vergrößerung untersucht wurden. In einem definierten Fenster im Beobachtungsfeld wurden die perfundierten Kapillaren nachgezeichnet. CapImage summierte die Einzelstrecken auf und projizierte dabei das dreidimensionale Netzwerk auf eine Ebene. Die Gesamtlänge der nachgezeichneten Kapillaren wurde zum Schluss, abhängig von der Vergrößerung, zur Fläche, d.h. zum definierten Beobachtungsfeld (hier: 0,169451

37 Material und Methoden 37 mm²), in Beziehung gesetzt. Die funktionelle Kapillardichte wurde mit der Einheit cm/cm² angegeben. - Cell Counting: Bei den Untersuchungen des Leukozytenverhaltens wurde die manuelle Methode des Zählens von Zellen genutzt. Zur Ermittlung der Anzahl rollender Leukozyten (Roller) wurde innerhalb einer Zählzeit von 25 Sekunden jeder mit Rhodamin 6G markierte Leukozyt gezählt, der eine zuvor in das Blutgefäß gezeichnete horizontale Linie, dem Gefäßdurchmesser entsprechend, rollend (d.h. am Endothel im Randstrom mit deutlich geringerer Geschwindigkeit als der zentrale Blutfluß fließend) passierte. Die Summe der gezählten Zellen pro Zeiteinheit wurde in n/min angegeben. Zur Erfassung der Anzahl am Gefäßendothel adhärenter Leukozyten (Sticker) wurde zunächst eine Strecke von 100 µm Gefäßwand markiert. Die Summe der am Endothel auf der markierten Gefäßstrecke ständig haftenden Leukozyten während eines Untersuchungszeitraums von 25 Sekunden wurde zu jedem der drei Meßzeitpunkte ermittelt. Die Literatur bietet leider keine einheitliche Definition über adhärierende Leukozyten. Die Aussagen reichen von Entlangrollen [6], über kurzem Kontakt [7] bis zu Adhärieren von mehr als 60 Sekunden [52].