Grundlagen der rekombinanten. DNA-Technologie

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1 Grundpraktikum Grundlagen der rekombinanten DNA-Technologie Bitte für das Praktikum mitbringen: Laborkittel, Taschenrechner und Schutzbrille

2 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 2 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis...2 Grundlagen der rekombinanten DNA-Technologie Tag 1: Präparation von Plasmid-DNA und Herstellung kompetenter E. coli Bakterien,Spaltung der Vektor DNA, Ligation und Transformation Materialien Hintergrund Herstellung kompetenter E. coli Bakterien Durchführung Herstellung kompetenter E. coli Präparation der Plasmid DNA für die Klonierung Versuchsdurchführung Plasmidpräparation Restriktionsspaltung der Plasmid-DNA Versuchsdurchführung der Plasmid Restriktionsspaltungen Ligation Durchführung der Ligasereaktion Transformation von Escherichia coli KS272 mit der ligierten DNA Tag 2: Animpfen von Positiven Klonen, Überprüfung der Restriktionsspaltung vom Vortag, Bestimmung der Transformationseffizienz und UV-Mutagenese eines amp-gens Materialien Selektion von positiven Klonen Bestimmung der Transformationseffizienz Überprüfung der Restriktionsspaltung mittels Agarose-Gelelektrophorese UV-Mutagenese eines amp-gens Tag 3: Reinigung und Nachweis des Bla-PhoA-His Materialien Versuchsdurchführung Anfertigen eines Protokolls...31

3 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Layout Gliederung des Protokolls Abbildungen und Tabellen...34

4 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 4 Grundlagen der rekombinanten DNA-Technologie Konstruktion und Reinigung einer Variante der alkalischen Phosphatase PhoA aus Escherichia coli Grundlegende, immer wiederkehrende Methoden der Molekularbiologie sind die molekulare Klonierung, die Überproduktion und Reinigung von Proteinen sowie der Nachweis von Enzymaktivitäten. Ein häufiger Aspekt ist dabei auch die Fusion von DNA-Regionen, die für verschiedene Proteine oder Proteinfragmente kodieren. Einige dieser Techniken werden in der folgenden Versuchsreihe vorgestellt. Durch Klonierung soll ein Fusionsprotein (Bla-PhoA- His 6 ) der β-laktamase (Bla) und der alkalischen Phosphatase (PhoA) aus Escherichia coli konstruiert und dieses Protein anschließend in Escherichia coli überproduziert werden. Das Protein wird dann chromatographisch gereinigt und der Erfolg der Reinigung mit Hilfe einfacher enzymatischer Aktivitätstests überprüft. Die einzelnen Schritte der Klonierung sind in der Abb. 4 gezeigt. 0.1 Tag 1: Präparation von Plasmid-DNA und Herstellung kompetenter E. coli Bakterien,Spaltung der Vektor DNA, Ligation und Transformation Materialien Materialien für die Plasmidpräparation Puffer P1 (50 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA ph 8.0, 100 µg/ml RNAse A) Puffer P2 (200 mm NaOH, 1 % (w/v) SDS) Puffer P3 (2.55 M Kaliumacetat, ph 4.8) Chloroform Ethanol 96 %ig (p.a.) Ethanol 70%ig (p.a.) TE-Puffer mit RNAse A (10 mm Tris-HCl, 0.5 mm EDTA, ph 8.0, 100 µg/ml DNAse-freier RNAseA ) 7.5 M Ammoniumacetat Steriles Wasser Restriktionsenzyme PstI und HindIII mit Puffer (von der Firma mitgeliefert) 2 Eppendorf-Reaktionsgefäße

5 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 5 Eppendorf-Reaktionsgefäßständer Gilson-Pipetten Sterile Pipettenspitzen Inkubationsblock Eisbad Mikroliterzentrifuge Stopuhr Vortex Kulturen der Escherichia coli-stämme DH5α/pGPPhoA und DH5α/pGPBla C [Der Escherichia coli-stamm DH5α hat den folgenden Genotyp: F ; enda1, hsdr1 (rk-; mk-), supe44, thi1, reca1, gyra96(nal R ), rela1, (argf-laczya) U169, φ80dlacz M15)] Materialien für die kompetenten Bakterien FSB-Puffer 100 mm KCl 45 mm MnCl2 x 2 H2O 10 mm CaCl2 x 2 H20 3 mm Hexamincobalt(III)chlorid 10 mm Kaliumacetat ph 7,5 10 % (v/v) Glycerin dyt-medium 20 g/l Casein 5 g/l Hefeextrakt 20 mm NaCl 5 mm KCl dyt-amp-agar 10 g Hefeextrakt 16 g Trypton 5 g NaCl 16 g Agar ad 1l H 2 O Dimethylsulfoxid p.a. (DMSO) sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen E. coli KS272 Zellen Materialien für die Restriktionsspaltung Ethanol 96 %ig (p.a.)

6 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 6 Ethanol 70%ig (p.a.) 7.5 M Ammoniumacetat Steriles Wasser Restriktionsenzyme PstI und HindIII mit Puffer (von der Firma mitgeliefert) 2 Eppendorf-Reaktionsgefäße Eppendorf-Reaktionsgefäßständer Gilson-Pipetten Sterile Pipettenspitzen Inkubationsblock Eisbad Mikroliterzentrifuge Stopuhr Vortex Materialien für die Ligation T4-DNA-Ligase (1 u/µl) 10-fach konzentrierter T4-DNA-Ligasepuffer (400 mm Tris-HCl, 100 mm MgCl 2, 100 mm DTT, 5 mm ATP, ph 25 C) 1 1 %iges Agarosegel (20 x 20 cm) in TAE-Puffer (40 mm Tris-acetat, 1 mm EDTA, ph 7,4 [bei 25 C]) mit 76 Geltaschen in zwei Reihen 6 x DNA-Auftragspuffer (0.25 % Bromphenolblau, 0.25 % Xylencyanol, 50 mm EDTA und 30 % Glycerin) eingefrorene, kompetente Zellen (CaCl 2 ) des Stammes KS272 dyt-medium dyt CamXP -Platten (25 µg/ml Chloramphenicol, 70 µg/ml X-Phosphat) Sterile Eppendorf-Reaktionsgefäße Eppendorf-Reaktionsgefäßständer Gilson-Pipetten Sterile Pipettenspitzen Sterile 1 ml-glaspipetten Inkubationsblock; Eisbad Der Stamm KS272 hat den Genotyp: F -, lac-x74, gale, galk, rpsl, phoa (PvuII) Hintergrund Herstellung kompetenter E. coli Bakterien Zentraler Punkt jedes Klonierungsexperiments ist die Einführung von rekombinanter Plasmid- DNA in Bakterienzellen durch den Vorgang der Transformation. In der Gentechnik versteht man unter einer Transformation die Übertragung von freier, löslicher DNA auf ein Empfänger-Bakterium. E. coli besitzt keine natürliche Transformationskompetenz und muß durch chemische oder physikalische Methoden künstlich kompetent gemacht werden.

7 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 7 Die in diesem Versuch verwendete chemische Methode nach Hanahan ist ein Standardverfahren, bei dem osmotisch stabilisierte Suspensionen von E. coli K12 Stämmen bei 4 C mit Calciumchlorid-Lösung behandelt werden. Nach einem Hitzeschock bei 42 C wird die Plasmid-DNA in die Zelle aufgenommen und eine Transformationseffizienz von Transformanten/µg DNA erreicht. Es wird vermutet, dass die Salze die Zellwandstruktur lockern und zusätzlich die DNA als schwerlösliches Salz auf der Zelloberfläche ausfällen, um die direkte Aufnahme der Plasmide zu erleichtern Durchführung Herstellung kompetenter E. coli Alle Lösungen und Materialien auf 4 C vorkühlen und wenn nicht anders angegeben, immer auf Eis arbeiten! 50 ml dyt (in einem 1l Kloben mit Schikane) werden mit 100 µl einer Übernachtkultur E. coli KS272 beimpft. Die Kultur bei 37 C und 250 rpm wachsen lassen bis eine OD556 nm von 0,44 0,55 erreicht ist (normalerweise nach 1,5 2 h). Schüttelkolben 10 min auf Eis abkühlen und anschließend die Kultur in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen überführen. Die Zellen 12 min bei rpm und 4 C sedimentieren. Den Überstand sofort vorsichtig dekantieren und das Sediment mit 14 ml FSBPuffer resuspendieren. Die Zellsuspension anschließend 15 min auf Eis inkubieren. Die Zellen 10 min bei rpm und 4 C sedimentieren. Den Überstand sofort vorsichtig dekantieren und das Sediment mit 3,36 ml FSBPuffer resuspendieren. Die Zellsuspension 5 min auf Eis inkubieren, anschließend 117,6 μl DMSO in die Mitte des Zentrifugenröhrchens pipettieren und sofort vorsichtig schwenken. Wiederum 5 min auf Eis inkubieren, danach 117,6 μl DMSO in die Mitte des Zentrifugenröhrchens geben und vorsichtig schwenken. Sofort à 210 μl aliquotieren und bei 80 C bis zum Gebrauch lagern.

8 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Präparation der Plasmid DNA für die Klonierung Hintergrund Zunächst sollen die Gene, die für die β-laktamase (bla) und für die Alkalische Phosphatase (phoa) kodieren, miteinander fusioniert werden. Dazu werden zunächst die bereits vorhandenen Plasmide pgpbla C (bla) und pgpphoa (phoa), die diese Gene tragen (siehe Abb. 4), aus Bakterienzellen isoliert. Anschließend wird das DNA-Fragment, welches das phoa-gen trägt, mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen aus dem Plasmid pgpphoa geschnitten und in das, mit den gleichen Enzymen gespaltene, Plasmid pgpbla C einligiert Versuchsdurchführung Plasmidpräparation Mini-Präparation von Plasmid-DNA durch alkalische Lyse (für Praktikumsbedürfnisse speziell modifiziert) Plasmide sind extrachromosomale, zirkuläre, doppelsträngige und eigenständig replizierende DNA-Elemente, die der Wirtszelle in der Regel einen evolutionären Vorteil (z.b. Antibiotikaresistenz) verschaffen. Aufgrund dieser Eigenschaften dienen Plasmide auch als wichtige Hilfsmittel der DNA in vitro Rekombination ("rekombinante DNA-Technologie"). Zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen stehen verschiedene Verfahren zur Auswahl. Grundsätzlich werden die Zellen zunächst geöffnet (Zerstörung von Zellwand und Membranen) und anschließend die Plasmid-DNA von anderen Zellbestandteilen, insbesondere Proteinen, RNA und chromosomaler DNA separiert. Ein häufig verwendetes, da besonders bequemes Verfahren ist die alkalische Lyse: 1. Zwei Kulturen des Stammes DH5α, die die Plasmide pgpphoa bzw. pgpbla C enthalten, wurden bereits vom Betreuer vor Beginn des Praktikums angezogen und jeweils 1 ml Aliquots in 1.5 ml Eppendorfreaktionsgefäß abgefüllt. Die Ansätze werden 1 min in der Mikroliterzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig mit einer Gilsonpipette abgenommen und verworfen (Nicht in den Ausguß geben, sondern in autoklavierbaren Abfallgefäßen sammeln.) 2. Zum Zellpellet werden jetzt 100 µl P1-Puffer gegeben und die Zellen durch vortexen vollständig resuspendiert. 3. Nun werden 200 µl P2-Puffer zugegeben (Handschuhe tragen!) und nach Schütteln 5 min (nicht länger, da sonst auch die DNA angegriffen wird!) bei Raumtemperatur

9 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 9 inkubiert. Während dieser Inkubationsphase lysieren die Zellen und die Lösung wird klar und viskos. Die folgenden Schritte 4 und 6 müssen unter dem Abzug durchgeführt werden. Zudem sind Handschuhe sowie eine Schutzbrille zu tragen! 4. Nun gibt man 200 µl Chloroform zu, mischt kräftig, fügt 150 µl P3-Puffer hinzu und mischt nochmals kräftig. In diesem Schritt werden Proteine, Zellwandtrümmer, der größte Teil der chromosomalen DNA und auch das Detergenz SDS ausgefällt. Gleichzeitig wird die Lösung neutralisiert. 5. Die Lösung wird nun 5 Minuten in der Mikroliterzentrifuge zentrifugiert. Nach der Zentrifugation sollte eine kompakte Interphase zwischen der unteren Chloroformphase und der oberen, wässrigen Phase sichtbar sein. Sie besteht aus den präzipitierten Komponenten. Die obere Phase enthält die Plasmid-DNA. 6. Die plasmidhaltige, wässrige Oberphase wird mit einer 1000 µl-gilson-pipette (sterile Spitze) vorsichtig abgenommen und in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Die (untere) Chloroformphase wird anschließend in einen dafür bereitgestellten Sammelbehälter überführt und das Eppendorfgefäß in den dafür vorgesehenen Behälter für Festabfall entsorgt. 7. Zu der wässrigen Phase werden nun 800 µl Ethanol (96%ig, p.a.) pipettiert, der Ansatz gut geschüttelt und 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. In dieser Phase wird die DNA gefällt. 8. Nun wird 5 Minuten in der Mikroliterzentrifuge zentrifugiert, um die DNA zu sedimentieren. 9. Der Überstand wird mit einer 1000 µl-gilson-pipette vorsichtig (nicht das DNA-Pellet berühren oder mit abziehen!) abgezogen und auf das Pellet 400 µl 70%iges Ethanol (p.a.) gegeben. Nun wird nochmals 5 Minuten zentrifugiert. 10. Der Überstand wird wieder mit einer Gilsonpipette möglichst vollständig abgezogen. (Eventuelle Reste des Überstands mit einer 200 µl Gilsonpipette entfernen). Die das Pellet enthaltenden Eppendorfgefäße werden zum Trocknen mit geöffnetem Deckel in den auf 37 C temperierten Inkubationsblock gestellt.

10 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Ist das DNA-Pellet trocken (es dürfen keine Flüssigkeitströpfchen mehr sichtbar sein!), werden 15 µl TE-Puffer mit RNAse A auf das Pellet pipettiert um die Plasmid-DNA zu lösen Restriktionsspaltung der Plasmid-DNA Hintergrund der Vektorspaltung Die am ersten Versuchstag präparierten Plasmide sollen mit den Restriktionsendonukleasen PstI und HindIII gespalten werden. Beide Enzyme erkennen und schneiden spezifische, palindromische Nukleotidsequenzen doppelsträngiger DNA (siehe Abb. 1); die Spaltstellen auf beiden DNA-Strängen liegen außerhalb der Symmetrieachse der Erkennungsregion (Restriktionsenzyme der Klasse 2). Durch die resultierenden, versetzten Brüche entstehen kurze, überhängende Einzelstrang-Enden. HindIII PstI 5 A A G C T T 3 5 C T G C A G 3 3 T T C G A A 5 3 G A C G T C 5 Abb. 1: Erkennungssequenzen und Spaltstellen der Restriktionsendonukleasen PstI und HindIII. Zur Verdeutlichung ist eines der entstehenden DNA-Enden nach Spaltung durch fett gedruckte Buchstaben hervorgehoben. Die Spaltung des Plasmides pgpbla C (siehe Abb. 4, Stufe 1) mit PstI und HindIII liefert ein lineares Vektorfragment (ca Basenpaare) sowie ein sehr kurzes DNA-Fragment, das im Plasmid zwischen den beiden Spaltstellen liegt. Jeweils eines der Enden beider Fragmente ist ein HindIII-spezifischer bzw. ein PstI-spezifischer Überhang. In dem Plasmid pgpphoa wird das Cbla-phoA-His 6 -Insert von den Spaltstellen für HindIII und PstI flankiert (Abb. 4, Stufe 1). Durch Spaltung mit beiden Enzymen erhält man somit ein Vektorfragment (ca Basenpaare) und das Cbla-phoA-His 6 -Fragment (ca Basenpaare), welches später in den Vektor pgpbla C kloniert werden soll. Auch hier sind die Enden beider Fragmente HindIII- bzw. PstI-spezifische Überhänge.

11 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Versuchsdurchführung der Plasmid Restriktionsspaltungen Zur Spaltung werden die Plasmide mit folgenden Komponenten in einem Eppendorfgefäß gemischt: 10 µl Plasmid-DNA 5 µl roter Puffer (R) 2 µl PstI (10 Units/µl) 2 µl HindIII (10 Units/µl) 31 µl Steriles Wasser Zuerst wird das Wasser in ein frisches Eppendorfgefäß pipettiert, dann der Puffer und schließlich die Plasmid-DNA hinzugefügt. Es ist darauf zu achten, daß sich das gesamte Reaktionsgemisch in der Spitze des Eppendorfgefäßes befindet. Ist dies nicht der Fall, wird die Flüssigkeit 30 Sekunden in der Mikroliterzentrifuge herunterzentrifugiert. Die Enzyme werden von den Betreuern zugegeben! Diese Ansätze werden dann zur Durchführung der Spaltreaktion bei 37 C für (mindestens) 1 Stunde im Heizblock inkubiert (die Spaltaktivität beider Enzyme ist bei dieser Temperatur optimal). Inaktivierung der Restriktionsendonukleasen und Fällung der DNA Im Anschluß an die Spaltreaktion und insbesondere vor der weiteren Verwendung der DNA zur Ligation (siehe Tag 13) müssen die Restriktionsendonukleasen inaktiviert werden. Danach wird die DNA-Lösung durch eine Fällung mit Ethanol konzentriert. 1. Die Enzyme HindIII und PstI können durch einfache Hitzebehandlung inaktiviert werden. Dazu werden die Spaltansätze für 10 Minuten bei 80 C auf dem Inkubationsblock gehalten. Nach diese Inkubation werden die Eppendorfgefäße zum Abkühlen kurz auf Eis gestellt. 2. Zu den abgekühlten Reaktionen werden nacheinander 5 µl 7.5 M Ammoniumacetat und 250 µl 96%iges Ethanol (p.a.) gegeben und die Lösungen gut gemischt. Es wird nun 15 Minuten auf Eis inkubiert. In diesem Schritt wird die DNA gefällt.

12 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Zur Sedimentierung der DNA wird der Ansatz dann für 5 Minuten in einer Mikroliterzentrifuge (eventuell bei 4 C) bei maximaler Geschwindigkeit ( Upm) zentrifugiert. 4. Der Überstand wird vorsichtig mit einer Gilsonpipette entfernt. Auf das DNA-Pellet werden 400 µl 70%igen Ethanols (p.a.) gegeben, um Salzreste zu lösen. Nun wird nochmals 5 Minuten zentrifugiert. 5. Der Überstand wird wiederum gründlich entfernt und das Eppendorfgefäß mit geöffnetem Deckel zur Trocknung der DNA bei 37 C auf den Inkubationsblock gestellt. 6. Das trockene DNA-Pellet wird in 15 µl sterilem Wasser gelöst Ligation Das im ersten Versuchsteil aus dem Plasmid pgpphoa geschnittene, das phoa-gen tragende Fragment soll nun in das linearisierte Plasmid pgpbla C inseriert werden. Das Zusammenfügen beider Fragmente und ihre kovalente Verknüpfung wird in einer Ligase- Reaktion erreicht. Zur Identifizierung richtiger Plasmide (erfolgreiche Insertion des CblaphoA-His 6 -Fragmentes in das Plasmid pgpbla C) werden anschließend Escherichia coli- Zellen mit den Ligationsprodukten transformiert und solche Zellen, die ein Plasmid aufgenommen und vermehrt haben, mit Chloramphenicol selektiert (das Plasmid vermittelt Resistenz gegen das Antibiotikum!). Selektierte Klone werden auf Aktivität der Alkalischen Phosphatase geprüft. Das im ersten Versuchsteil aus dem Plasmid pgpphoa geschnittene HindIII/PstI-Fragment trägt die (im Plasmid pgpbla C fehlende) 3 -terminalen Region des bla-genes, fusioniert mit dem phoa-gen und der Sequenz des His 6 -Tags (siehe Abb. 4). Dieses Fragment soll nun in das mit HindIII und PstI linearisierte Plasmid pgpbla C inseriert werden. Dadurch wird das bla-gen vervollständigt und ein Fusionsgen geschaffen, das für das gesamte Fusionsprotein Bla-PhoA-His 6 kodiert. Zur Ligation werden beide Spaltansätze miteinander vermischt und in Gegenwart des Enzyms T4-DNA-Ligase und ATP (die Ligationsreaktion ist ATP-abhängig) inkubiert. Während dieser Inkubation kommt es zur Aneinanderlagerung kohäsiver, überhängender Enden (PstI-PstI bzw. HindIII-HindIII) und zur kovalenten Verknüpfung der DNA-Enden durch die T4-DNA-Ligase. In der resultierenden Mischung verschiedenster Ligationsprodukte sind unter anderem die vier in der Abb. 4 (Stufe 2) gezeigten Plasmide zu erwarten: die Varianten A und C repräsentieren die wiederhergestellten, ursprünglich eingesetzten Plasmide pgpphoa und pgpbla C, die Varianten B und D dagegen zwei neue Konstrukte, in denen die Vektorfragmente mit dem Insertfragment des jeweils anderen Plasmides kombiniert sind. Die Wahrscheinlichkeit der Entstehung der Varianten A und D ist jedoch relativ gering, da das sehr kurze, aus dem Plasmid pgpbla C stammende Insertfragment durch die im Anschluß an die Restriktionsfällung durchgeführte Ethanolfällung (siehe Tag 11) ausverdünnt wurde (kleine DNA-Fragment werden durch Ethanol mit deutlich geringerer Effizienz gefällt als große DNA-Fragmente).

13 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Durchführung der Ligasereaktion Zur Durchführung der Ligationsreaktion wird wie folgt vorgegangen 1. Zunächst werden 3 µl des HindIII/PstI-gespaltenen Plasmides pgpbla C und 5 µl des HindIII/PstI-gespaltenen Plasmides pgpphoa in einem frischen Eppendorfgefäß zusammenpipettiert. Es ist darauf zu achten, daß sich die gesamte Flüssigkeit in der Spitze des Reaktionsgefäßes befindet. 2. In den Ansatz werden nun (in dieser Reihenfolge) 1 µl des 10 x T4-DNA-Ligasepuffers (immer auf Eis halten!) und 1 µl der T4-DNA-Ligase gegeben (wird von den Betreuern zugegeben). Auch hier wird nochmals sichergestellt, daß sich der gesamte Reaktionsansatz in der Gefäßspitze befindet. Eventuell wird der kurz zentrifugiert. 3. Der Ansatz wird nun für 1 Stunde bei 37 C auf dem Inkubationblock inkubiert Transformation von Escherichia coli KS272 mit der ligierten DNA Die Aufnahme freier, löslicher DNA durch ein Bakterium wird als Transformation, der Zustand der Zellen, die dazu in der Lage sind, als Kompetenz bezeichnet. Kompetenz kann durch verschiedene Verfahren, z. B. durch CaCl 2 -Behandlung der Zellen, künstlich erreicht werden (zum Prinzip der Plasmid-Transformation von Escherichia coli siehe Abb. 34). Zur Transformation des unter Punkt A erstellten Ligationsansatzes wird wie folgt vorgegangen: 1. Bei 70 C gelagerte, durch CaCl 2 -Behandlung kompetente Zellen des Stammes KS272 werden auf Eis aufgetaut. Der Prozeß sollte nicht durch Erwärmen beschleunigt werden, da die Zellen temperaturempfindlich sind. 2. Der Ligationsansatz wird vollständig zu den aufgetauten Zellen pipettiert. Dabei werden die Zellen nur kurz vom Eis genommen und das Eppendorfgefäß nur am oberen Rand gehalten, um die in der Spitze befindlichen Zellen nicht zu erwärmen. Die DNA-Lösung wird schnell hinzupipettiert und das Eppendorfgefäß sofort wieder auf Eis gesetzt. Auf keinen Fall kräftig mischen!

14 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Die Zellen werden nun 15 Minuten auf Eis stehen gelassen. In dieser Zeit assoziiert die DNA an die Bakterienoberfläche und wird langsam aufgenommen. Die Zellen sollten in dieser Phase daher nicht geschüttelt oder bewegt werden. 4. Der Ansatz wird nun für 3 Minuten bei 42 C inkubiert (Inkubationsblock) und im Anschluß sofort 800 µl dyt-medium zugesetzt (steril arbeiten!). 5. Anschließend wird der Ansatz für weitere 60 Minuten bei 37 C inkubiert. In dieser Phase kann sich das Plasmid in der Zelle durch Replikation etablieren. 6. Schließlich werden 150 µl des Ansatzes auf dyt-platten mit Chloramphenicol und X- Phosphat (dyt Cam XP,) gegeben und mit einer sterilen 1 ml-glaspipette gleichmäßig auf der Plattenoberfläche verteilt. 7. Die Platten werden über Nacht bei 37 C inkubiert. 0.2 Tag 2: Animpfen von Positiven Klonen, Überprüfung der Restriktionsspaltung vom Vortag, Bestimmung der Transformationseffizienz und UV-Mutagenese eines amp-gens Materialien Materialien zum Animpfen von positiven Klonen Transformationsplatten vom Vortag dyt-medium Pipettenspitzen Cm25 Stammlösung (25 mg/ml) Materialien zur Bestimmung der Transformationseffizienz Kompetente E. coli KS272 Zellen (vom Vortag) Plasmid pbluescript II SK(-) dyt-medium 10 g Hefeextrakt 16 g Trypton 5 g NaCl ad 1l H 2 O 100 mg/ml Ampicillin dyt Agarplatten

15 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum g/l Hefeextrakt 16 g/l Trypton 5 g/l NaCl dyt-amp-agarplatten 10 g/l Hefeextrakt 16 g/l Trypton 5 g/l NaCl Nach dem Autoklavieren 50 μg/ml Ampicillin dyt-cm-agarplatten 10 g/l Hefeextrakt 16 g/l Trypton 5 g/l NaCl Nach dem Autoklavieren 25 μg/ml Chloramphenicol zugeben dyt-cm-x-phosphat Platten 10 g/l Hefeextrakt 16 g/l Trypton 5 g/l NaCl Nach dem Autoklavieren 25 μg/ml Chloramphenicol und 70 µg/ml X-Phosphat zugeben 100 mm IPTG-Lösung 4 %(w/v) X-Gal (5-Brom-4-chlor-3- indolyl-β-d-galactopyranosid) in DMF (Dimethylformamid) Materialien für die UV-Mutagenese Plasmid-DNA pbluescript II SK(-) (25 ng/μl) Kompetente E. coli DH5α Zellen SOC-Medium LB-Medium LB-Agarplatten LB-Amp-Platten UV-Lichtquelle Selektion von positiven Klonen Prinizip der Selektion Die Selektion der Escherichia coli-klone, die das richtige Plasmid pgpblaphoa enthalten, wird auf Festmedium (dyt = double Yeast, tryptophane, ein Komplexmedium) mit Chloramphenicol und einem Substrat der Alkalischen Phosphatase X-Phosphat (5-Brom4- chlor-3-indolyl-phosphat-na 2 -Salz) durchgeführt. Diesem Selektionsverfahren liegen folgende Überlegungen zugrunde:

16 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 16 (1) Selektion auf Chloramphenicolresistenz : Die Ausgangsplasmide pgpphoa und pgpbla C vermitteln unterschiedliche Antibiotikaresistenzen (Kanamycin- (km) bzw. Chloramphenicol- (cat) resistenz). Bei Selektion auf Chloramphenicol werden daher nur Zellen zu Kolonien auswachsen, die Varianten des Ausgangsplasmides pgpbla C aufgenommen haben (z.b. A und B in Abb. 4). Zellen, die Varianten des Ausgangsplasmide pgpphoa aufgenommen haben (z.b. C und D in Abb. 4) besitzen nun zwar eine Kanamycinresistenz, verbleiben jedoch Chloramphenicol-sensitiv. (2) Selektion auf Umsatz von X-Phosphat : X-Phosphat wird von der Alkalischen Phosphatase in einer enzymatischen Spaltreaktion zu einem blauen Farbstoff umgesetzt. Die Reaktion ist in Abb. 2 gezeigt. O O P O O Cl H N Br Alkalische Phosphatase + OH - HO Cl H N Br + O O P O O 5- Brom- 4- chlor-3- indolyl-phosphat 5-Brom- 4-chlor-3-indoxyl Phosphat (X-Phosphat) Abb. 2: Spaltung von X-Phosphat durch Alkalische Phosphatase Das freigesetzte Indolderivat wird dann durch Luftsauerstoff zu einem wasserunlöslichen blauen Indigofarbstoff oxidiert. Mit Hilfe dieses Substrates ist es möglich, unter den Chloramphenicol-resistenten Klonen diejenigen zu identifizieren, die das Plasmid pgpblaphoa (Variante B in Übersichtsdarstellung 1) tragen. Solche Zellen produzieren das Enzym Alkalische Phosphatase und sind daher in der Lage, X-Phosphat zu spalten. Die resultierenden Kolonien geben sich durch eine Blaufärbung zu erkennen. Zellen mit einem Plasmid ohne das phoa-insert (z.b. Variante A in Übersichtsdarstellung 1) bleiben farblos. Eine wichtige Voraussetzung für diese Selektion ist jedoch, daß der zur Selektion eingesetzte Escherichia coli-stamm kein intaktes phoa-gen auf dem Chromosom besitzt. In dem Stamm KS272 ist das phoa-gen deletiert ( phoa), der Stamm wäre somit ohne Aufnahme eines Plasmides, welches ein intaktes phoa-gen trägt, nicht in der Lage, X- Phosphat umzusetzen.

17 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 17 Durchführung Jede Gruppe impft eine blaue Klolonien in jeweils 50 ml dyt cm25 Medium an, die Kolben werden über Nacht bei 37 C und 150 u/min geschüttelt Bestimmung der Transformationseffizienz In diesem Teil soll die Transformationseffizienz der kompetenten E. coli Bakterien vom Vortag bestimmt werden. Die Transformationseffizienz ist definiert als die Anzahl der Transformanten/µg DNA. Durchführung: Die kompetenten E. coli Zellen werden in Eis aufgetaut. 10 ng des Phagemids pbluescript II SK(-) werden auf den Boden eines eisgekühlten Greinerröhrchens vorgelegt. In einem weiteren Greinerröhrchen werden 10 µl steriles H2Obidest. vorgelegt (Negativkontrolle). Jeweils 200 μl der Bakteriensuspension zugeben und durch vorsichtiges Schwenken des Röhrchens mischen. Die Suspension 15 min auf Eis inkubieren. Den Transformationsansatz 60 sec im Wasserbad bei 42 C inkubieren. sofort 790 μl dyt-medium zugeben und die Zellen 1 h bei 37 C und 200 rpm kultivieren. Anschließend folgende Ansätze in einem Eppendorfgefäß mischen: I. 200 µl transformierte Zellen II. 20 µl transformierte Zellen 40 µl IPTG 180 µl dyt-medium 40 µl X-Gal 40 µl IPTG 40 µl X-Gal III. 2 µl transformierte Zellen IV. 200 µl Negativkontrolle 198 µl dyt-medium 40 µl IPTG 40 µl IPTG 40 µl X-Gal 40 µl X-Gal IPTG und X-Gal sollten erst kurz vor dem Ausplattieren hinzugegeben werden und zwar erst IPTG dann X-Gal, da DMF schädlich für die Zellen ist. Jeweils 140 µl der Ansätze auf dyt-amp-platten ausplattieren. Die Platten über Nacht bei 37 C inkubieren. Auswertung: Kolonien auf den Nährbodenplatten auszählen. Berechnung der Transformationseffizienz. Sie ist definiert als die Anzahl an Transformanten pro µg DNA.

18 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Überprüfung der Restriktionsspaltung mittels Agarose-Gelelektrophorese Die Vollständigkeit einer Restriktionsspaltung sollte immer eigentlich vor der weiteren Verwendung des Ansatzes zur Ligation, in diesem Falle aus Zeitgründen jedoch an dieser Stelle - durch Auftrennung der DNA-Fragmente mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüft werden. Aufgrund des unterschiedlichen Laufverhaltens verschiedener DNA-Spezies im elektrischen Feld können lineare DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe und zirkuläre DNA-Spezies (ungespaltene Plasmide) differenziert werden. 1. In einem Eppendorfgefäß werden 3 µl 6 x DNA-Auftragspuffer und 3 µl des gefällten Spaltansatzes vom ersten Versuchstag (HindIII/PstI-gespaltenes Plasmid pgpbla C bzw. pgpphoa) gemischt. In einem weiteren Eppendorfgefäß werden 3 µl 6 x DNA- Auftragspuffer und der Rest des ungespaltenen Plasmides vom ersten Versuchstag (pgpbla C bzw. pgpphoa) gemischt. Der Auftragspuffer enthält neben den Farbstoffen Bromphenolblau (dunkelblau) und Xylencyanol FF (türkisblau) auch Glycerin (wahlweise Sucrose). Der Puffer dient drei Zwecken: (1) Die Dichte der Proben wird erhöht, so daß sie leichter in die Geltaschen einsinken, (2) Die Farbigkeit der Proben erleichtert das Beladen der Geltaschen; (3) Mit Hilfe der Farbstoffe kann die Laufweite der DNA im Agarosegel abgeschätzt werden. Auf dem hier verwendeten 1 %igen Agarosegel wandert Bromphenolblau mit der Front doppelsträngiger DNA einer Länge von ca. 300 Basenpaaren, Xylencyanol FF mit der einer Länge von ca Basenpaaren. 2. Die Ansätze werden vollständig in die Tasche des vorbereiteten, in einem Puffertank liegenden Agarosegels pipettiert. Das Agarosegel, welches bereits vom Betreuer vorbereitet wurde, enthält 1 % Agarose in TAE-Puffer (40 mm Tris-acetat, 1 mm EDTA, ph 7,4 [bei 25 C], 0.5 µg/ml Ethidiumbromid; Achtung: Ethidiumbromid ist carcinogen! Seine Handhabung erfordert daher entsprechende Schutzkleidung (Kittel, Handschuhe) und Vorsicht.). Als Elektrophoresepuffer wird ebenfalls TAE-Puffer verwendet. 3. In eine weitere Tasche des Gels wird zusätzlich ein DNA-Standard aufgetragen. Dieser Standard enthält DNA-Fragmente bekannter Größe, die später zur Identifizierung und Größenbestimmung der DNA-Fragmente der zu untersuchenden Proben benötigt werden. 4. Die Elektrophorese wird bei einer Spannung von 100 Volt durchgeführt bis die dunkelblaue Bromphenolfront sich im unteren Drittel des Gels befindet. Die nun folgenden Schritte werden vom Betreuer durchgeführt: 5. Die im Gel enthaltenen Ethidiumbromid-Moleküle (siehe Punkt 2) lagern sich in DNA ein (interkalieren) und können durch ultraviolette Strahlung zur Fluoreszenz angeregt werden,

19 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 19 so daß die DNA sichtbar wird. Zur Analyse unter UV-Licht wird das Agarosegel aus dem Puffertank gehoben und auf einen UV-Transilluminator gelegt. 6. Die DNA wird durch Bestrahlung mit UV-Licht (302 nm Wellenlänge) sichtbar gemacht. Achtung: UV-Strahlung ist schädlich - insbesondere für die Augen. Es ist eine Sicherheitsmaske oder zumindest eine UV-abschirmende Brille zu tragen und die Zeit, die man sich exponiert, ist so gering wie möglich zu halten. 7. Das auf dem Gel sichtbare Bandenmuster wird festgehalten (Foto oder digitalisierende Videokamera) UV-Mutagenese eines amp-gens Im Gegensatz zur gerichteten Mutagenese, die eine gezielte Veränderung einer klonierten DNA-Sequenz ermöglicht, werden bei der Zufallsmutagenese ganze Organismen durch chemische oder physikalische Agenzien unspezifisch mutiert und die Auswirkungen der Mutationen phänotypisch oder über eine geänderte biologische Aktivität nachgewiesen. UV-Licht ist ein wirksames mutagenes Agens. In Nukleinsäuren führt die UVBestrahlung zu einer intramolekularen Quervernetzungsreaktion, die in einer Dimerisierung von benachbarten, auf einem Phosphodiesterstrang liegenden, Thymidinnukleotiden resultiert. In einem Photoadukt sind die beiden heterozyklischen Basen über einen Cyclobutanring kovalent miteinander verbunden. Der biologische Effekt von Thyimidindimeren ergibt sich durch eine Inhibition der Transkription. Die Anzahl an T-Dimeren, die durch die Bestrahlung induziert werden, ist bei konstanter Bestrahlungsintensität eine Funktion der Bestrahlungsdauer. Durchführung In dem vorliegenden Versuch wird ein zirkuläres, doppelsträngiges DNA-Molekül, das Phagemid pbluescript II SK(-), auf dem das Gen für eine Ampicillin-Resistenz (ampr) lokalisiert ist, für unterschiedliche Zeitintervalle mit UV-Licht bestrahlt. Nach Transformation der bestrahlten DNA in E. coli Zellen wird das Ausmaß der UVSchädigung durch die Fähigkeit der transformierten Bakterienzellen auf Ampicillinhaltigen Nährböden zu wachsen ermittelt. Pro Zeitwert 125 ng des pbluescript II SK(-) auf ein gekühltes Stück Parafilm pipettieren. Den Parafilm in einem Abstand von 15 cm unter die UV-Lichtquelle bringen und mit einer Dosisleistung von 3000 μw/cm2 für 0, 0.2, 0.5, 2 und 3 min bestrahlen. 2 μl (50 ng) der bestrahlten DNA in ein Eppendorfgefäß überführen und 100 μl kompetente E. coli Zellen hinzufügen. Durch vorsichtiges Schwenken mischen. Die Ansätze für 10 min auf Eis inkubieren. Anschließend für exakt 90 sec bei 42 C im Wasserbad und für 2 min auf Eis inkubieren. 900 μl dyt-medium zugeben und die Zellen 1 h bei 37 C und 200 rpm kultivieren.

20 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 20 Vom terminalen Zeitwert 100 μl entnehmen und auf eine dyt-platte ausplattieren. Die Ansätze in der Tischzentrifuge für 2 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen, das Sediment in 100 μl dyt-medium aufnehmen und auf dyt-amp- Platten ausplattieren. Die Platten über Nacht bei 37 C inkubieren. Auswertung: Die Kolonien auf den einzelnen Nährbodenplatten auszählen. Den natürlichen Logarithmus der Anzahl der Kolonien (N) als Funktion der Bestrahlungsdauer in Sekunden auftragen. Da die Verringerung der Anzahl der Kolonien etwa der Gleichung N(t) = N0 e-kt folgen soll, resultiert für den logarithmischen Auftrag: ln N(t) = ln N0 + (-kt) Dabei ist t die Zeit in Sekunden und N0 die Anzahl der Kolonien zur Zeit t = 0. Der Parameter k hat die Dimension s-1 und ist der Anteil an Kolonien, der pro Sekunde Bestrahlungsdauer abnimmt. Er ist identisch mit dem Anteil an DNA-Molekülen, die pro Sekunde durch UV- Bestrahlung geschädigt wird. Durch lineare Regression der Daten wird k ermittelt. Die Anzahl der Plasmide, die nach der UV-Bestrahlung noch replizieren und zur Kolonienbildung auf Antibiotika-Platten führen, ist abhängig von der Bestrahlungsdauer. Aus dieser Abhängigkeit kann ermittelt werden, wie viele Photonen im Durchschnitt von den DNA-Molekülen absorbiert werden, bis eine kovalente Modifikation (X-link) eintritt. Gegeben: Etwa Photonen werden von der DNA in einem Tropfen von 5 μ l pro Sekunde absorbiert. Frage: Nach wie vielen absorbierten Photonen wird durchschnittlich ein X-link ausgelöst? Hinweis: Zuerst wird die Anzahl der DNA-Moleküle im Tropfen errechnet. Multiplikation mit k ergibt die Anzahl der X-links, die pro Sekunde stattfinden (n). Der Quotient Photonen pro Sekunde/ n X-links pro Sekunde sagt aus, wie viele absorbierte Photonen einer kovalenten Modifikation der Plasmid-DNA entsprechen. 0.3 Tag 3: Reinigung und Nachweis des Bla-PhoA-His 6 - Nachdem das Plasmid pgpblaphoa konstruiert wurde, soll nun das Fusionsprotein Bla- PhoA-His 6 in Escherichia coli exprimiert, mittels Affinitätschromatographie aus Zellextrakten gereinigt und in einem Aktivitätstest ("Enzymassay") nachgewiesen werden Materialien Bakterienkultur vom Vortag Puffer A (10 mm Tris-HCl ph 8.0, 300 mm NaCl, 5 % (v/v) Glycerin) Puffer B und C (Puffer A mit verschiedenen Imidazol-Konzentrationen Lysozym-Puffer (Puffer A mit 200 µg/ml Lysozym) Nickel-Lösung (0.1 M NiCl 2 )

21 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 21 Mini-IMAC-Säulen Eppendorf-Reaktionsgefäße Eppendorf-Reaktionsgefäßständer PNPP-Lösung (0,4 % [w/v] in 1 M Tris-HCl ph 8,0) Eppendorf-Pipetten Pipettenspitzen Vortex Versuchsdurchführung Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) mit Nickel Wie an anderer Stelle bereits erwähnt, besitzt das Fusionsprotein Bla-PhoA zusätzlich einen carboxyterminalen 6 x His-Tag, das heißt einen kurzen, aus 6 Histidinresten bestehenden Aminosäure schwanz. Die Imidazolgruppen dieser Histidine können zweiwertige Kationen wie Cu 2+, Zn 2+, Ni 2+ oder Fe 2+ komplexieren (siehe Abb. 35 A). Diese Eigenschaft wird zur Reinigung von Proteinen ausgenutzt, denen zu diesem Zweck ein His-Tag angefügt wurde. Nickel-Ionen werden zunächst an einer chelatisierenden Sepharosematrix (CS) immobilisiert und anschließend Zellextrakt über die so erhaltene Affinitätssäule gegeben. Diejenigen in dem Zellextrakt enthaltenen Proteine, die einen His-Tag tragen, werden an die Nickel-Ionen gebunden und somit in der Säule festgehalten, während Proteine ohne His-Tag nicht binden können und durch die Säule laufen. Die gebundenen Proteine können dann gezielt wieder von der Säule gelöst (eluiert) werden, indem ein imidazolhaltiger Puffer über die Säule gegeben wird (siehe Abb. 35 B). Imidazol führt zur einer Verdrängung der über die Histidinreste an Nickel gebundenen Proteine und damit zu ihrer Freisetzung Vorbereitung der Mini -Affinitätsäulen 1. Die chelatisierende Sepharose (CS) wird zu Konservierungszwecken in einer 20%igen Ethanollösung gelagert. Vor der Nutzung des Materials muß das Ethanol vollständig entfernt werden. Dazu wird das in Eppendorfgefäßen aliquotierte Säulenmaterial (200 µl) mit 800 µl H 2 0 gut vermischt und bis zur Sedimentation des Materials auf Eis gesetzt. Der wässrige Überstand wird mit einer Pipette vorsichtig entfernt. 2. Die chelatisierende Sepharose muß nun mit Nickel beladen werden. Dazu wird die Sepharose nun mit 500 µl Nickel-Lösung vermischt und 5 Minuten auf Eis stehen gelassen. Anschließend wird das Material nochmals durchmischt und mit einer 1000 µl- Gilson-Pipette in die vorbereiteten Mini-Säulen pipettiert. Die durchlaufende Flüssigkeit wird in einem Becherglas aufgefangen. 3. Überschüssige, nicht gebundene Nickelionen werden mit Wasser von der Säule gewaschen, indem 800 µl Wasser auf die Säule pipettiert und der Durchlauf ebenfalls in dem Becherglas aufgefangen wird. Dieser Schritt wird einmal wiederholt. Eine

22 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 22 Blaufärbung der Säule deutet darauf hin, daß die Nickelionen an die Matrix gebunden sind. 4. Nun werden 800 µl Puffer A auf die Säule gegeben, um das Material mit dem Puffer zu äquilibrieren, der auch zur Herstellung der Zellextrakte (siehe unten) verwendet wird. Auch dieser Schritt wird einmal wiederholt. Die Säulen sind nun vorbereitet, um mit Zellextrakten beladen zu werden.

23 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Herstellung der Zellextrakte 1. Eine auf den Selektionsplatten gewachsene, blaugefärbte Kolonie wird von der Platte in 25 ml frisches Chloramphenicol-haltiges Flüssigmedium überführt und über Nacht bei 37 C angezogen. Die Zellen sollen während des Wachstums das Fusionsprotein Bla- PhoA-His 6 produzieren. 2. Am nächsten Morgen werden 3 ml der Zellsuspension zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, die Röhrchen mit den Zellpellets zur weiteren Verarbeitung auf Eis gestellt. 3. Die Schritte 1 und 2 werden durch die Betreuer vorbereitet. Zu den pelletierten Zellen werden 800 µl Lysozym-Puffer gegeben und die Zellen durch kräftiges Mischen (auf dem Vortex) resuspendiert. 4. Sobald keine Zellklümpchen mehr sichtbar sind, werden die Zellen für 15 Minuten bei 37 C auf dem Inkubationsblock inkubiert. Während dieser Phase wird die Peptidoglycanschicht der Bakterien durch das Lysozym angegriffen. Auch die Membranen der Zelle (innere und äußere Membran) werden infolge des nichtisotonischen Puffers zerstört, so daß sich das bakterielle Cytosol in den Puffer ergießt. 5. Im Anschluß an die Lysozymbehandlung werden die Zellen zusätzlich mit Ultraschall behandelt. Dadurch werden noch teilweise intakte Zellen vollends aufgeschlossen. Dieser Schritt wird in der Abteilung Molekulare Genetik und Präparative Molekularbiologie von den Betreuern mit Hilfe einer Ultraschall-Sonde durchgeführt. 6. Das erhaltene Zelllysat (ein Gemisch aus freigesetztem Cyto- und Periplasma sowie Membranfragmenten) wird nun 5 min in der Mikrozentrifuge zentrifugiert. Dadurch werden feste Zelltrümmer sedimentiert. Der klare Überstand enthält die löslichen Zellkomponenten (Proteine, DNA) und wird mit einer 1000 µl-gilson-pipette in ein frisches Eppendorfgefäß überführt. Dieses klare Zelllysat wird bis zur Affinitätschromatographie auf Eis aufbewahrt.

24 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Nickel-Affinitätschromatographie Das klare Zelllysat (ca. 800 µl) wird auf die vorbereiteten, mit Nickel beladenen Mini-Säulen gegeben. Die durchlaufende Flüssigkeit wird in einem frischen Eppendorfgefäß aufgefangen (Gefäß mit DL = Durchlauf beschriften!). Das Bla-PhoA-His 6 -Fusionsprotein sollte an die Säule binden, während die meisten anderen Proteine durch die Säule laufen. Weitere, nicht an der Säule gebundene Proteine werden mit 800 µl des Puffers A von der Säule gewaschen und das Eluat in einem frischen Eppendorfgefäß aufgefangen. Der Schritt wird einmal wiederholt und das Eluat in einem neuen Eppendorfgefäß gesammelt (Gefäße mit W1 bzw. W2 für Waschschritt 1 bzw. 2 beschriften!). Zur Elution des Fusionsproteins von der Matrix werden 800 µl des Puffers B auf die Säule gegeben und das Eluat in einem neuen Eppendorfgefäß aufgefangen. Der Schritt wird einmal wiederholt und das zweite Eluat separat gesammelt (Gefäße mit E1 und E2 für Eluat 1 bzw. Eluat 2 beschriften). Abschließend werden 800 µl des Puffers C aufgetragen. Durch die hohe Imidazolkonzentration werden alle restlichen Proteine von der Säulenmatrix gelöst. Auch dieser Schritt wird einmal wiederholt und beide Eluate in getrennten Eppendorfgefäßen aufgefangen (beschriften als E3 und E4 für Eluat 3 bzw. 4). Nachweis des Bla-PhoA-His 6 -Fusionsproteins Die Anwesenheit der Bla-PhoA-His 6 -Fusionsproteins in den verschiedenen gesammelten Elutionsfraktionen der Nickel-Affinitätschromatographie soll durch zwei enzymatische Tests, die auf den Aktivitäten der beteiligten Fusionskomponenten basieren, nachgewiesen werden: 1. Nachweis der enzymatischen Aktivität der Alkalischen Phosphatase (PhoA) Der Nachweis in Lösung befindlicher Alkalischer Phosphatase basiert auf der Spaltung des wasserlöslichen Substrates 4-Nitrophenylphosphat (PNPP) durch das Enzym: O O P O O Alkalische Phosphatase O O + OH - + O P O + 1 H + NO 2 NO 2 O para-nitrophenolphosphat (PNPP) para-nitrophenolat gelb Phosphat Abb. 3: Spaltung von 4-Nitrophenylphosphat (PNPP Das Produkt 4-Nitrophenolat ist löslich (anders als der blaue Indigo, der aus X-P entsteht) und gelb gefärbt. Mit Hilfe dieser Reaktion kann die Aktivität der Alkalischen Phosphatase auch

25 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 25 quantitativ bestimmt werden, indem die Entstehung des 4-Nitrophenolats im Photometer durch seine Lichtabsorption bei 405 nm verfolgt wird. Der Nachweis des Enzyms in den verschiedenen Elutionsfraktionen der Nickel-Affinitätschromatographie wird wie folgt durchgeführt: Von jeder Elutionsfraktion (DL, W1, W2, E1, E2, E3, E4) werden 200 µl in ein bereits entsprechend beschriftetes, PNPP-haltiges Eppendorfgefäß pipettiert. Eine entstehende Gelbfärbung deutet auf die Anwesenheit der Alkalischen Phosphatase und damit des Fusionsproteins Bla-PhoA-His 6 hin. Dieser Test wird im Praktikum rein qualitativ durchgeführt. Normalerweise würde man eine Absorptions/ Zeitkurve aufnehmen, um die Enzymaktivität zu quantifizieren.

26 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 26

27 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 27 Abb. 4 (vorherige Seite): Plasmide, Klonierung und Selektion

28 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 28 Stufe 1: Die Plasmide pgpbla C und pgpphoa. bla = β-laktamase-gen (vermittelt Ampicillinresistenz); bla C = β-laktamase-gen mit deletierter ( C) carboxyterminaler Region durch diese Deletion verliert das Protein seine enzymatische Funktion; cat = Chloramphenicol-Acetyltransferase (vermittelt Chloramphenicolresistenz); Cbla = carboxyterminale Region des β-laktamase-gens; His 6 = Histidin-Tag (6 Codons für Histidin in Folge) zur Reinigung des Proteins über Nickel-Affinitätschromatographie; Km = Kanamycinresistenz vermittelndes Gen; phoa = Alkalische Phosphatase. Stufe 2: Fragmente der Plasmide pgpbla C und pgpphoa nach Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen PstI und HindIII. Stufe 3: Beispiele möglicher Ligationsprodukte. A: religiertes Plasmid pgpbla C; B: gewünschtes Plasmid pgpblaphoa; C: religiertes Plasmid pgpphoa; D: unerwünschtes Plasmid pgp. Stufe 4: Zu erwartendes Ergebnis nach Transformation der Ligationsansätze in Escherichia coli KS272 und Selektion auf Chloramphenicolresistenz sowie Umsatz des Substrates X- Phosphat durch die Alkalische Phosphatase. Das gewünschte Plasmid pgpblaphoa führt zur Bildung Chloramphenicol-resistenter, blauer Kolonien.

29 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 29 Abb. 5: Transformation von Escherichia coli mit Plasmid-DNA

30 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 30 A B Abb. 6: Prinzip der Nickel-Affinitätschromatographie. A: Interaktion zwischen benachbarten Resten des 6 x His-Tags und der Nickel- Affinitätsmatrix. B: Proteinsreinigung über Nickel-Affinitätschromatographie.

31 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Anfertigen eines Protokolls Layout Das Protokoll wird in einem Schnellhefter abgegeben. Typographie und Seitenlayout: Times New Roman, 12 Pt, bei Abbildungsunterschriften 10 Pt Blocksatz, 1,5 facher Zeilenabstand Ränder: links 4 cm, rechts 2 cm, oben/unten je 2,5 cm. Gene (wie z.b. lacz) und fremdsprachige Worte (wie z.b. Escherischia coli) werden kursiv geschrieben Jede Aussage muss mit einem Literaturnachweis belegt werden Jede Abbildung (sofern sie nicht selbst erstellt wurde) muss mit einem Quellennachweis belegt werden Abbildungen erhalten nummerierte Bildunterschriften, Tabellen nummerierte Überschriften (Siehe auch später: Abbildungbeschriften) Abbildungen und Tabellen müssen erst im Text erwähnt und erst dann gezeigt werden Jedes Bild erhält eine verständliche und logische Bildbeschriftung Das Protokoll erhält durchgängig nummerierte Seiten und Kapitelüberschriften Mathematische Formeln und chemische Formel werden in einer wissenschaftlichen Form wieder gegeben. Das heißt: Formeleditor für mathematische Formeln verwenden. Strukturformeln von chemischen Substanzen wo möglich darstellen. Zwischen Zahl und Einheit wird ein Leerzeichen geschrieben z.b. 4 µl; 66 %... Tipp: Word macht keinen Zeilenumbruch zwischen Zahl und Einheit, wenn man zur Leertaste die Strg- und die Shift-Taste drückt. Diese Tastenkombination funktioniert auch mit dem Bindestrich.

32 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Gliederung des Protokolls Bei der Gliederung (Einleitung/Durchführung/Ergebnis/Diskussion) ist es egal ob es sich hierbei um einen Versuchsteil handelt oder ob die Versuche zu einem Großen ganzen zusammengefasst werden. Ein Protokoll unterteilt sich in: Titelblatt Titel des Versuchs, Name, Adresse, Matrikelnummer, Zeitraum des Praktikums, Betreuer Inhaltsverzeichnis mit Seitenangaben Einleitung Der theoretische Rahmen der Arbeit wird dargestellt. Der bisherige Stand des Wissens wird aufgeführt. Hier werden ggf. Arbeiten anderer Autoren zitiert. Die noch offenen Fragen werden genannt. Die Fragestellung der eigenen Arbeit wird angegeben. Durchführung bzw. Methoden und Materialien-Teil Was genau wurde gemacht. In diesem Teil müssen Konzentrationen, Zusammensetzungen der Lösungen sowie der Ablauf des Versuches beschrieben werden. Dieser Teil wird durchgehend im Präsens verfasst. Ergebnis Hier werden die erhaltenen Daten gezeigt. Die Ergebnisteil besteht nicht nur aus den ermittelten Graphen sondern enthält eine Beschreibung der Daten in Textform sowie Hintergründe und Rechnungen zur Auswertung (Achtung diese nachvollziehbar angeben). Die graphische Darstellung von Ergebnissen Die graphische Darstellung von Ergebnissen ist ein wichtiger Teil des Protokolls. Hier werden die Eigenleistungen präsentiert. Hierbei ist es nicht erforderlich alle Graphen in Excel bzw. Strukturformeln in einem Computerprogramm zu erstellen. Ordentliche handschriftliche Daten (auf Millimeterpapier und unter Benutzung eines Lineals), können die ermittelten Daten darstellen.

33 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum 33 Die Beschriftung innerhalb von Abbildung muss so erfolgen, dass sie gut lesbar ist. Sie sollte jedoch auch nicht zu groß sein. Wichtig ist der Informationsgehalt, das heißt die von Excel eingefügten Legenden wie Reihe1, linear Reihe1 usw. enthalten keine verwertbaren Informationen. Die Information muss hierbei auch eindeutig sein, das heißt, bei Konzentrationen werden die Einheiten angegeben. Bei Diagrammen müssen die Einheiten an den Achsen angegeben werden. Die Achsenskalierung sollte im Bereich der erhaltenen Werte liegen. Zum Beispiel, wenn die Werte zwischen 5-12 liegen ist es nicht sinnvoll die Achse von 1-20 zu wählen. Abbildungen von Gelbildern müssen ebenfalls beschriftet werden. Dies umfasst die Beschriftung der einzelnen Spuren, die Größen Angabe zum Marker und weitere Informationen die für die Abbildung wichtig ist. Die Diagramme, Tabellen etc. werden in einem einheitlichen Layout dargestellt. Diskussion Was sagen mir die Daten? Waren die Ergebnisse so erwartet (Achtung, wenn ich was erwarte muss ich auch angeben was und wieso) Wenn die Ergebnisse nicht mit dem übereinstimmen oder gar kein Ergebnis erhalten wurde, dann muss diskutiert werden was der Grund dafür war. Weiter wird hier ein Ausblick in Bezug auf die weitere Forschung gegeben. Literatur zum Vergleich der Ergebnisse heranziehen und auch angeben!!! (Ergebnis- und Diskussionsteil können als ein Gliederungspunkt zusammengefasst werden. Achtung die Diskussion muss vorhanden sein!!!) Literatur In diesem Abschnitt wird nur die Literatur aufgeführt, die auch im Text zitiert wurde. Anhang Im Anhang werden Rohdaten und anderer Ergebnisse (z. B. Ausdrucke von Spektrogrammen) aufgeführt, die im Detail nicht im Abschnitt Ergebnisse ausgewertet wurden aber für den Leser oder KursleiterIn von Interesse sein können. Werden diese Ergebnisse in der Diskussion erwähnt, sollte auf den Anhang verwiesen werden z. B. (siehe Anhang). Werden Anhänge zu verschiedenen Teilen der Arbeit angefügt, so sind die Anhänge durchzunummerieren. Aber hier nicht alle Abbildungen des Ergebnisteils anhängen

34 TU Darmstadt Biochemie AG Kolmar Grundpraktikum Abbildungen und Tabellen Alle Abbildungen werden unter der Abbildung (Bild/Graphik/Strukturformel/Diagramme ) beschriftet. Ein Beispiel für diese Beschriftung ist in Abbildung 1 gezeigt. Über die Nummerierung der Abbildung wird im Text auf sie verwiesen (wie z.b. im vorigen Satz). Hier soll eine Abbildung sein Abbildung 1: Beispiel Bild für eine Abbildung mit grauem Hintergrund Optional Abb. 1 Die Beschriftung kann automatisch von Word eingefügt werden (auf das Bild rechte Maustaste und Beschriftung) Information zum Bild. Was sieht man? Am Besten mal in einem Lehrbuch gucken wie viel doch unter so einem Bild stehen kann. Muss auch bei automatischer Bildbeschriftung selbst dazu geschrieben werden Alle Tabellen werden über der Tabelle beschriftet. Dies beinhalten wieder die Nummerierung (Tabelle 1, Tabelle 2 ) sowie die Beschriftung über den Inhalt (siehe Beispiele in Lehrbüchern). Word trennt am Seitenende gerne Tabellen, so dass sich eine Tabelle über zwei Seiten erstreckt. Das ist sehr unschön. Deshalb lieber einen Seitenumbruch (Einfügen/manueller Umbruch/Seitenumbruch) einfügen, so dass die Tabelle zusammen bleibt.