Neue Biomarker in der Prävention des Zervixkarzinoms

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1 Gynäkologe 2013 DOI /s Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2013 M. Jentschke P. Soergel P. Hillemanns Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe, Medizinische Hochschule Hannover OE 6410, Hannover Neue Biomarker in der Prävention des Zervixkarzinoms Seit Einführung der Zervixkarzinomfrüherkennungsprogramme in den 1970er-Jahren sind Inzidenz und Mortalität des Gebärmutterhalskrebses in den westlichen Ländern stetig zurückgegangen [1]. Über Jahrzehnte war die klassische zytologische Untersuchung von Zervixabstrichen der elementare Bestandteil dieser Früherkennungsuntersuchungen. Bei suspekten Screeningbefunden erfolgt die weitere Abklärung mittels kolposkopischer Untersuchung. Schwerwiegende und therapiebedürftige Dysplasien (Pap IVa bzw. CIN 3 und darüber hinaus) wurden und werden mithilfe der jährlich wiederholten Zytologie nur mit mäßig guter Sensitivität, allerdings hoher Spezifität erkannt. In der großen Gruppe der geringgradigen Zellveränderungen stößt die reine lichtmikroskopische Begutachtung des Pap-Abstriches mitunter an gewisse Grenzen. Vor allem die Bewertung einer niedriggradigen intraepithelialen Neoplasie (Pap IIID bzw. CIN 1) hinsichtlich ihrer neoplastischen Potenz und somit eine Einschätzung über das Progressionsrisiko zu höhergradigen Dysplasien gelingt häufig nur durch serielle Abstrichuntersuchungen. In dieser Situation kann die Auswertung unterschiedlicher Biomarker wertvolle Zusatzinformationen liefern, um das biologische Verhalten der Vorläuferläsionen besser einschätzen zu können und somit leichter entscheiden zu können, wann eine Patientin eine Kolposkopie erhalten sollte. Humane Papillomvirus-DNA und Genotypisierung Die DNA von sogenannten Hochrisikotypen des humanen Papillomvirus (HR- HPV), den Verursachern des Zervixkarzinoms, kann in nahezu allen Karzinomen und hochgradigen Vorläuferläsionen nachgewiesen werden [2]. Somit kann der Nachweis einer HR-HPV Infektion als ein Biomarker in der Früherkennung dienen. Nach der Zulassung durch die amerikanische Arzneimittelbehörde FDA 2003 war der Hybrid Capture 2 Test (hc2; Qiagen, Hilden) fast zehn Jahre lang der Standardtest für den HPV-Nachweis in der klinischen Routine. Als Gruppentest weist er 13 HR-HPV-Typen nach (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, und 68). Dabei erfolgt keine Differenzierung der einzelnen HPV-Genotypen. Das Ergebnis lautet entweder HR-HPV-positiv oder HR-HPVnegativ. Vorteil des hc2 ist neben seiner Robustheit die langjährige und weitreichende klinische Erfahrung, Nachteil ist unter anderem eine Kreuzreaktivität mit anderen, meist Niedrigrisiko-HPV-Typen, was zu falsch-positiven Ergebnissen führen kann [3]. In den letzten Jahren kamen zahlreiche neue HR-HPV-Testverfahren auf den Markt, die auf einem DNA-Nachweis mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) beruhen. Hierbei werden meist 14 HR- HPV-Typen detektiert (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 und 68). Zudem besteht hier die Möglichkeit, einzelne HR- HPV Genotypen gesondert zu bestimmen (HPV Genotypisierung). In der Regel sind dies HPV 16 und 18, bei manchen Anbietern auch weitere Typen. Nachteil der auf einer PCR (Polymerasekettenreaktion) beruhenden Verfahren ist in erster Linie die geringere klinische Erfahrung, gerade in diesem Bereich wurden viele Studien durchgeführt ([3, 4, 5];. Abb. 1).» HPV 16 ist in der Regel der Genotyp mit dem höchsten onkogenen Potenzial Zahlreiche retrospektive und einige prospektive Untersuchungen haben gezeigt, dass es zwischen den verschiedenen HR- HPV-Typen deutliche Unterschiede gibt hinsichtlich des Potenzials, eine CIN oder ein invasives Karzinom zu verursachen (Übersicht in [6]). HPV 16 erwies sich in den meisten Fällen als der Genotyp mit dem höchsten onkogenen Potenzial unter den HR-HPV-Typen ([2, 7, 8];. Abb. 2). Es kann nicht nur in den CIN 3 und Karzinomen in den meisten Fällen der HPV- Typ 16 nachgewiesen werden, auch prospektiv führt HPV 16 nach einer Neuinfektion häufiger zur Entwicklung einer intraepithelialen Neoplasie als die anderen HR-Typen [9, 10, 11]. Hinsichtlich der weiteren HR-HPV- Typen ergeben die Untersuchungen kein einheitliches Bild. Neben HPV 18, dem nach HPV 16 die größte Bedeutung zukommt, scheinen vor allem HPV 31, 33 und 45 ein leicht erhöhtes Risiko innezuhaben. Die HPV Genotypisierung ermöglicht darüber hinaus auch die sichere Identifikation von Frauen mit persistierender Infektion, einem entscheidenden 1

2 Sensitivität (%) a CIN2+ CIN3+ Cobas Hybrid Capture 2 Hybrid Capture 2 Cobas BD BD 100 APTIMA APTIMA 95 RealTime PCR Sensitivität (%) PreTect-HPV-proofer Spezifität (%) b RealTime PCR Pre Tect-proofer Spezifität (%) Abb. 1 9 Sensitivität und Spezifität verschiedener kommerzieller HPV-Testverfahren für die Erkennung von CIN 2+ (A) und CIN 3+ (B); 95% Konfidenzintervalle. (Adaptiert nach [21]) Kumulative Inzidenzrate (%) Follow-up (Monate) Fallzahl während eines Follow-up Intervalls HPV HPV HC HC Abb. 2 8 Kumulative Zehnjahresinzidenz von CIN 3+ bei Frauen in Abhängigkeit vom HPV- Status zu Beginn der Studie. (Adaptiert nach [9]). HPV 16 positiv: ausgefüllte Kreise, HPV 18 positiv: leere Kreise, Positiv für andere HR-HPV-Typen mittels hc2: ausgefüllte Dreiecke, HR-HPV negativ: leere Dreiecke Risikofaktor für die Entwicklung höhergradiger Veränderungen. Für den klinischen Alltag kann dies bedeuten, HPV 16-, eventuell auch HPV 18-positive Frauen früher kolposkopisch zu kontrollieren und engmaschiger zu beobachten als bei den anderen HR-HPV- Typen. Gleichwohl ist dabei nicht außer Acht zu lassen, dass das langfristige Risiko für eine CIN 3+ auch bei erstmaligem Nachweis von HPV 16 je nach Studie nur bei 20 25% liegt [9, 11, 12]. Ein negativer HR-HPV-Test bedeutet auf der anderen Seite eine sehr hohe Sicherheit; das CIN 3+-Risiko nach 12 Jahren liegt bei nur 3,0% [11]. Immunzytochemischer Nachweis von p16 INK4a und Ki-67 Die onkogene Aktivität der HR-HPV steht in engem Zusammenhang mit der durch eine Infektion ausgelösten zellulären Überexpression des sogenannten Inhibitors der Cyclin-abhängigen Kinase 4, kurz p16 INK4a (Übersicht in [13]). Diese Überexpression lässt sich in den dysplastischen, HR-HPV positiven Epithelzellen (CIN 1 3) durch immunhisto- bzw. immunzytochemische Färbungen nachweisen. Studien haben gezeigt, dass eine Kombination der p16 INK4a Färbung mit der üblichen HE(Hämatoxylin-Eosin)- Färbung Qualität, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der histopathologischen Beurteilung von Portiobiopsien deutlich verbessern kann ([14],. Abb. 3). Auch das Verhalten von CIN 1 lässt sich so besser vorhersagen: p16 INK4a positive Läsionen schreiten häufig fort zu CIN 2 und 3, während p16 INK4a negative CIN 1 häufig spontan ausheilen. Der Einsatz der p16 INK4a -Färbung in der Zytologie vereinfacht unter anderem die Triage von Patientinnen mit leichtgradigen zytologischen Auffälligkeiten (Pap IIw, Pap IIID; im Bethesda-System ASC- US und LSIL). In der PALMS-Studie zeigte sich für derartige Fälle eine ähnliche Sensitivität für hochgradige CIN wie mittels HR-HPV-Nachweis (90 95%), jedoch eine deutlich höhere Spezifität (65 vs. 38% bei ASC-US bzw vs. 19% bei LSIL; [15]). Die Bedeutung von p16 INK4a in der Zytologie hat vor allem auch durch die Kombination mit dem Nachweis des Proliferationsmarker Ki-67 (Dual-Stain-Verfahren, CINtec PLUS, Roche mtm laboratories, Heidelberg) zugenommen. In der EEMAPS-Studie (ähnlicher Ansatz wie PALMS) konnte gezeigt werden, dass durch diese Kombination die Spezifität für CIN 2+ nochmals deutlich zunimmt (81% bei ASC-US 2 Der Gynäkologe 2013

3 Zusammenfassung Abstract bzw. 68% bei LSIL). In einer zweiten Studie in Wolfsburg an Frauen mit unauffälliger Zytologie, doch positivem HR-HPV- Test zeigte das Dual-Staining eine Sensitivität für CIN 2+ von 92% bei einer Spezifität von 82% [16]. HPV L1 Der Status einer HR-HPV Infektion lässt sich auch mithilfe der verschiedenen Virusproteine beurteilen. Das Genom aller HR-HPV besteht aus sechs frühen ( early ) Genen E1 2 und E4 7, die eine Rolle bei der viralen Genexpression und -replikation spielen sowie aus zwei späten ( late ) Genen L1 und 2, die wichtig für die Bildung der Virushülle sind (Übersicht in [17]). L1 oder E4 werden typischerweise während der reproduktiven Phase der Virusinfektion in ausdifferenzierten Plattenepithelzellen gebildet (Übersicht in [13, 18]). L1, das wichtigste HPV-Hüllprotein lässt sich ähnlich wie p16 INK4a immuncytochemisch nachweisen (cytoactiv, cytoimmun diagnostics, Pirmasens) und ist beispielweise nur sehr selten bei hochgradigen Dysplasien nachweisbar (. Abb. 4), findet sich jedoch häufig bei leichtgradigen Läsionen (. Abb. 5, [18]). Dementsprechend kommt es bei CIN 1 und 2 mit nachweisbarem L1 häufiger zu einer Spontanremission als bei nicht nachweisbarem L1 [18]. In einer jüngst veröffentlichten europäischen multizentrischen Studie [19] an über 900 Frauen mit HR-HPV positiven niedrig- und mittelgradigen Dysplasien zeigte sich ebenfalls ein hochsignifikanter Unterschied: L1-negative CIN 1 und 2 verschlechterten sich in 84% zu einer CIN 3 während L1-positive Patientinnen nur in 20% eine CIN 3 entwickelten. Durch eine Triage von CIN 1 und 2 mittels L1-Bestimmung können auf der einen Seite Frauen mit erhöhtem Progressionsrisiko identifiziert werden, die einer engeren Nachbeobachtung und eventuell einer früheren Therapie bedürfen. Auf der anderen Seite kann womöglich eine Übertherapie von weniger aggressiven CIN 1 und 2 verhindert werden. Der Stellenwert des L1-Nachweises in der Screeningsituation ist gering, denn ein positiver L1-Test schließt eine hochgradige Läsion nicht aus [13]. Gynäkologe 2013 [jvn]:[afp] [alp] DOI /s Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2013 M. Jentschke P. Soergel P. Hillemanns Neue Biomarker in der Prävention des Zervixkarzinoms New biomarkers for prevention of cervical cancer DNA-Methylierung Zusammenfassung Die Zervixkarzinomfrüherkennungsuntersuchung hat sich während der vergangenen Jahrzehnte bewährt und hat dazu beigetragen, die Inzidenz der invasiven Erkrankung in den westlichen Ländern deutlich zu senken. In der jüngeren Vergangenheit hat es einige Innovationen in diesem Bereich gegeben, welche die Betreuung von Frauen mit auffälligen Screeningbefunden erleichtern können. Vor allem bei geringergradigen Veränderungen (Pap IIw, Pap IIID, CIN 1 oder HPV-Nachweis bei unauffälliger Zytologie), deren Verlauf bisher nur durch serielle Untersuchungen beurteilt werden konnte, lässt sich durch verschiedene Biomarker direkt zum Zeitpunkt der Erstdiagnose der klinische Verlauf abschätzen. Biomarker, die mit einem erhöhten Risiko für einen Progress geringradiger Dysplasien einhergehen, sind u. a. die HPV- Genotypen 16 und 18 oder der immunzytochemische Marker p16 INK4a /Ki-67. Der Nachweis von HPV L1 hingegen bedeutet eher ein niedrigeres Progressionsrisiko. Ein Biomarker, der möglicherweise in Zukunft eine Rolle spielen wird, ist der Nachweis von Hypermethylierungen der Wirtszell-DNA und der HPV- DNA, die mit einem erhöhten Risiko einhergehen. In der Routine spielt dieses Verfahren noch keine Rolle. Schlüsselwörter Humane Papillomaviren Genotypisierung Zytologie Zervikale intraepitheliale Neoplasie Maligne Tumoren Abstract The cervical cancer screening has helped to reduce the incidence of this invasive disease in western countries over the last decade. In the recent past there have been several innovations that can improve the management of women with suspicious screening results. Especially in the case of low grade dysplasia, several biomarkers can help to assess the oncogenic potential of preinvasive lesions at the time of the first diagnosis. Biomarkers that correlate with a higher oncogenic potential are human papillomavirus (HPV) genotypes 16 and 18 or the immunocytochemical marker p16ink4a/ki 67. However, HPV L1 can also be found in lesions with lower oncogenic potential. Another technique that may be relevant in the future is hypermethylation of host cell DNA or HPV DNA which is also a marker for a higher oncogenic potential. This procedure is not yet incorporated into routine practice. Keywords Human papillomavirus Genotyping Cytology Cervical intraepithelial neoplasia Malignant tumors Die Methylierung von DNA-Abschnitten ist ein wichtiger Bestandteil der epigenetisch gesteuerten Expression und Abschaltung von Genen oder der strukturellen Integrität des Genoms (Übersicht in [13]). Die Methylierung findet meist an Cytosin-Guanin-Basenpaaren statt, die durch die Phosphodiesterbrücke verbunden sind (CpG-Dinukleotide). Die normale Methylierung spielt eine wichtige Rolle in der normalen menschlichen Entwicklung, eine Fehlregulierung kann schwerwiegende Folgen haben, z. B. eine maligne Transformation von Zellen. Diese Vorgänge finden auch in HPV-infizierten Epithelzellen statt. Dort können HPVinduzierte DNA-Methylierungen die Abschaltung verschiedener Tumorsupressorgene bewirken und so eine maligne Entartung begünstigen. Diese Methylierungen lassen sich mittels sehr sensitiver und spezifischer Verfahren, z. B. spezieller PCR, bereits viele Jahre vor Entstehung eines invasiven Zervixkarzinoms nachweisen. Viele Gene wurde bereits auf diese Weise untersucht und zeigten eine Assoziation mit dem Zervixkarzinom. Insgesamt liefern die bisherigen Studien jedoch noch kein einheitliches Bild. Neben der DNA der infizierten Epithelzellen wurde auch die HPV-DNA auf Methylierungen untersucht, vor allem HPV-16-DNA. Mehrere Studien geben Hinweise auf eine mögliche Assoziation 3

4 Abb. 4 8 Geringe immunzytochemische Anfärbung von HPV L1 bei hochgradiger Dysplasie. (Mit freundl. Genehmigung cytoimmun diagnostics, Pirmasens) Abb. 5 8 Starke immunzytochemische Anfärbung von HPV L1 bei geringgradiger Dysplasie. (Mit freundl. Genehmigung cytoimmun diagnostics, Pirmasens) zwischen Hypermethylierungen in den L1-, L2-, E2- und E4-Regionen des HPV- 16-Genoms und hochgradiger CIN bzw. invasivem Zervixkarzinom (Übersicht in [13, 17]). Sollten sich diese Ergebnisse in größeren Studien bestätigen, wäre in Zukunft mit dem Nachweis von Hypermethylierungen im HPV-16-Genom möglicherweise eine Triage von Frauen mit auffälligen Screeningbefunden möglich. Fazit für die Praxis Abb. 3 9 CIN 3 nach immunhistochemischer Färbung von p16 INK4a. (Mit freundl. Genehmigung: Dr. B. Soudah, Institut für Pathologie, Medizinische Hochschule Hannover) Für die Triage von Frauen mit auffälligen Screeningbefunden in der Zervixkarzinomfrüherkennung, die nicht einer sofortigen Therapie bedürfen (Pap IIw, Pap IIID, CIN 1 und 2), stehen zahlreiche Biomarker zur Verfügung, mit deren Hilfe Frauen mit erhöhtem Risiko für einen Krankheitsprogress identifiziert werden können. Daraus kann sich eine Entscheidungshilfe für die Indikationsstellung zur Kolposkopie ergeben. F HPV 16 birgt ein deutlich höheres Risiko als die übrigen HR-HPV-Typen; mithilfe der HPV-Genotypisierung lassen sich HPV-16-Infektionen detektieren. F Der immunzytochemische Nachweis von p16 INK4a und Ki-67 (Dual-Staining-Methode), der direkt an zytologischen Abstrichen erfolgen kann, geht ebenfalls mit einem erhöhten Risiko einher. F Das HPV-Hüllprotein L1, das sich ebenfalls immunzytochemisch nachweisen lässt, findet sich vor allem in Läsionen mit niedrigerem Risiko; Frauen mit höherem Progressionsrisiko sind also L1-negativ. F Noch in der Studienphase befindet sich der Nachweis von Methylierung der Wirtszell-DNA und der HPV- DNA; dies könnte künftig eine weitere Möglichkeit sein, Frauen mit erhöhtem Risiko zu identifizieren. F Der Stellenwert aller genannten Verfahren für die Zervixkarzinomfrüherkennung wird ausführlich untersucht im Rahmen der Erstellung der S3- Leitlinie Prävention des Zervixkarzinoms ( html; [20]), mit deren Veröffentlichung 2014 zu rechnen ist. Korrespondenzadresse Dr. M. Jentschke Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe, Medizinische Hochschule Hannover OE 6410 Carl-Neuberg-Str. 1, Hannover Jentschke.Matthias@mh-hannover.de Danksagung. Wir danken Herrn Dr. B. Soudah vom Institut für Pathologie, Medizinische Hochschule Hannover, der uns. Abb. 3 freundlicherweise zur Verfügung gestellt hat. Interessenkonflikt. Der korrespondierende Autor weist für sich und seine Koautoren auf folgende Beziehung/en hin: P. Hillemanns gibt folgende Interessenskonflikte an: Vortragshonorare von Abbott, Qiagen, Roche. P. Soergel gibt keine Konflikte an. M. Jentschke hat Vortragshonorar und Reisekostenerstattung erhalten von Abbott, Wiesbaden. Literatur 1. Laara E, Day NE, Hakama M (1987) Trends in mortality from cervical cancer in the Nordic countries: association with organised screening programmes. Lancet 1: Sanjose S de, Quint WG, Alemany L et al (2010) Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer: a retrospective cross-sectional worldwide study. Lancet Oncol 11: Poljak M, Kocjan BJ (2010) Commercially available assays for multiplex detection of alpha human papillomaviruses. Expert Rev Anti Infect Ther 8: Jentschke M, Soergel P, Lange V et al (2012) Evaluation of a new multiplex real-time polymerase chain reaction assay for the detection of human papillomavirus infections in a referral population. Int J Gynecol Cancer 22: Meijer CJ, Berkhof J, Castle PE et al (2009) Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. Int J Cancer 124: Jentschke M, Soergel P, Hillemanns P (2012) Importance of HPV genotyping for the screening, therapy and management of cervical neoplasias. Geburtsh Frauenheilk 72: Wheeler CM, Hunt WC, Joste NE et al (2009) Human papillomavirus genotype distributions: implications for vaccination and cancer screening in the United States. J Natl Cancer Inst 101: Der Gynäkologe 2013

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