Vitamin D CPBA Zur in-vitro-bestimmung von25-oh Vitamin D in Plasma, Serum und Urin
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- Marcus Kuntz
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1 Arbeitsanleitung 25-OH Vitamin D Vitamin D Zur in-vitro-bestimmung von25-oh Vitamin D in Plasma, Serum und Urin Gültig ab Artikelnummer: K 2111 Packungsgröße: 50 Tests Lagerung: -20 C Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, D Bensheim Tel.: Fax: e.mail: Info@immundiagnostik.com
2 25-OH-Vitamin D 1. VERWENDUNGSZWECK Der hier beschriebene Assay ist für die Bestimmung von 25-OH Vitamin D aus humanem Serum und Plasma. Nur zur in vitro Diagnostik. 2. EINLEITUNG Vitamin D 3 wird in der Haut unter Einfluss von ultraviolettem Licht (UV-B) gebildet. Vitamin D 2 stammt aus der Nahrung oder künstlichen Supplementen und wird über den Dünndarm aufgenommen. Vitamin D 2 und D 3 werden vom Organismus in gleicher Weise verstoffwechselt und haben gleiche biologische Aktivität. Vitamin D wird in der Blutbahn an ein Bindungsprotein (DBP) gebunden und in der Leber zu 25-OH-Vitamin D metabolisiert. Diese 25-Hydroxylierung ist im Wesentlichen vom Substratangebot abhängig. 25-OH-Vitamin D hat noch eine geringe biologische Aktivität, liegt aber mit der höchsten Konzentration von allen D-Metaboliten in der Zirkulation vor. Aufgrund seiner hohen Affinität zum Bindungsprotein DBP stellt es die Speicherform des Vitamin D dar. Die Serumkonzentration von 25-OH-Vitamin D ist deshalb der beste Indikator für die Vitamin-D-Versorgung. 25-OH-Vitamin D wird in der Niere weiter zum 1,25-(OH) 2 Vitamin D metabolisiert, welches der biologisch aktivste Vitamin-D-Metabolit ist und die Funktion eines Hormons hat (D-Hormon). Es reguliert die Kalziumaufnahme aus dem Darm, die Knochenmineralisierung, die Osteoblastendifferenzierung und die Knochenmatrixsynthese. Weiterhin wird die neuromuskuläre Funktion durch D-Hormon beeinflusst. Bereits leichter Vitamin-D-Mangel mit einem 25-OH-Vitamin-D-Gehalt von ng/ml bzw nmol/l führt über die verminderte Kalziumaufnahme zu einem sekundären Parathormonanstieg und zu einer gesteigerten Knochenresorption. In der deutschen Normalbevölkerung mit einem Alter über 50 Jahren ist der Vitamin D Status signifikant mit der Knochendichte assoziiert (Scharla et al. 1996). Vitamin-D-Mangel ist somit einer der wichtigsten Risikofaktoren insbesondere für die senile Osteoporose. Die frühzeitige Erkennung eines Vitamin-D-Mangels ermöglicht eine effektive Prävention von Frakturen durch Vitamin-D-Supplementation. Schwerer Vitamin-D-Mangel mit einem 25-OH-VItamin D Gehalt < 12 ng/ml bzw. < 30 nmol/l führt zum Krankheitsbild der Rachitis (Kinder) oder der Osteomalazie (Erwachsene), das durch eine gestörte Knochenneubildung und durch eine mangelhafte Matrix-Mineralisierung gekennzeichnet ist (Scharla 1997). Ein Überschuss an Vitamin D (Medikamenten-Überdosierung) ruft ein Hyperkalziämiesyndrom hervor. 1
3 25-OH-Vitamin D Häufigkeit von Vitamin D-Mangel Leichter Vitamin-D-Mangel aufgrund mangelnder UV-B-Bestrahlung (Sonnenmangel) oder verminderter Fähigkeit zur kutanen Vitamin D- Synthese (ältere Menschen) ist in Europa sehr häufig (Scharla 1998). In Deutschland leiden im Winter bis zu 1/3 der Normalbevölkerung über 50 Jahre an Vitamin-D-Mangel. Eine besondere Risikogruppe stellen Immigranten mit dunklerer Hautfarbe dar. Schwerer Vitamin-D-Mangel kann bei geriatrischen Patienten in ca. 3 % der Behandlungsfälle nachgewiesen werden (Oster et al. 1983). Auch jüngere Menschen können bei Vorliegen gastrointestinaler Erkrankungen (Leberfunktionsstörungen, Malabsorption) oder bei verstärktem Metabolismus (Medikamente wie Antiepileptika) einen Vitamin D-Mangel aufweisen. In Deutschland liegen auch bei "Normalpersonen" häufig niedrigere Spiegel vor. Diese sind jedoch bereits mit einem sekundären Parathormonspiegel assoziiert. 25-OH-Vitamin-D-Werte von ng/ml bzw nmol/l werden deshalb von den meisten Autoren übereinstimmend als erniedrigt angesehen (subklinischer Vitamin D-Mangel). 3. TESTPRINZIP Dieser Testkit arbeitet nach dem Prinzip eines kompetitiven Protein- Bindungs-Assay. Das 25-(OH)-Vitamin D der Probe konkurriert mit dem zugesetzten Tracer ( 3 H 25-OH-Vit. D) um die Bindung an das Vitamin D- bindende Protein (VDBP, Gc-Globulin). Da in vivo das gesamte zirkulierende 25-(OH)-Vit D an VDBP gebunden vorliegt, müssen die Proben mit Acetonitril präzipitiert werden, um den Analyt freizusetzen. Der Acetonitrilüberstand kann dann ohne weitere Vorbehandlung im Test eingesetzt werden. Im ersten Schritt werden der Tracer, Probe bzw. Standard pipettiert. Im zweiten Schritt wird dann das Vitamin D Bindungsprotein hinzugegeben. Das 25-(OH)-Vit D der Probe (Standard) kompetitiert mit dem Tracer um die spezifische Bindung an das VDBP. Mit steigender Analyt-Konzentration in der Probe (Standard) wird weniger VDBP über den Tracer gebunden. Ungebundener Tracer wird über Aktivkohle gebunden und abzentrifugiert. Die verbliebene Radioaktivität des Überstandes wird im Beta-Counter gezählt. 2
4 25-OH-Vitamin D 4. INHALT DER TESTPACKUNG Artikel Nr. Kit Komonenten Menge K 2111AP Assaypuffer, gebrauchsfertig 2 x 10 ml K 2111A Aktivkohlesuspension, gebrauchsfertig 1 x 7 ml K 2111BP Vitamin D Bindungsprotein, gebrauchsfertig 6 ml K 2111T Tracer ( 3 H-25OH-D), gebrauchsfertig 1 x 600 µl K 2111ST K 2111KO Standards und NSB, gebrauchsfertig Genaue Konzentration bitte dem Etikett entnehmen Kontrollen Genaue Konzentration bitte dem Datenblatt entnehmen 7 x 250 µl 2 x 250 µl 5. ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL Präzisionspipetten und Pipettenspitzen für den Einmalgebrauch für variable Volumina von µl Acetonitril Multikanal- bzw. Multipipette Zentrifuge, 3000 x g Vortex-Mixer Laborübliche Glas- oder Plastikröhrchen (Einmalartikel) Beta-Counter 3
5 25-OH-Vitamin D 6. HINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN Standards und Kontrollen sind auf Humanserum aufgebaut. Sie sind auf HIV und Hepatitis B getestet und für negativ befundet worden. Jedoch sollten die Testkomponenten als Vorsichtsmaßnahme immer wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. 7. VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN 6 Fläschchen Standards mit den Konzentrationen 0, 8, 20, 50, 125 und 312 nmol/l; gebrauchsfertig. Haltbar bei -20 C bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett). NSB-Lösung1 Fläschchen, gebrauchsfertig. Halbar bei -20 C bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett). Kontrollen, 2 Fläschchen Kontrollen; human Serum, gebrauchsfertig. Haltbar bei -20 C bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett). Tracer, 1 Fläschchen enthält < 1,5 µci (< 55 kbq) mit Tritium (3H) markiertem 25(OH) Vitamin D3 in ethanolischer Lösung, gebrauchsfertig. Haltbar bei -20 C bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett). Assaypuffer, 2 Fläschchen Phosphatpuffer mit 0,1% NaN3 (Vorsicht: giftig). Haltbar bei -20 C bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett). Vitamin-D Bindungsprotein, 1 Fläschchen mit Bindungsprotein aus Ziegenserum in Phosphatpuffer mit 0,1% NaN3 als Stabilisator. Haltbar bei -20 C bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett). Aktivkohlesuspension, 1 Fläschchen aktivkohlehaltiger Phosphatpuffer mit 0,1% NaN3 als Stabilisator. Haltbar bei -20 C bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett). 4
6 25-OH-Vitamin D Wichtige Hinweise für eine sorgfältige Präanalytik und zur Probenlagerung Serum/Plasma 1. Vitamin D ist eine stabile Substanz; die Proben können deshalb in der Regel bei Raumtemperatur gelagert werden. Wir empfehlen aber, die Proben nach der Abnahme bei 2-8 C zu lagern, falls eine Messung innerhalb der nächsten 24 Stunden nicht möglich ist. Sollte innerhalb dieser 24 Stunden keine Messung erfolgen, empfiehlt es sich, die Proben bei -20 C einzufrieren. Ein mehrfaches Einfrieren und Auftauen der Proben jedoch ist unter allen Umständen zu vermeiden. 2. Hämolyse stört das Ergebnis nicht; Vollblut darf aber nicht als Probenmaterial eingesetzt werden. 3. Lipämisches Probenmaterial führt- falls unbehandelt- zu falschen Ergebnissen. Wir empfehlen daher: a.) Lipämische Proben scharf abzentrifugieren (10 min. bei ca x g) Dabei schwimmt die Fettphase nach oben; die wäßrige Phase kann dann durch die Fettschicht hindurch mit der Pipette abgenommmen werden. b.) Für stark lipämisches Material empfehlen wir die Verwendung unseres Delipidierungs-Kits (Bestell-Nr. K 1003A), der speziell für lipämisches Probenmaterial im klinischen Labor entwickelt wurde. 4. Bei der Durchführung des Assays sind die in der Anleitung genannten Inkubationszeiten und Temperaturen sorgfältig zu beachten. Urin Vor der Testdurchführung müssen die Proben gut gemischt werden. Zur Lagerung sind die Urine mit 1 N NaOH auf einen ph Wert zwischen 6 und 8 einzustellen. Die Proben sind bei 4 C, bei längerer als 14tägiger Lagerung tiefgefroren, bis zur Messung aufzubewahren. 5
7 25-OH-Vitamin D Testdurchführung und Probenvorbereitung I. Extraktion Die Extraktion ist in 1.5 ml Einmalreaktionsgefäßen in Einzelwerten durchführen. Wir empfehlen das Pipettieren auf Eis durchzuführen µl NSB, Standards, Kontrollen, Patientenproben (Plasma, Serum oder Urin) in Teströhrchen geben µl Acetonitril (Vorsicht: gesundheitsschädlich!) hinzufügen, 3. Röhrcheninhalt mischen, Deckel freizentrifugieren, min. bei 4 C inkubieren, min. bei 1700 x g zentrifugieren, 6. Überstände in zur 25-OH-D-Quantifizierung einsetzen. II. Bindungsassay Die Bestimmungen sind in Glasröhrchen in Doppelwerten durchzuführen. Alternativ kann die Testdurchführung auch in den RIA-Spezialgefäßen (600 µl Gesamtvolumen, Fa. Sarstedt) durchgeführt werden. Das hierfür notwendige Equipment kann über Immundiagnostik bezogen werden µl NSB, Standards, Kontrollen, Patientenproben (klare Überstände nach dem Extraktionsschritt) in Glasröhrchen überführen, µl Tracer ( 3 H-25-OH-D) in jedes Röhrchen pipettieren µl Assay-Puffer in jedes Röhrchen pipettieren µl Bindungsprotein (nicht in NSB) hinzugeben. 5. Röhrcheninhalt mischen (bei Verwendung von RIA Spezialgefäßen werden diese mit Folie verschlossen, kräftig geschüttelt und dann die Folie kurz freizentrifugiert), 6. 1 Stunde bei 4 C inkubieren, µl Aktivkohlesuspension (Suspension vor Zugabe mischen) zugeben. Röhrcheninhalt mischen, min. bei 4 C inkubieren min. bei 1700 x g zentrifugieren, µl Überstände in Beta-Counter-Zählgefäße (7 ml) überführen, 2 ml Szintillatorflüssigkeit zugeben, mischen, (Bei Verwendung moderner Sicherheitsszintilatoren wie Aquasafe 300 oder HiSafe III ist dem zu messenden Überstand die 1,5-2 fache Szintillator-Menge zuzusetzen) 11. Radioaktivität im Beta-Counter 2 min. zählen. 6
8 25-OH-Vitamin D Auswertung Zur Auswertung des Testes empfehlen wir die 4-Parameter-Funktion. Alternativ kann auch eine Punkt-zu-Punkt-Auswertung oder eine gewichtete Spline-Funktion gewählt werden. Vor jeder automatischen Auswertung sollte stets eine Kontrolle der Doppelwerte auf Plausibilität ( Ausreißerkontrolle ) durchgeführt werden; falls dies nicht durch das verwendete Programm erfolgt, sollte diese der Operator durchführen. Mustereichkurve cpm nmol/l
9 25-OH-Vitamin D Erwartete Ergebnisse Normwert-Bereiche für 25-OH-Vitamin D 3 1 ng/ml = 2.5 nmol/l 1 nmol/l = 0.4 ng/ml Information vom ASBMR 2006 Defizienz (schwerer Mangel) < 12 ng/ml bzw. < 30 nmol/l Insuffizienz (Mangel) ng/ml bzw nmol/l Suffizienz (gut versorgt) > 30 ng/ml bzw. > 75 nmol/l Bund der Osteologen SACHSEN E. V. Achtung Die Produktion von Vitamin D in der Haut ist hoch variabel und abhängig von Jahres- und Tageszeit, Breitengrad, Alter, Sonnenschutz u. a. Die Referenzbereiche sind von der verwendeten Untersuchungsmethode abhängig (z. B. Vitamin-D-Freisetzung von dem Vitamin D Bindeprotein, DBP) und können daher nur zur Orientierung dienen. Literaturreferenzen Visser M, Deeg DJ, Puts MT, Seidell JC, Lips P. (2006) Low serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D in older persons and the risk of nursing home admission. Am J Clin Nutr. Sep;84(3):616-22; quiz Grant WB, Holick MF.Benefits and requirements of vitamin D for optimal health: a review. (2005) Altern Med Rev. Jun;10(2): Review Wicherts IS, van Schoor NM, Boeke AJ, Visser M, Deeg DJ, Smit J, Knol DL, Lips P. (2007) Vitamin D status predicts physical performance and its decline in older persons. J Clin Endocrinol Metab. Jun;92(6):
10 25-OH-Vitamin D QUALITÄTSKONTROLLE Kreuzreaktion Zu Aktivkohle behandeltem Serum wurde 25-OH Vitamin D2 (125 nmol/l), 24,25-(0H)2 Vitamin D3 (250 nmol/l) und 1,25-(OH)2 Vitamin D3 (250 nmol/l) zugesetzt. Das 25-OH Vitamin D2 reagierte zu 60 %, das 24,25-(0H)2 Vitamin D3 zu 100 % kreuz, während das 1,25-(OH)2 Vitamin D3 keine Kreuzreaktivität zeigte. Reproduzierbarkeit Durch Wiederholungsmessungen (n=11) einer 25-Dihydroxy-Vitamin D3 haltigen Proben wurden folgende Resultate erzielt: Intraassayvarianz Anzahl Mittelwert [nmol/l] VK [%] Probe ,3 12,5 Probe ,2 Interassayvarianz Anzahl Mittelwert [nmol/l] VK [%] Probe 1 9 9,9 17 Probe Klinik Normalpersonen Patienten mit Schenkelhalsbrüchen Anzahl Mittelwert [nmol/l] ,5 9
11 25-OH-Vitamin D ALLGEMEINE HINWEISE ZUM TEST Dieser Kit wurde nach der IVD Richtlinie 98/79/EG hergestellt und in den Verkehr gebracht. Falls für die Herstellung der Testkomponenten Humanseren verwendet wurde, sind diese auf HIV und Hepatitis B getestet und für negativ befundet worden. Jedoch sollten die Testkomponenten als Vorsichtsmaßnahme immer wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. Die Testkomponenten enthalten zum Schutz vor bakteriellen Kontaminationen Natriumazid. Natriumazid ist giftig. Substrate für enzymatische Farbreaktionen sind als giftig und karzinogen beschrieben. Jeder Kontakt mit der Haut oder der Schleimhaut ist zu vermeiden. Alle im Test enthaltenen Reagenzien dürfen ausschließlich zu wissenschaftlichen Zwecken oder, wenn vermerkt, zur in vitro Diagnostik eingesetzt werden. Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des auf der Verpackung angegebenen Datums nicht mehr verwendet werden. Einzelkomponenten verschiedener Chargen dürfen nicht gemischt oder ausgetauscht werden. Für die Qualitätskontrolle sind die, für medizinische Laboratorien erstellten Richtlinien zu beachten. Die charakteristischen Testdaten wie Inkubationszeiten, Inkubationstemperaturen und Pipettiervolumina der verschiedenen Komponenten wurden firmenintern festgelegt. Nicht mit dem Hersteller abgesprochene Veränderungen in der Testdurchführung können die Resultate beeinflussen. Die Firma Immundiagnostik GmbH übernimmt für die hierdurch entstandenen Schäden und Folgeschäden keine Haftung. Bei Gewährleistungansprüchen ist das beanstandete Material mit schriftlicher Erklärung innerhalb von 14 Tagen zum Hersteller- der Immundiagnostik GmbH zurück zu senden. 10
12 Manual 25-OH Vitamin D For in-vitro determination of 25-OH Vitamin D in plasma, serum, urine and tissue extracts Valid from Article No.: K 2111 Quantity: 50 Tests Storage: -20 C Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, D Bensheim Tel.: Fax: e.mail: Info@immundiagnostik.com
13 25 hydroxyvitamin D Summary Vitamin D is a secosteroid hormone involved in the intestinal absorption of calcium and in the regulation of calcium homeostasis. There are two different forms of vitamin D, namely D3 and D2, which are structurally very similar. The latter one is a synthetic product, which is predominantly absorpted via fortified food. Physiological Vitamin D3 levels result from dietary uptake but also by biosynthesis in the skin from 7- dehydrocholesterol and UV-light due to sun exposure. The vitamin is then hydroxylated in the liver to 25-hydroxyvitamin D (25-OH Vit D) which is the major circulating metabolite of Vitamin D. Although the biological active form of vitamin D is 1,25(OH)2 Vit D, which is synthesised in the kidney, it is widely accepted that the measurement of circulating 25-OH Vit D provides better information with respect to the patients vitamin D status and is used for diagnosis of hypovitaminosis (1,2). The concentration of 25-OH Vit D decreases with age and deficiency is common among the elderly. Clinical aspects Clinical applications of 25-OH Vit D measurements are the diagnosis and therapy control of postmenopausal osteoporosis, rickets, osteomalacia, renal osteodystrophy, pregnancy, neonatal hypocalcemia and hyperparathyriodism. In addition, a prevalence of subclinical vitamin D deficiency in different European countries has been discussed lately Vitamin D intoxication mostly occurs from large intake of pharmaceutical preparations of vitamin D and may lead to hypercalcemia, hypercalcuria and nephrocalcinosis in susceptible infants. Test principle This radioimmunoassay for the determination of 25-OH Vitamin D3 is based on the principle of competitive protein binding analysis. The specific binding protein for 25 OH Vitamin D originates from goat serum. 3-H labeled 25-OH Vitamin D3 is used as tracer. For the separation of bound antigen from free antigen the free Vitamin D is adsorbed to activated charcoal and separated by sedimentation. 1
14 25 hydroxyvitamin D Kit components 250 µl Standard 0, 8, 20, 50, 125, 312 nmol/l 250 µl NSB-solution 250 µl 25-OH-D control-solutions 1 and µl 3 H-25-OH-D, < 55 kbq (<1,5 µci) 2 x 10 ml assay buffer 5,5 ml 25-OH-Vit D-binding-protein 5,5 ml activated charcoal suspension Material and equipment required but not provided Polypropylene-tubes, 1,5 ml, with top Vortex mixer Coolable laboratory centrifuge Pipettes: 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 500 µl or multi-channel dispenser Refrigerator, freezer Beta-counter Reagent preparation and storage The standards, controls and NSB are ready to use and stable at 20 C until the expiry date given on the lable. The tracer 3 H-labeld 25(OH) Vit. D (< 1,5 µci or 55 kbq) is ready to use and stable at 20 C until the expiry date given on the label. The assay buffer is ready to use and stable at 20 C until the expiry date given on the label. The vitamin-d binding protein is ready to use and stable at 20 C until the expiry date given on the label. The activated charcoal suspension is ready to use and stable at 20 C until the expiry date given on the label. 2
15 25 hydroxyvitamin D Sample preparation and storage Plasma or serum 1. Vitamin D is an inert substance. The samples could be stored at room temperature but Immundiagnostik recommends a storage at 2-8 C after collection as far as the measurement is performed within the first 24 h. Otherwise the samples must be stored at -20 C. Avoid repeated freezethaw cycles. 2. Hemolysis does not disturb the results; whole blood is not suitable. 3. Untreated lipemic samples lead to incorrect results. Therefore we recommend: a.) Centrifuge lipemic samples 10 min at 3.000xg. The lipid phase floats up. Collect the aqueous phase. b.)for highly lipemic samples we recommend to use a special delipidation kit (Catalogue No. K 1003A). This kit was developed for lipemic samples in clinical laboratories. 4. Indicated incubation times and temperatures must be observed exactly. 5. Mix samples well before use. Dilute samples with a 25-OH Vit D content of more than 312 nmol/l 1:10 with 0,9 % NaCl solution. Urine Adjust the urine to a ph of 6 to 8 with 1 N NaOH and store the samples at - 20 C until testing. Tissue Mince and homogenize a weight amount of tisssue in a defined volume of PBS (phosphate buffered saline). 3
16 25 hydroxyvitamin D Assay procedure I. Extraction Carry out the extraction in polypropylene tubes with top in singlets. 1. Pipette 50 µl NSB, standards, controls, patient-samples (plasma, serum, urine, tissue extracts, undiluted or diluted 1:10) into the tubes. 2. Add 200 µl Acetonitrile 3. Close the top and mix vigorously, centrifugate the top free of moisture. 4. Incubate for min. at 4 C 5. Centrifugate for 10 minutes at 1700 x g. 6. Keep the supernatants for the competitive protein binding assay (step 2). II. Competitive protein binding assay Carry out the test in duplicates in glass tubes. Alternative you can use special RIA-tubes, available from Immundiagnostik. The test, including the activated charcoal separation, is to be carried out on ice. 1. Pipette 25 µl of each supernatant (NSB, standards, controls, patient samples) from the extraction step into the glass tubes. 2. Add 10 µl Tracer ( 3 H-25-OH-D), 3. Add 300 µl assay-buffer 4. Add 100 µl binding protein (not into NSB) 3. Close the tops, mix vigorously and centrifugate the top free from moisture. 4. Incubate for 1 hour at 4 C. 5. Add 100 µl activated charcoal suspension (mix suspension well before use) and mix vigorously 6. Centrifugate for 10 minutes at 1700 x g. 7. Pipette 400 µl of supernatant into counting vesssels of Beta counter, add 2 ml of scintillation liquid and mix vigorously. 9. Evaluate in a beta-counter for 2 minutes. 4
17 25 hydroxyvitamin D Calculation A calibration curve is constructed from the standards. Commercially available software can be used as well as graph paper. Results of the samples are read from this calibration curve. THE CALIBRATION CURVE IS NOT LINEAR, therefore a spline- or 4PL algorithm is recommanded. Typical calibration curve cpm nmol/l
18 25 hydroxyvitamin D Expected values Normal ranges for 25-OH-Vitamin D 3 1 ng/ml = 2.5 nmol/l 1 nmol/l = 0.4 ng/ml Information from ASBMR 2006 Deficiency (seriously deficient) < 12 ng/ml resp. < 30 nmol/l Insufficiency (deficient) ng/ml resp nmol/l Sufficiency (adequately supplied) > 30 ng/ml resp. > 75 nmol/l Society of Osteology SACHSEN E. V. Note The vitamin D production in the skin is high variable and depends on the season- and daily time, degree of latitude, age, sun protection etc. The normal ranges depend on the method used (e. g. vitamin-d-release from the vitamin D binding protein, DBP) and serve only as orientation. Literature references Visser M, Deeg DJ, Puts MT, Seidell JC, Lips P. (2006) Low serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D in older persons and the risk of nursing home admission. Am J Clin Nutr. Sep;84(3):616-22; quiz Grant WB, Holick MF.Benefits and requirements of vitamin D for optimal health: a review. (2005) Altern Med Rev. Jun;10(2): Review Wicherts IS, van Schoor NM, Boeke AJ, Visser M, Deeg DJ, Smit J, Knol DL, Lips P. (2007) Vitamin D status predicts physical performance and its decline in older persons. J Clin Endocrinol Metab. Jun;92(6):
19 25 hydroxyvitamin D Sensitivity The sensitivity, or minimum detection limit of this assay is 2,5 nmol/l (B0 + 2SD) Cross-reactivity The cross reactivity in the 25(OH) Vit. D was studied by addition various materials were added to the samples. 25(OH) Vit. D 2 < 60 % 24,25(OH) 2 Vit. D 3 100% 1,25(OH) 2 Vit D 3 - Precision and reproducibility Intraassay VC n Mean value [nmol/l] VC [%] Sample ,3 12,5 Sample ,2 Interassay VC n Mean value [nmol/l] VC [%] Sample 1 9 9,9 17 Sample Quality control The concentration of the controls 1 and 2 is given on the control data sheet. 7
20 25 hydroxyvitamin D General notes on the test and test procedure The test components which are made of human serum are tested for Australia antigen and HIV and found to be negative. However, since no test method can offer complete assurance that infectious agents are absent, these reagents should be handled as recommended for any potentially infectious human serum or blood specimen. The normal precautions for laboratory working should be observed. Reagents of the test package contain sodium azide as a bactericide. Contact with skin or mucous membranes is to be avoided. All reagents in the test package are to be used only for in-vitro diagnostics. The reagents should not be used after the date of expiry (see label on the test package). Single components with different lot numbers should not be mixed or exchanged. For quality control, the guidelines for medical laboratories should be observed. The characteristic test data, such as incubation time, incubation temperature and pipetting volumina of the different components are defined by the producer. Any variations of the test procedure, that are not coordinated with the producer, may influence the results of the test. Our company can therefore not be held reliable for any damage resulting from this. 8
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