NOVA Lite TM Skin Antibody Primate Esophagus Autoantibody Screen Assay Nur für In-Vitro Diagnostik CLIA Kompliziertheit: Hoch

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1 NOVA Lite TM Skin Antibody Primate Esophagus Autoantibody Screen Assay Nur für In-Vitro Diagnostik CLIA Kompliziertheit: Hoch Verwendungszweck NOVA Lite TM SA ist ein indirektes Immunfluoreszenz-Testsystem zum Screening und semi-quantitativen Nachweis von Haut-Antikörpern im Humanserum. Die Gegenwart von Anti-Haut-Antikörpern kann in Verbindung mit anderen serologischen Tests und klinischen Befunden als Diagnosehilfe für autoimmune Hauterkrankungen, vor allem Pemphigus und Pemphigoid verwendet werden. Informationen zum Test Der Begriff Haut-Autoantikörper beschreibt verschiedene Autoantikörper, die mit Bestandteilen der Haut und Schleimhautoberflächen reagieren. Diese Autoantikörper treten mit großer Häufigkeit in Patienten auf, die an autoimmunen Hauterkrankungen leiden, vor allem Pemphigus und Pemphigoid. Autoantikörper, die mit einem interzellulären Antigen der Haut und Schleimhäute reagieren, sind in praktisch allen aktiven Fällen der bullösen Hauterkrankung Pemphigus zu finden. 1 Die Höhe des Antikörpertiters korreliert mit der Aktivität der Krankheit und vermindert sich bei erfolgreicher Therapie. 2,3,4 Bullöses Pemphigoid, eine weitere wichtige autoimmune Hauterkrankung, ist serologisch gekennzeichnet durch die Gegenwart von Antikörpern gegen die Basalmembran der Haut und Schleimhäute. Zirkulierende Antikörper gegen die Basalmembran treten bei 70-80% von Pemphigoid-Patienten auf. 5,6,7 Die Korrelation zwischen dem Schweregrad der Krankheit und dem Titer ist bei Pemphigoid zwar nicht so deutlich wie bei Pemphigus, doch es besteht trotzdem eine Korrelation. Während der Abklingphase, entweder spontan oder nach Behandlung, nehmen die Basalmembran-Antikörper ab, gewöhnlich auf ein nicht mehr nachweisbares Niveau. 7 Ein Rückfall wird in den meisten Fällen von einem Wiederanstieg des Basalmembran- Antikörpertiters begleitet. Indirekte Immunfluoreszenz ist die am häufigsten verwendete Methode für Haut-Autoantikörpertests. Als Substrat werden häufig dünne Schnitte von Nagetier- oder Primatenhaut und vorzugsweise Schnitte mit Primatenösophagusschleimhaut verwendet. 8,9,10 Neben dem Substrattyp sind auch andere Faktoren von größter Wichtigkeit für die Leistung des Haut-Autoantikörpertests, u.a.: 1) das für die Vorbereitung des Substratträgers verwendete Fixiermittel und 2) die Spezifität und das Verhältnis von Fluoreszein zu Protein (F/P) des verwendeten FITC-markierten Konjugats. Es ist bekannt, dass einige Fixiermittel oder Kombinationen davon bestimmte Haut-Antigene zerstören. Deren Verwendung sollte deshalb vermieden werden. Das F/P-Verhältnis des Konjugats bestimmt die Sensitivität und den Grad der Hintergrundfärbung. Die Spezifität eines Konjugats ist von größter Bedeutung. Die Mehrheit der Autoantikörper gehört der IgG- Subklasse an. Es ist bekannt, dass die in gesunden Blutspendern gefundenen Autoantikörper meistens den Subklassen IgM und IgA und nur selten der Subklasse IgG angehören. 11 Aufgrund dessen sind IgGspezifische Konjugate krankheitsspezifischer. Das Substrat für den NOVA Lite TM Skin Antibody ist eine optimal fixierte Primatösophagus-Gewebeschnitt. Das Konjugat ist ein affinitätsgereinigter Antihuman-IgG Antikörper. Testprinzip Bei der indirekten Immunfluoreszenzmethode werden die Proben mit Antigensubstrat inkubiert und ungebundene Antikörper ausgewaschen. Gebundene Autoantikörper werden mit fluoreszenzmarkiertem antihuman IgG-Konjugat detektiert, nach der Inkubation wird ungebundenes Konjugat ausgewaschen. Bei der Betrachtung durch ein Fluoreszenzmikroskop sind Autoantikörper-positive Proben durch eine apfelgrüne Fluoreszenz zu erkennen, die den Bereichen der Zelle oder des Zellkerns entspricht, an den der Autoantikörper gebunden ist. Inhalt der Testpackung 1. Hautantikörper-Objektträger (Primaten Ösophagus), 8 Auftragsstellen mit Trockenmittel 2. Antihuman-IgG-Konjugat (Ziege), Fluoreszeinmarkierung in einem Puffer, der Evans Blue und 0,09% Natriumazid enthält, 7 ml 3. Pemphigoid Positivkontrolle, 1 Fläschchen Puffer mit 0,09% Natriumazid und Humanserum- Antikörpern gegen Pemphigoid, vorverdünnt, 0,5 ml 4. Autoantikörper Negativkontrolle, 1 Fläschchen Puffer mit 0,09% Natriumazid ohne Humanserum- Antikörper gegen Pemphigoid, vorverdünnt, 0,5 ml 5. PBS-Konzentrat (40x), ergibt 1000 ml 6. Mounting Medium, 0,09% Natriumazid, 7 ml 7. Deckgläser Hinweise 1. Alle in diesem Test verwendeten Reagenzien wurden auf Antikörper gegen HIV, HBsAg und HCV getestet und für negativ befunden. Dennoch sollten alle humanen Kontrollen wie potentiell infektiöses Humanserum oder Blutproben behandelt werden NaN 3 wird als Stabilisator verwendet. NaN 3 ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen verursachen. Vorsichtig handhaben und Kontakt mit Augen und Haut vermeiden! Den Kontakt mit Metall, basischen Stoffen oder anderen Komponenten, die mit Säure reagieren können, vermeiden. Bei der Entsorgung von Reagenzien ist mit viel Leitungswasser nachzuspülen, um Ansammlungen im Abwassersystem zu verhindern. 1

2 3. Die vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung während der Arbeit mit Reagenzien tragen. 4. Verschüttete Reagenzien sofort beseitigen. Bei der Entsorgung von Abfällen alle Umweltvorschriften beachten. Vorsichtsmaßnahmen 1. Dieser Test ist für In-Vitro Diagnostik. 2. Die Verwendung anderer als im Testkit vorhandenen Komponenten kann zu widersprüchlichen Ergebnissen führen. 3. Unvollständiges Waschen und ungenügendes Entfernen der Flüssigkeiten aus den IFA Kavitäten führt zu hohen Hintergrund-Extinktionen. 4. Die Applikation sowohl des ganzen Tests als auch einzelner Bestandteile auf nicht validierte automatische Analysensysteme oder Pipettierautomaten kann gegenüber der manuellen Testdurchführung zu abweichenden Testergebnissen führen. Es liegt in der Verantwortlichkeit jedes Labors ihr automatisiertes Verfahren zu validieren, so daß die Testergebnisse innerhalb akzeptabler Grenzen liegen. 5. Die Testqualität wird durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflußt. Diese beinhalten die Temperatur der Reagenzien, die Stärke der benutzten Mikroskoplichtquelle, die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Pipettiertechnik, die Gründlichkeit des Waschens und die Länge der Inkubationszeiten während des Tests. Um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, muß die Konstanz dieser Faktoren besonders beachtet werden. 6. Im Laufe der Zeit kann das Anti-human IgG-Konjugat durch Lichteinfluß seine Farbe verändern. Dieser Farbwechsel hat jedoch keinerlei Einfluß auf die Testdurchführung und -qualität. 7. Die strikte Einhaltung des Testprotokolls wird empfohlen. Jede Änderung im Protokoll erfolgt auf Risiko des Anwenders. Lagerung 1. Lagerung aller Kit-Reagenzien bei 2-8 C. Nicht einfrieren. Die Reagenzien sind stabil bis zum Ende des Haltbarkeitsdatums bei vorschriftsmäßiger Lagerung und Handhabung. 2. Der verdünnte Waschpuffer ist bei 2-8 C vier Woche stabil. Proben Die Testdurchführung sollte mit Serumproben erfolgen. Werden Azide oder andere Stabilisatoren zu den Serumproben gegeben, können die Ergebnisse nachteilig beeinflusst werden. Mikrobakteriell kontaminierte, hämolytische, lipämische oder durch Hitzeeinwirkung inaktivierte Proben sollten nicht verwendet werden. Nach der Blutentnahme ist das Serum vom Blut zu trennen. Das NCCLS Dokument H18-A2 empfiehlt die folgenden Lagerungsbedingungen für Patientenproben: 1) Proben bei Raumtemperatur nicht länger als 8 Stunden lagern. 2) Kann die Testdurchführung nicht innerhalb von 8 Stunden erfolgen, die Proben bei 2-8 C kühl lagern. 3) Kann die Testdurchführung nicht innerhalb von 48 Stunden erfolgen ist die Probe bei - 20 C oder niedriger einzufrieren. Eingefrorene Proben müssen nach dem Auftauen und vor der Testdurchführung sorgfältig gemischt werden. Testdurchführung In der Testpackung vorhandenes Material 10 Hautantikörper Objektträger mit 8 Auftragsstellen 1 7 ml FITC antihumanes IgG-Konjugat 1 0,5 ml Pemphigoid Positivkontrolle 1 0,5 ml Autoantikörper Negativkontrolle 1 25 ml PBS-Konzentrat (40x) 1 7ml Mounting Medium 1 10 Deckgläser Zusätzliches benötigtes Material Pipetten für µl Destilliertes oder deionisiertes Wasser Spritzflaschen oder Pasteur-Pipetten Feuchte Kammer 1L Gefäß zur PBS-Verdünnung Küvette zum Waschen der Objektträger Fluoreszenzmikroskop mit 495 nm Anregungsfilter und 515 nm Sperrfilter Methode Testvorbereitung 1. Alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur bringen (20 26 C) und gründlich mischen. 2. Das PBS-Konzentrat verdünnen: WICHTIG: Zum Verdünnen des PBS-Konzentrats im Verhältnis 1:40 den Inhalt der PBS-Konzentratflasche in 975 ml destilliertes oder deionisiertes Wasser geben und gut mischen. Der PBS-Puffer wird zum Verdünnen der Patientenproben und als Waschpuffer verwendet. Der verdünnte Puffer kann maximal 4 Wochen bei 2-8 C gelagert werden. 2

3 3. Die Patientenproben verdünnen: a. Erstes Screening: Die Patientenproben im Verhältnis 1:10 mit verdünntem PBS-Puffer verdünnen (d.h., 100 µl Serum in 900 µl PBS-Puffer geben). b. Titrierung: Aus der ersten Screening-Verdünnung eine 2-fach Serienverdünnung für alle positiven Proben mit verdünntem PBS-Puffer herstellen (d.h. 1:20, 1:40,... 1:2560). Testdurchführung 1. Die Objektträger vorbereiten: Den Objektträger erst aus der Packung nehmen, wenn dieser Raumtemperatur erreicht hat. Den Objektträger mit einem Bleistift beschriften und in eine geeignete feuchte Kammer legen. Einen Tropfen (70-90µL) der unverdünnten positiven und der negativen Kontrolle jeweils auf die Auftragsstellen 1 und 2 geben. Einen Tropfen (70-90µL) der verdünnten Patientenprobe auf die restlichen Auftragsstellen geben. 2. Inkubation des Objektträgers: Den Objektträger Minuten lang in einer feuchten Kammer inkubieren (zur Aufrechterhaltung der richtigen Feuchtigkeit ein feuchtes Papiertuch flach auf den Boden eines geschlossenen Plastik- oder Glasbehälters legen). Das Substrat darf während der Testdurchführung nicht austrocknen. 3. Objektträger waschen: Nach der Inkubation das Serum unter Verwendung einer Spritzflasche oder Pipette vorsichtig mit verdünntem PBS-Puffer abwaschen. Zur Vermeidung eines carry-over sollte der Objektträger so gehalten werden, dass kein Serum auf andere Auftragsstellen gelangt. Den Strahl nicht direkt auf die Auftragsstellen richten, um eine Beschädigung des Substrats zu vermeiden. Wenn Sie gewünscht werden, legen Sie des Objektträgers in ein Coplin Glas des verdünnten PBS Puffers für bis 5 Minuten. 4. Zugabe des Fluoreszenzkonjugats: Überschüssigen PBS-Puffer ablaufen lassen. Den Objektträger wieder in die feuchte Kammer legen und sofort alle Auftragsstellen mit einem Tropfen des Fluoreszenzkonjugats bedecken. Den Objektträger weitere Minuten inkubieren. 5. Objektträger waschen: Schritt 3 wiederholen. 6. Eindecken: Obwohl jedes Labor seine eigene Methode zum Eindecken von Objektträgern hat, wird das folgende Vorgehen empfohlen: a. Objektträger auf ein Papiertuch legen. b. Das Mounting Medium in einer durchgehenden Linie auf den unteren Rand des Deckgläschens auftragen. c. Überschüssigen PBS-Puffer absaugen. Deckglas mit der unteren Kante zuerst auf den Objektträger auflegen und langsam auf den Objektträger absenken, so dass keine Luftblasen entstehen. Qualitätskontrolle Die Pemphigoid Positivkontrolle und Autoantikörper Negativkontrolle sollten auf jedem Objektträger mitgeführt werden, um sicherzustellen, dass alle Reagenzien und Arbeitsschritte richtig ausgeführt wurden. Weitere geeignete Kontrollseren können durch Aliquotieren von gepoolten Humanserumproben hergestellt und bei < -70 o C gelagert werden. Die Testergebnisse können erst als gültig akzeptiert werden, wenn alle der unten aufgeführten Kriterien erfüllt sind. Wenn eine dieser Kriterien nicht erfüllt ist, sollten die Testergebnisse als ungültig angesehen und der Assay wiederholt werden. 1. Die Pemphigoid Positivkontrolle muss > 3+ sein. 2. Die Autoantikörper Negativkontrolle muss negativ sein. Interpretation der Ergebnisse Negative Reaktion. Eine Probe ist negativ, wenn die spezifische Fluoreszenzfärbung der interzellulären Bereiche, Basalmembran oder anderer Strukturen gleich oder weniger als die negative Kontrolle ist. Proben können aufgrund heterophiler Antikörper oder anderer spezifischer Reaktionen aufgrund von Retikulin- Antikörpern, anti-nukleären, anti-endomysialen oder anti-glatte Muskulatur Antikörpern unterschiedlich starke Hintergrundverfärbungen aufweisen. Positive Reaktion für interzelluläre und Basalmembranzonen-Antikörper. Eine Probe kann als positiv angesehen werden, wenn eine spezifische Fluoreszenzfärbung der interzellulären oder Basalmembran der Ösophagusschleimhaut beobachtet wird. Zur Bestimmung des Fluoreszenzgrads bzw. der Intensität sind folgende Kriterien anzuwenden: 4+ Grelle apfelgrüne Fluoreszenz 3+ Helle apfelgrüne Fluoreszenz 2+ Deutlich erkennbare positive Fluoreszenz 1+ Niedrigste spezifische Fluoreszenz, die eine deutliche Differenzierung der Verfärbung der interzellulären oder Basalmembranzonenbereiche der Ösophagealschleimhaut von der Hintergrundfluoreszenz ermöglicht Grenzen des Verfahrens 1. Obwohl die Gegenwart von Antikörpern auf bestimmte autoimmune bullöse Hautkrankheiten hindeutet, sollte dies nicht als Diagnose betrachtet werden. Das Antikörper-Ergebnis sollte in Verbindung mit anderen serologischen oder Biopsieergebnissen und der allgemeinen klinischen Anamnese des Patienten beurteilt werden. 2. Neben den Hautantikörpern können auch andere Antikörper mit dem Ösophagussubstrat reagieren. Zu diesen gehören u. a. antinukleäre (ANA), Anti-Mitochondrien-, (AMA), Anti-Glatte Muskulatur- und Anti-Skelettmuskel-Antikörper. Die Gegenwart von diesen Antikörpern sollte notiert und auf anderen spezifischen Substraten bestätigt und austitriert werden. 3

4 3. Es ist zu beachten, dass als Folge von Gewebeschäden bei einigen Patienten mit Verbrennungen schwach reagierende Antikörper erzeugt werden, die sich auch an interzellulare Bereiche binden. Diese so genannten pemphigus-ähnlichen Antikörper erzeugen eine schwache, ungleichmäßige Färbung der Schleimhaut, sind von transienter Art und zeigen keine in vivo-reaktion mit der Haut des Patienten. 13,14,15 4. Da die Ösophagusschleimhaut bestimmte Blutgruppensubstanzen enthalten kann, ist eine Reaktion der Anti-A und Anti-B Blutgruppen-Antikörper mit dem Ösophagus möglich. 16 Das Reaktionsmuster kann in einigen Patienten dem bei interzelullären Pemphigus-Autoantikörpern auftretenden Muster gleich sein (obwohl Blutgruppenantikörper auch Blutgefäße in der Muskulatur des Ösophagus anfärben). Die Reaktivität aufgrund von Blutgruppen-Antikörpern kann mithilfe von Blutgruppen- Antigenen absorbiert werden Auch eine Reihe von externen Faktoren beeinflusst die Testsensitivität, u.a. die Art des verwendeten Fluoreszenzmikroskops, Stärke und Alter der Lichtquelle, verwendete Vergrößerung, Filtersystem und Erfahrung des Benutzers. 6. Wenn anstelle des 515-Sperrfilters ein Breitbandfilter verwendet wird, tritt eventuell eine verstärkte Artefaktbildung auf. 7. Zur Beschriftung der Objektträger sollte ausschließlich Bleistift verwendet werden. Bei Verwendung anderer Schreibutensilien können Artefakte entstehen. 8. Alle zum Waschen der Objektträger verwendeten Waschküvetten müssen frei von jeglichen Farbstoffrückständen sein. Wenn in den Waschküvetten Farbrückstände sind, besteht die Gefahr von Artefaktbildungen. 9. Die ermittelten Testergebnisse sollten ausschließlich in Verbindung mit klinischen Befunden und anderen serologischen Tests verwendet werden. 10. Der vorliegende Test wurde ausschließlich für die Untersuchung von Serum konzipiert. Erwartungswerte M i t d e m N O V A L i t e TM Skin Antibody Test wurden eine Vielzahl von Patienten mit Pemphigus und Pemphigoid sowie 100 zufällig ausgewählte Blutspender getestet und die folgenden Ergebnisse ermittelt: Anzahl Positiv Patient Gruppe Anzahl Interzellulär Basalmembran Pemphigus Pemphigoid Normal

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