GEBRAUCHSANWEISUNG GEBRAUCHSFERTIGE DIP- SLIDE-MEDIEN. BD BBL Mycoslide

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1 GEBRAUCHSANWEISUNG GEBRAUCHSFERTIGE DIP- SLIDE-MEDIEN BD BBL Mycoslide DA Rev.: Juni 2003 VERWENDUNGSZWECK BBL Mycoslide ist ein dreiseitiges Dip-Slide (Eintauchobjektträger), beschichtet mit Medien zum Nachweis von Pilzen, einschließlich Hefen, aus Urin, Sputum, Rachenspülungen, Stuhlproben und einer Vielzahl von Abstrichproben auf Tupfern. GRUNDLAGEN UND ERLÄUTERUNG DES VERFAHRENS Mikrobiologische Methode. Fadenpilze und Hefen (Sprosspilze) sind häufig auftretende Pathogene und verursachen viele Arten lokaler und systemischer Infektionen bei immunkompetenten und immungeschwächten Patienten. 1 Eines der häufigsten Pilzpathogene ist Candida albicans. Bei immungeschwächten Patienten verursacht C. albicans und das kürzlich beschriebene C. dubliniensis häufig lokale und systemische Infektionen. Die drei von lokalen Infektionen hauptsächlich betroffenen Körperstellen sind die Atemwege, der Urogenitalbereich und der Darmtrakt. Der quantitative Nachweis der Hefen, die von diesen Körperstellen isoliert wurden, ist wichtig, da sie in normaler Flora in geringer Zahl vorkommen mögen, ihre Zahl jedoch bei Infektionen deutlich ansteigt. 1-5 BBL Mycoslide besteht aus einem dreiseitigen Agarträger, beschichtet mit zwei Pilzmedien und einem Medium zum Nachweis der in der Probe vorhandenen Bakterien. Der gesamte Agarträger wird in flüssige Proben getaucht, oder er wird durch Ausstreichen der Proben von Abstrichtupfern inokuliert. Nach der Inkubation können die Isolate quantiativ bestimmt und für weitere Differenzierungs-, Identifizierungs- und Empfindlichkeitstests verwendet werden. Medium 1 ist Malzagar für den Nachweis aller Arten von Pilzen, einschließlich Schimmelpilzen und Hefen. Malzextrakt enthält alle erforderlichen Nährstoffe zur Förderung des Pilzwachstums. Der niedrige ph-wert des Mediums führt zu einer teilweisen bis vollständigen Hemmung des Wachstums von kontaminierenden Bakterien, wird jedoch von Pilzen gut toleriert. Dieses Medium wird für den quantitativen Nachweis von Pilzpathogenen verwendet. Medium 2 ist Malzagar unter Zusatz von Cycloheximid, welches ein Hemmstoff für saprophytische Schimmelpilze und bestimmte Hefen ist. Die meisten pathogenen Pilze, einschließlich Candida albicans, werden auf diesem Medium nicht gehemmt. Cryptococcus neoformans und bestimmte Candida-Spezies außer C. albicans, die auch eine Rolle als Infektionserreger spielen können, werden jedoch von Cycloheximid gehemmt. Medium 3 ist CLED-Agar (Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient Agar, Elektrolytarmer Cystin- Lactose-Agar), ein Differenzierungs-Kulturmedium zur Isolierung und zum quantitativen Nachweis von Bakterien in Urin. Es kann auch zur Isolierung von Bakterien aus anderen Proben verwendet werden, wenn diese nicht zu anspruchsvoll sind. Auf BBL Mycoslide wird dieses Medium hauptsächlich für die Bestimmung der bakteriellen Begleitflora verwendet. BBL Mycoslide wird für den Nachweis, die Isolierung und die quantitative Bestimmung von Pilzen aus einer Vielzahl von Körperstellen und Probentypen verwendet. Es kann auch als Transportmedium von der Arztpraxis zu den Analyselabors verwendet werden. DA

2 REAGENZIEN Zusammensetzungen* pro L destilliertem Wasser BBL Mycoslide Medium 1: Malz-Agar Medium 2: Malzagar mit Cycloheximid Medium 3: CLED Agar Malzextrakt 30,0 g Malzextrakt 30,0 g Gelatine-Pepton 4,0 g Agar 15,0 Agar 15,0 Casein-Pepton 4,0 ph 4,1 ± 0,2 Cycloheximid- 1,0 Rindfleischextrakt 3,0 ph 4,1 ± 0,2 Lactose 10,0 L-Cystin 0,128 Bromthymolblau 0,02 Agar 15,0 ph 7,3 ± 0,3 *Nach Bedarf abgestimmt und/oder ergänzt auf die geforderten Testkriterien. VORSICHTSMASSNAHMEN. Nur für den professionellen Gebrauch. Dip-Slides bei Anzeichen von mikrobieller Kontamination, Verfärbung, Austrocknung, Rissen oder sonstigen Anzeichen von Produktverfall nicht verwenden. Während des gesamten Verfahrens aseptische Arbeitsmaßnahmen beachten und Schutzmaßnahmen gegen biologisches Gefahrenmaterial treffen. Hinweise zu Verfahren aseptischer Arbeitsweise, Biogefährdung und Entsorgung des gebrauchten Produkts sind der ALLGEMEINEN GEBRAUCHSANLEITUNG zu entnehmen. Bei der Verwendung von BBL Mycoslide als Transportmedium von der Arztpraxis zum Diagnoselabor die lokalen Bestimmungen für den Transport infektiöser Proben beachten. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Nach Erhalt BBL Mycoslide bis unmittelbar vor dem Gebrauch im Dunkeln bei C in der Originalverpackung lagern. Einfrieren, Überhitzen, Austrocknen und Temperaturschwankungen vermeiden. Die Objektträger können bis zum Verfallsdatum (s. Kennzeichnung auf der Verpackung) inokuliert und entsprechend den empfohlenen Inkubationszeiten inkubiert werden. Ungeöffnete Objektträger aus geöffneten Packungen können bei Lagerung in einem sauberen Bereich bei C bis zum Verfallsdatum verwendet werden. Wenn die Objektträger geöffnet wurden, müssen sie umgehend verbraucht werden. QUALITÄTSSICHERUNG DURCH DEN ANWENDER Non den unten aufgeführten Stämmen Supensionen herstellen, die einem McFarland-Standard von 0,5 entsprechen. Für jeden Organismus ein Röhrchen (ausreichend groß, um die Einführung eines BBL Mycoslide-Agarträgers zu ermöglichen) mit 20 bis 25 ml steriler Kochsalzlösung vorbereiten und 1 ml der oben genannten Suspension des Stammes zugeben. Einen BBL Mycoslide öffnen, den Agarträger entnehmen, kurz in die Teststammsuspension tauchen und wie unter Testverfahren für flüssige Proben beschrieben fortfahren. 2 bis 5 Tage bei 35 ± 2 C inkubieren. Agarflächen wie unter Ergebnisse und Interpretation beschrieben auf Wachstum kontrollieren. DA

3 Stämme Medium 1 Malz-Agar Medium 2 Malzagar mit Cycloheximid Medium 3 CLED Agar Candida albicans Wachstum Wachstum Wachstum ATCC Aspergillus niger Wachstum Teilweise bis vollständig Wachstum ATCC gehemmtes Wachstum E. coli Teilweise bis vollständig Teilweise bis vollständig Wachstum ATCC Pseudomonas aeruginosa Teilweise bis vollständig Teilweise bis vollständig Wachstum ATCC Enterococcus faecalis Teilweise bis vollständig Teilweise bis vollständig Wachstum ATCC Staphylococcus aureus Teilweise bis vollständig Teilweise bis vollständig Wachstum ATCC Nicht inokuliert Hell bernsteinfarben Hell bernsteinfarben Grünlich-gelb VERFAHREN Mitgeliefertes Arbeitsmaterial BBL Mycoslide. Mikrobiologisch kontrolliert. Nicht mitgeliefertes Arbeitsmaterial Zusätzliche Kulturmedien, Reagenzien und Laborgeräte nach Bedarf. Probenarten BBL Mycoslide ist geeignet für die Isolierung und die quantitative Bestimmung von Bakterien und Pilzen aus Urin (Mittelstrahl oder Katheterurin, oder durch suprapubische Blasenpunktion gewonnener Urin), Sputum, Rachenspülungen, Stuhl und einer Vielzahl anderer Proben (z.b. Vaginalabstrichen). Nicht für den Nachweis bakterieller Infektionen verwenden. Probengewinnung und -präparation Bei der Gewinnung von Proben die entsprechenden aseptischen Maßnahmen beachten. Zur Probengewinnung Standardverfahren verwenden. 1,6 Der Urin muss frisch oder nicht älter als 2 h sein. Alternativ können die Urinproben auch gekühlt aufbewahrt werden (nicht länger als 24 h), um ein Überwachsen der infektiösen Stoffe oder Kontaminanten vor der Inokulation zu vermeiden. Sputum: Ein Teil des frisch ausgehusteten oder induzierten Sputums wird einem Teil einer 0,25%igen Trypsinlösung hinzugegeben und dann mit sterilen Glasperlen 45 min lang bei 37 C geschüttelt. Alternativ kann das Sputum 1 min lang in einem Stomacher homogenisiert werden. Wenn nur eine geringe Sputummenge zur Verfügung steht, kann diese ohne vorherige Behandlung verwendet werden. Rachenspülungen: Die Flüssigkeit 10 min lang bei 2000 g zentrifugieren. Die flüssige Phase entsorgen und das Sediment in 5 ml Trypsinlösung (0,25 %) oder steriler Kochsalzlösung aufnehmen und mit sterilen Glasperlen 15 min lang bei 37 C schütteln. Stuhlproben, die frisch sind oder nicht länger als 48 h gekühlt aufbewahrt wurden. 1 g Stuhl in 100 ml 0,25%iger Trypsinlösung oder steriler Kochsalzlösung mit sterilen Glasperlen 15 min lang bei 37 C homogenisieren. Abstrichtupfer: Die Probe (z.b. aus dem Rachen oder der Vagina) mit einem Tupfer aufnehmen und direkt und ohne Vorbehandlung wie nachfolgend beschrieben aufbringen. Wenn es zwischen Probenentnahme und Inokulation zu einer zeitlichen Verzögerung kommt, den Abstrich in geeigneten Transportmedien transportieren. 1,6 Testverfahren 1. Die Agaroberflächen bei geschlossenem BBL Mycoslide-Röhrchen sichtprüfen. Die Objektträger mit Kontamination bzw. die, auf denen die Medien schrumpfen, entsorgen. 2. Das Röhrchen mit dem Patientennamen, der Probennummer und dem Inokulationsdatum beschriften. DA

4 3. Die Abdeckung abschrauben und den Objektträger ohne die Agaroberflächen zu berühren aus dem Kunststoffröhrchen nehmen. Inokulation mit flüssigen Proben (z.b. Urin oder Rachenspülungen): 1. Den Objektträger drei Mal kurz in die flüssigen Proben (z.b. Urin oder vorbehandeltes Sputum, Rachenspülungen usw.) tauchen, sodass die Agarschichten vollständig von der Flüssigkeit inokuliert werden. Den Objektträger nicht länger als 10 sec in der Flüssigkeit lassen, da dies die Bestandteile aus den Medien auswaschen und/oder das Gel aus dem Kunststoffträger lösen kann. 2. Wenn nur eine geringe Probenmenge verfügbar ist, diese mit einer sterilen Pipette oder Spritze aufnehmen und die drei Medien vollständig spülen. 3. Überschüssiges Material abtropfen lassen. Hierzu den Objektträger mit der Spitze an den Innenrand des Röhrchens halten. 4. Die letzten Tropfen können mit einem Papiertuch von der Objektträgerspitze entfernt werden. Den Objektträger vorsichtig wieder in das entsprechende Kunststoffröhrchen geben und fest verschließen. 5. Den Objektträger nach der Inokulation 48 h bei 30 ± 2 C inkubieren oder in ein Speziallabor senden. Für das Wachstum von Fadenpilzen, z.b. von Infektionen der unteren Atemwege, kann eine längere Inkubationszeit erforderlich sein. Inokulation mit Proben auf Abstrichtupfern: Den Abstrich sorgfältig auf den drei Kulturmedien auf dem Objektträger ausstreichen. Ergebnisse und Interpretation Nach der Inkubation den Objektträger vorsichtig zur Interpretation aus dem Röhrchen nehmen. Bei dem gesamten Kontrollvorgang aseptische Vorgehensweisen beachten. Es wird empfohlen, während der Kontrolle sterile Handschuhe zu tragen. Agarflächen nicht berühren! Medium 1 (Malzagar): Dieses Medium ermöglicht die quantitative Bestimmung aller Pilze. Fadenpilze bilden üblicherweise Kolonien mit einer groben Oberfläche (Luftmyzel). Die Kolonien sind häufig pigmentiert (schwarz, grau, blaugrün, gelblich usw.). Hefen (Sprosspilze) bilden weiße bis cremefarbene, glänzende bis trübe Kolonien, die üblicherweise eine glatte Oberfläche haben und Bakterienkolonien ähneln. Zur vollständigen Identifizierung der Pathogene sind weitere Tests notwendig. 1 Für die quantitative Bestimmung das tatsächliche Wachstum auf dem Objektträger mit den Referenzbildern im Leitfaden zur Interpretierung am Ende dieses Dokuments vergleichen. Bei starkem Wachstum und einer großen Anzahl Kolonien ( 10 5 ) können die Agaroberflächen vollständig mit einem konfluierenden Rasen überwachsen sein. Für die klinische Signifikanz der Erregerkeimzahlen bei Proben von verschiedenen Körperstellen die Tabelle und die entsprechende Literatur konsultieren: 1-5 Probenart Anzahl der Hefekolonien: Normal 1 Fraglich 2 Klinisch signifikant Mittelstrahl- oder Katheterurin 10 3 /ml /ml >10 5 /ml Urin, der durch suprapubische Jede Erscheinung von Pilzen ist klinisch signifikant Blasenpunktion gewonnen wurde Sputum 10 3 /ml /ml >10 5 /ml Rachenspülungen >10 4 Stuhl 10 3 /g /g >10 5 /g 3) Vaginalproben Jede Erscheinung von Pilzen ist klinisch signifikant 1) Eine geringe Anzahl kann bei vorbehandelten Patienten oder bei Patienten mit chronischen Infektionen signifikant sein. 2) Wenn möglich, neu bewerten. 3) Eine Behandlung von Patienten mit einer hohen Anzahl Hefen im Stuhl muss sorgfältig abgewogen werden. Eine hohe Anzahl Hefen im Stuhl tritt häufig bei Patienten auf, die zuvor mit antibakteriellen Antibiotika behandelt wurden. Nach Abschluss der Antibiotikabehandlung fällt die Hefezahl üblicherweise wieder auf den normalen Wert ab. Bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem können bereits geringe Zahlen auf eine Infektion hindeuten. 1,3 DA

5 Medium 2 (Malzagar mit Cycloheximid): Dieses Medium gewährleistet die Unterdrückung der Fadenpilze, die Cycloheximid-empfindlich sind (z.b. Schimmelpilze wie Aspergillus). Bestimmte Hefen werden durch diesen Zusatz ebenfalls gehemmt. Die Cycloheximid-Resistenz ist eine wichtige Eigenschaft für die Unterscheidung von Pilzen: Organismen 1 Klinische Signifikanz und Häufigkeit Cycloheximid-resistent Candida albicans Wichtiges Pathogen; häufig C. dubliniensis Häufig bei HIV-Patienten gefunden C. guilliermondii Selten, wenig häufig C. kefyr (=C. pseudotropicalis) Selten, wenig häufig Andere Spezies Selten Cycloheximid-empfindlich Candida tropicalis Selten, wenig häufig C. krusei Relativ häufig, erwiesenermaßen pathogen C. parapsilosis Selten, erwiesenermaßen pathogen Candida (Torulopsis) glabrata Relativ häufig, erwiesenermaßen pathogen Cryptococcus neoformans Selten, wichtiges Pathogen Aspergillus, Penicillium und andere Pilze Aspergillus kann Infektionen der unteren Atemwege oder andere Infektionen verursachen Diese Pilze können auch als Kontaminanten vorkommen 1) Zu beachten ist, dass das Wachstum oder die Hemmung auf diesem Medium nicht auf die in dieser Tabelle aufgeführten Spezies beschränkt ist. Die angegebenen Organismen treten ziemlich häufig in klinischen Proben auf. Für weitere Informationen die Literaturhinweise konsultieren. 1,7 Medium 3 (CLED Agar) dient zur quantitativen Bestimmung der bakteriellen Keimzahl in der Probe. Die Keimzahlen können bei der Bewertung des Verhältnisses zwischen Bakterien- und Pilzwachstum, beispielsweise in Stuhl, von Bedeutung sein. Es ist zu beachten, dass weitere Tests, wie beispielsweise biochemische und/oder mikroskopische Verfahren, erforderlich sind, um die Identifizierung der auf diesem Dip-Slide isolierten Pathogene zu vervollständigen. 1 Die meisten dieser Methoden sind nur in Diagnoselabors durchführbar und können üblicherweise nicht in einer Arztpraxis durchgeführt werden. Aus diesem Grund sollten alle Dip-Slides mit zweifelhaften oder eindeutig positiven Ergebnissen in ein Analyselabor eingesendet werden, welches mykologische Tests durchführt. Nach dem Gebrauch und vor der Entsorgung müssen alle verwendeten Röhrchen und alles andere kontaminierte Material autoklaviert oder verbrannt werden. Für nähere Einzelheiten siehe das Dokument ALLGEMEINE GEBRAUCHSANLEITUNG. LEISTUNGSMERKMALE UND VERFAHRENSBESCHRÄNKUNGEN BBL Mycoslide dient zum Nachweis, zur Isolierung und zur quantitativen Bestimmung von Pilzen, einschließlich Hefen, aus Urin, Sputum, Rachenspülungen, Stuhlproben und einer Vielzahl anderer Proben. Die auf diesem Dip-Slide enthaltenen Medien sind gängige 1, 8-10 Standardmedien zur Isolierung der entsprechenden Pilz- und Bakteriengruppen. Gelegentlich wird das Wachstum von Bakterien auf den Pilzkulturmedien (Medium 1 und 2) dieses Dip-Slides nicht vollständig unterdrückt. Im Zweifelsfall sollte eine Methylenblau- oder Gramfärbung der verdächtigen Kolonien durchgeführt werden. Die meisten weniger anspruchsvollen bakteriellen Spezies wachsen auf dem Medium 3 (CLED Agar). Dieses Medium unterstützt jedoch nicht das Wachstum von Organismen wie den pathogenen Neisseria-Spezies, Haemophilus spp., u.a. Beta-hämolytische Streptokokken verzeichnen auf diesem Medium kein gutes Wachstum. Aus diesem Grund muss Blutagar oder Schokoladenagar in den Test aufgenommen werden, wenn eine bakterielle Infektion mit derartigen Organismen vermutet wird. Auf BBL Mycoslide dient CLED Agar hauptsächlich zum DA

6 Nachweis der bakteriellen Begleitflora. Für eine exakte Diagnose bakterieller Infektionen wird die Verwendung anderer Systeme und Medien empfohlen. BBL Urotube-Systeme sollten zur Diagnose bakterieller Infektionen aus Urinproben verwendet werden. Proben für den Nachweis bakterieller Infektionen von anderen Körperstellen müssen auf den für die Probe geeigneten Agarkulturmedien analysiert werden. Es kann eine Vielzahl von Spezies auf den Medien dieses Dip-Slides wachsen; die Anzahl ist nicht auf die im Abschnitt Ergebnisse und Interpretation aufgeführten Spezies beschränkt. Eine korrekte Identifizierung vieler Organismen kann häufig nur von einem Analyselabor durchgeführt werden. Aus diesem Grund sollten die Objektträger nach der Inokulation oder nach der Inokulation und Inkubation in derartige Labors gesendet werden. BBL Mycoslide wurde für die Erstisolierung und zur quantitativen Bestimmung entwickelt. Für weitere Tests und besonders wenn Mischkulturen auf den Medien dieses Systems vorhanden sind, müssen Subkulturen auf geeigneten Agarmedien angelegt werden, um die für eine vollständige Identifizierung und für umfassende Empfindlichkeitstests erforderlichen Reinkulturen zu gewinnen. 1 Die Dip-Slides dürfen nicht für die Durchführung von Resistenzbestimmungen verwendet werden. LITERATUR 1. Fromtling, R.A. (section editor) Mycology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 2. Halle, E., et al Genitalinfektionen Teil I und II. In: Mauch, H., Lüttiken, R., and S. Gatermann (eds.): MiQ - Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik, vol. 10 and 11. Urban & Fischer, Munich, Germany. 3. Kist, M., et al Infektionen des Darmes. In: Mauch, H., Lüttiken, R., and S. Gatermann (eds.): MiQ - Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik, vol. 9. Urban & Fischer, Munich, Germany. 4. Podbielski, A., et al Infektionen des Mundes und der oberen Atemwege. In: Mauch, H. and R. Lüttiken (eds.): MiQ - Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik, vol.13. Urban & Fischer, Munich, Germany. 5. Mauch, H., et al Infektionen der tiefen Atemwege Teil II. In: Mauch, H., Lüttiken, R., and S. Gatermann (eds.): MiQ - Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik, vol. 8. Urban & Fischer, Munich, Germany. 6. Sutton, D.A Specimen collection, transport, and processing: mycology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 7. Hazen, K.C New and emerging yeast pathogens. Clin. Microbiol. Rev. 8: MacFaddin, J. D Media for isolation-cultivation-identification- maintenance of medical bacteria, vol. 1, p Williams & Wilkins, Baltimore, MD. 9. Larone, D.H. 1995: Medically important fungi - a guide to identification. 3rd edition. ASM Press, Washington. 10. Atlas, R.M Handbook of Microbiological media. CRC Press, Boca Raton, FL. VERPACKUNG/LIEFERBARE PRODUKTE BBL Mycoslide Best.-Nr Objektträger WEITERE INFORMATIONEN Weitere Informationen erhalten Sie bei Ihrer örtlichen BD-Vertretung. BD Diagnostic Systems Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: , Fax: Reception_Germany@europe.bd.com DA

7 BD Diagnostic Systems Europe Becton Dickinson France SA 11 rue Aristide Bergès Le Pont de Claix/France Tel: Fax: BD, BD logo and BBL are trademarks of Becton, Dickinson and Company. Urotube and Mycoslide are trademarks of Becton Dickinson GmbH. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection Becton, Dickinson and Company LEITFADEN ZUR INTERPRETATION (Malzagar, Medium 1) Für die quantitative Bestimmung der Zellzahlen (siehe Abschnitt Ergebnisse und Interpretation bezüglich der klinisch signifikanten Zahlen) DA